轉(zhuǎn)GGCX基因治療兔骨性關(guān)節(jié)炎的體外實(shí)驗(yàn)研究*

汪文玉，付曉玲，陳 睿，陳偉高，吳建雄

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科 330006)

·論 著· doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.04.002

轉(zhuǎn)GGCX基因治療兔骨性關(guān)節(jié)炎的體外實(shí)驗(yàn)研究*

汪文玉，付曉玲△，陳 睿，陳偉高，吳建雄

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科 330006)

[摘要] 目的 探索GGCX基因?qū)ν霉切躁P(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞MMP13的影響及其在兔骨性關(guān)節(jié)炎軟骨退變中的作用。方法 取體質(zhì)量(2.0±0.2)kg日本大耳兔6只，隨機(jī)分為3組，每組設(shè)立一只對照兔，分別在2、4、6周使用膝前交叉韌帶切斷術(shù)構(gòu)建模型，6周后模型兔構(gòu)建成功，分離關(guān)節(jié)軟骨，經(jīng)消化分離后將軟骨細(xì)胞接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，將軟骨細(xì)胞分為空白組、陰性對照組(轉(zhuǎn)染不含GGCX基因慢病毒)、轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染含GGCX基因慢病毒)3組。轉(zhuǎn)染組則均以LipofectamineTM2000 為轉(zhuǎn)染媒介。用PCR法及蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測GGCX和MMP13的表達(dá)。結(jié)果 轉(zhuǎn)染組GGCX有較高的表達(dá)水平；轉(zhuǎn)染組MMP13的表達(dá)水平降低，且二者與空白組及陰性對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 GGCX基因過表達(dá)可明顯降低其軟骨細(xì)胞MMP13的表達(dá),為將基因治療運(yùn)用于體外骨性關(guān)節(jié)炎提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

軟骨,關(guān)節(jié)；骨關(guān)節(jié)炎；GGCX基因；基質(zhì)金屬蛋白酶13

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是最為常見的關(guān)節(jié)炎之一，尤以中老年發(fā)病最多[1]。骨關(guān)節(jié)炎的核心是關(guān)節(jié)面軟骨的退行性改變，會造成相應(yīng)的關(guān)節(jié)骨質(zhì)、關(guān)節(jié)囊、滑膜及關(guān)節(jié)的其他結(jié)構(gòu)的累及，為慢性、無菌性、進(jìn)行性侵犯關(guān)節(jié)的疾病，目前國內(nèi)外仍未見滿意的治療方法[2]。目前基因轉(zhuǎn)移技術(shù)已較為成熟，能作用于靶細(xì)胞使其表達(dá)軟骨生長調(diào)控因子，使之能夠有效促進(jìn)軟骨生長及基質(zhì)的合成[3]。近些年來，國內(nèi)外開始出現(xiàn)用基因來進(jìn)行基因治療的新方法，但使用γ-谷氨酰基羧化酶(GGCX)轉(zhuǎn)基因治療OA的實(shí)驗(yàn)研究并未見報道。本研究即通過觀察GGCX基因轉(zhuǎn)染的兔骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中MMP13的表達(dá)及其在OA治療中的作用，為OA基因治療方面提供新的思路及對策。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 3個月齡大小的健康雄性日本大耳白兔6只，體質(zhì)量約(2.0±0.2)kg，南昌龍平兔業(yè)有限公司提供。

1.2 主要材料與儀器 建立該模型手術(shù)所需的器械、藥品及材料均由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供，MMP13一抗抗體、免疫組織化學(xué)染色試劑盒均購自南昌中洪博元生物技術(shù)有限公司，免疫組織化學(xué)技術(shù)所需的設(shè)備與材料由南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供，GGCX慢病毒由上海市諾辰生物公司包裝并生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 模型動物制備 將兔隨機(jī)分為3組，每組2只，每組設(shè)立一只對照兔，不切斷前交叉韌帶，實(shí)驗(yàn)組剪除兔右膝毛，經(jīng)耳緣靜脈麻醉后清洗暴露出右膝皮膚，消毒行右膝前交叉韌帶切斷術(shù)，生理鹽水沖洗后給予切口縫合。實(shí)驗(yàn)肢體不固定，術(shù)后給予抗菌藥物預(yù)防感染，24～29 ℃環(huán)境下分別喂養(yǎng)2、4、6周后處死，觀察模型構(gòu)建情況。

1.3.2 軟骨細(xì)胞的培養(yǎng) 兔骨性關(guān)節(jié)炎模型構(gòu)建成功后，將實(shí)驗(yàn)兔子處死，對雙膝進(jìn)行消毒并將其完全離斷，用乙醇浸泡后將膝關(guān)節(jié)放入含有雙抗的二氨基聯(lián)苯胺(PBS)中；在超凈臺內(nèi)將關(guān)節(jié)軟骨面進(jìn)行分離并切取下軟骨，將軟骨剪碎成1 mm2大小，放入盛有消化酶的試管內(nèi)進(jìn)行消化；37 ℃恒溫水浴伴震蕩。45 min后取上清，離心收集細(xì)胞，重復(fù)4次；將細(xì)胞重懸于DMEM完全培養(yǎng)基中，按一定密度接種于培養(yǎng)瓶中，置于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔天換液；倒置顯微鏡觀察軟骨細(xì)胞融合成片，長滿大部分培養(yǎng)瓶壁后，進(jìn)行消化后傳代擴(kuò)增培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞從第3代開始出現(xiàn)去分化、纖維化現(xiàn)象，因此，在本次研究中，均選用培養(yǎng)的第一代骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.3 產(chǎn)生慢病毒顆粒 將GGCX-pSIH1-H1-copGFP質(zhì)粒與pPACKH1TM Lentivector Packaging 試劑盒按比例混合，應(yīng)用LipofectamineTM2000試劑共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。收集細(xì)胞上清液，按比例稀釋再感染新的293T細(xì)胞，檢測慢病毒的滴度。

1.3.4 慢病毒感染軟骨細(xì)胞 首先分為3組，空白組:不進(jìn)行轉(zhuǎn)染；陰性對照組：轉(zhuǎn)染不含GGCX的慢病毒；轉(zhuǎn)染組：轉(zhuǎn)染含有GGCX的慢病毒。將待轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞用含雙抗液(1×10 U/L)的D-hanks液漂洗，酶兩步消化法分離原代人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，然后接種于25 cm培養(yǎng)瓶內(nèi)(5 mL/瓶)，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁達(dá)85%～90%后加入0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA(1∶1)的消化液進(jìn)行傳代培養(yǎng)。接種處于對數(shù)生成長期的細(xì)胞到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔2×103個細(xì)胞，使用F-12+10%胎牛血清(FBS)的完全培養(yǎng)基，添加病毒液，37 ℃ 5% CO2的條件下正常培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染1 d后運(yùn)用顯微鏡對其進(jìn)行觀察，以判定轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染效率達(dá)90%之后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 PCR分析GGCX和MMP13 mRNA的表達(dá) 引物序列信息如表1。

表1 各基因PCR引物序列

將培養(yǎng)細(xì)胞消化、離心、棄上清，下層細(xì)胞加入生理鹽水后破碎，提取總 RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20 μL，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的條件：37 ℃ 1 h；95 ℃ 5 mim；滅活鼠白血病病毒(MMLV)。將逆轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,運(yùn)用自帶軟件ABI Prism 7500 SDS Software分析得到的結(jié)果。

1.3.6 Western blot 提取總蛋白,進(jìn)行蛋白定量，制備PAGE膠，進(jìn)行上樣及電泳，將膠緩慢移進(jìn)緩沖液，剪大小相同的硝酸纖維素膜(NC)，甲醇浸泡2 min，水洗3 min，最后用緩沖液平衡12 min。在恒流350 mA條件下，轉(zhuǎn)膜40 min。膜封閉，一、二抗孵育，最后進(jìn)行顯色檢測目的蛋白GGCX和MMP13的表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 兔OA模型構(gòu)建 實(shí)驗(yàn)兔6周后造模成功，如圖1可見兔膝關(guān)節(jié)滑膜增生，前交叉韌帶斷裂，關(guān)節(jié)間隙變窄，關(guān)節(jié)面變得毛糙，關(guān)節(jié)軟骨面有不同程度磨損。

A:轉(zhuǎn)染組切斷前交叉韌帶圖片;B:6周后兔OA模型圖片。

2.2 實(shí)時定量RT-PCR結(jié)果 轉(zhuǎn)染組GGCX表達(dá)水平較空白組、陰性對照組明顯升高；MMP13在轉(zhuǎn)染組中的表達(dá)水平較空白組及陰性對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，空白組和陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組中GGCX、MMP13 mRNA相對表達(dá)量

2.3 Western blot檢測結(jié)果 Western blot方法檢測各組中GGCX、MMP13的水平，運(yùn)用單因素方差分析法，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染組中GGCX水平明顯高于空白組及陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。空白組和陰性對照組相比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。轉(zhuǎn)染組中的MMP13水平與空白組及陰性對照組相比較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；空白組和陰性對照組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。各個組蛋白的表達(dá)結(jié)果與mRNA的表達(dá)水平相一致。

A：各組中不同蛋白的表達(dá)情況；B：GGCX在各組中的表達(dá)分析圖；C：MMP13在各組中的表達(dá)分析圖。

3 討 論

目前應(yīng)用病毒載體能夠成功地把基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，慢病毒載體有轉(zhuǎn)染率高、可轉(zhuǎn)染不分裂細(xì)胞、基因可長期表達(dá)等優(yōu)勢[4]，而且國外已有以慢病毒為載體的基因治療報道[5]?？色@得較高的效率， 從而縮短了臨床應(yīng)用的距離 。

羥化的基質(zhì)GLA蛋白(cMGP)是軟骨組織中鈣化的強(qiáng)烈抑制蛋白，能夠調(diào)節(jié)軟骨的鈣化和動脈的鈣化，GGCX為MGP羧基化過程中的關(guān)鍵酶，它的缺失能使cMGP減少，從而使之減弱對鈣離子晶體形成的抑制作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)正常膝關(guān)節(jié)和原發(fā)性膝關(guān)節(jié)OA的軟骨中均有GGCX表達(dá)，但骨性關(guān)節(jié)炎中GGCX明顯降低；而且GGCX的表達(dá)與關(guān)節(jié)軟骨的退變程度有關(guān)，隨著退變程度的加重，GGCX表達(dá)逐漸降低[7]，因此GGCX可以抑制OA的發(fā)生發(fā)展，本研究與文獻(xiàn)報道相符。

MMP 家族(MMPs)為一種重要酶類，在細(xì)胞外基質(zhì)的生理性和病理性降解過程中起重要作用[8]；MMP13為MMPs一員，可對各種膠原進(jìn)行有效降解，可分解膠原三螺旋結(jié)構(gòu)[9]。軟骨的退變主要由Ⅱ型膠原纖維降解引起，而MMP13也稱膠原酶13，其降解Ⅱ型膠原的能力是其他膠原酶的10～30倍[10]，并且其他許多MMPs亞型對Ⅱ型膠原的降解也需要通過它們起作用。并且Hamamura等[11]、Kneer等[12]研究發(fā)現(xiàn)MMP13在OA關(guān)節(jié)軟骨損害中起一定的作用，通過免疫組織化學(xué)方法檢測到MMP13在OA組織中存在高表達(dá)現(xiàn)象，且MMP13表達(dá)水平與OA的嚴(yán)重程度正相關(guān)。因此，MMP13具有促進(jìn)骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的作用。

但GGCX與MMP13之間是否具有相關(guān)性，其是否通過調(diào)節(jié)MMP13的表達(dá)來對OA的發(fā)生發(fā)展進(jìn)行調(diào)節(jié)國內(nèi)外未見相關(guān)文獻(xiàn)報道，本實(shí)驗(yàn)研究通過免疫組組織化學(xué)檢測轉(zhuǎn)染后兔軟骨細(xì)胞中GGCX及MMP13表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組中GGCX高表達(dá)，而轉(zhuǎn)染組MMP13出現(xiàn)低表達(dá)，與空白組及陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明GGCX基因成功轉(zhuǎn)染且轉(zhuǎn)GGCX基因的兔OA軟骨細(xì)胞中GGCX的高表達(dá)導(dǎo)致了MMP13的低表達(dá)。

綜上所述， 轉(zhuǎn)GGCX基因可明顯降低其軟骨細(xì)胞MMP-13的表達(dá)，且具有降低炎性因子的作用。達(dá)到治療兔OA的作用。為將基因治療運(yùn)用于體外OA提供了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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An in vitro study on rabbit osteoarthritis gene therapy with GGCX gene*

WangWenyu,FuXiaoling△,ChenRui,ChenWeigao，WuJianxiong

(DepartmentofOrthopaedics,theSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330006,China)

[Abstract] Objective To research the effect of GGCX gene on MMP13 in rabbit osteoarthritis cartilage cells and investigate its effect on osteoarthritis cartilage degeneration.Methods Six Japanese big ear rabbits weighted (2.0±0.2)kg were randomly divided into three groups,each group seted a rabbit as control. Anterior cruciate ligament transection method was used to build osteoarthritis cartilage degeneration model at second, forth,sixth week. Articular cartilage was separated successfully after the model were built,cartilage cells were divided from articular cartilage and cultured in 6-well cell culture plate. Cartilage cells were divided into blank group, negative control group and transfection group.PCR method and Western blot were conducted to detect GGCX and MMP13 expressed at the level of mRNA and protein.Results Compare with blank group and negative control group, the expressin level of GGCX incresed,while the MMP13 expression level dcresed(P<0.05).Conclusion Over expression of GGCX gene can obviously decrease the expression of MMP13，it provide experimental basis for osteoarthritis of the in vitro gene therapy.

cartilage,articular；osteoarthritis；GGCX gene；matrix metalloproteininases 13

國家自然基金資助項(xiàng)目(81301561)。 作者簡介：汪文玉(1987-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事骨與關(guān)節(jié)疾病的研究。△

，E-mail：417603614@qq.com。

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1671-8348(2017)04-0436-03

2016-09-18

2016-10-20)