風(fēng)濕痹痛方治療大鼠膠原性關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究*

梁 衛(wèi)梁 濤張麗玲沈家敏孫楚楚陳 曄紀(jì)永章△

（1.解放軍第四五四醫(yī)院，江蘇 南京 210002；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023）

·實(shí)驗(yàn)報告·

風(fēng)濕痹痛方治療大鼠膠原性關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究*

梁 衛(wèi)1梁 濤2張麗玲1沈家敏2孫楚楚2陳 曄1紀(jì)永章1△

（1.解放軍第四五四醫(yī)院，江蘇 南京 210002；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023）

目的 探討風(fēng)濕痹痛方對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療作用及其初步機(jī)制。方法 采用大鼠足部皮內(nèi)注射牛Ⅱ型膠原乳化劑，建立膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型（CIA），造模成功后設(shè)空白對照組、模型對照組、雷公藤多苷組（7.5 mg/kg）及風(fēng)濕痹痛方（9.5，19，38 g/kg）3個劑量組，連續(xù)給藥14 d。觀察風(fēng)濕痹痛方對CIA大鼠足腫脹的治療作用。ELISA法檢測血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、sFas、sFasL含量的變化；Western Blot法檢測CIA大鼠滑膜組織TNF-α、IL-1β、半胱氨酸蛋白酶-8（Caspase-8）和FLIP的表達(dá)。結(jié)果 造模14 d后，模型大鼠與正常對照組相比足腫脹明顯，風(fēng)濕痹痛方可明顯減輕CIA大鼠的足腫脹度。與模型組相比，風(fēng)濕痹痛方高劑量組大鼠血清中sFas、sFasL含量明顯降低 （P＜0.05）；大鼠滑膜組織Caspase-8表達(dá)含量顯著升高 （P＜0.05）。結(jié)論 風(fēng)濕痹痛方對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有免疫調(diào)節(jié)作用，其機(jī)制可能與提高Caspase-8的表達(dá)同時影響sFas/sFasL介導(dǎo)的滑膜細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，減少關(guān)節(jié)損傷有關(guān)。

膠原性關(guān)節(jié)炎 風(fēng)濕痹痛方 大鼠 細(xì)胞因子 凋亡

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一個以累及周圍關(guān)節(jié)為主的多系統(tǒng)性、炎癥性的自身免疫性疾病，表現(xiàn)為滑膜的炎性滲出、細(xì)胞浸潤、滑膜增生肥厚、血管翳形成、軟骨及骨組織的侵蝕，導(dǎo)致關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的破壞［1］。目前臨床治療以非甾體類抗炎藥、慢作用抗風(fēng)濕藥、免疫抑制劑為主［2］，雖有療效，但存在毒副作用多、復(fù)發(fā)率高等問題，所以本病的治療一直是困擾醫(yī)學(xué)界的難題之一［3］。中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合治療RA的優(yōu)越之處已日益顯現(xiàn)，研究中醫(yī)藥對RA的作用機(jī)理日益受到關(guān)注。本研究通過建立牛Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠模型（CIA），觀察風(fēng)濕痹痛方對膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠的治療作用，并初步探討其可能機(jī)制，進(jìn)一步為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量200～250 g，由揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。合格證：SCXK （蘇）2012-0004。

1.2 試劑與儀器 風(fēng)濕痹痛方（南京中醫(yī)藥大學(xué)提供，批號201601）；牛Ⅱ型膠原（Chondrex公司，批號20021）；雷公藤多苷片（江蘇美通制藥有限公司，批號150108）；弗氏完全佐劑（美國Sigma公司，批號SLBJ9001V）；冰乙酸（南京化學(xué)試劑有限公司，批號12011910106）；大鼠sFAS配體酶聯(lián)免疫分析試劑盒 （上海源葉生物科技有限公司，批號20160415）；大鼠sFAS酶聯(lián)免疫分析試劑盒 （上海源葉生物科技有限公司，批號20160415）；大鼠TNF-α酶聯(lián)免疫分析試劑盒（上海士鋒生物科技有限公司，批號20160105）；甲醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號20151216）；Caspase-8一抗 （武漢博士德生物工程有限公司，批號1731243）；TNF-α一抗 （武漢博士德生物工程有限公司，批號ZP333BP33）；FLIP一抗 （北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號20151228）；IL-1β一抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號20151228）。離心機(jī)（上海盧湘儀儀器有限公司）；電子天平（上海精科天美科學(xué)儀器有限公司）；搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek儀器有限公司）；電泳儀（美國Bio-Rad公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）

1.3 模型制備［4-5］取適量牛Ⅱ型膠原，加入0.1 mol/L的冰乙酸，4℃搖床震蕩過夜，質(zhì)量濃度為8 mg/mL，再按1∶1加入弗氏完全佐劑充分混合乳化，制成Ⅱ型膠原蛋白乳化劑，最終質(zhì)量濃度為4 mg/mL，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ⌒坌訵istar大鼠，右后足拓皮內(nèi)注射0.1 mL膠原蛋白乳化劑。同時，另設(shè)空白對照組，相同部位注射等量0.9%氯化鈉注射液。

1.4 分組及給藥 取造模成功Wistar大鼠50只，隨機(jī)分為5組：模型組、雷公藤多苷片組（7.5 mg/kg）、風(fēng)濕痹痛方低、中、高劑量組（9.5，19，38 g/kg）各10只。取注射0.9%氯化鈉注射液大鼠10只，作為空白對照。致炎第14天開始，各組灌胃給予相應(yīng)質(zhì)量濃度藥液，每天1次，連續(xù)給藥14 d。空白組和模型組給予等體積（10 mL/kg）0.9%氯化鈉注射液。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 1）足腫脹度測定［6］。分別檢測造模前和給藥后各組大鼠左后足腫脹程度，求出足腫脹度 （足腫脹度=給藥后足周長-造模前足周長）。2）ELISA法檢測血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、sFas、sFasL的含量。末次給藥后，各組大鼠10%水合氯醛3 mL/kg麻醉，固定，腹主動脈取血，以3000 r/min離心10 min，取血清，-20℃保存?zhèn)溆?。采用TNF-α、sFas、sFasL試劑盒測定其含量。3）Western Blot法檢測滑膜組織TNF-α、IL-1β、Caspase-8和FLIP的表達(dá)［7-8］。末次給藥后，各組大鼠10%水合氯醛3 mL/kg麻醉，取出滑膜組織，制備滑膜組織勻漿，提取組織蛋白。將蛋白進(jìn)行SDS-PAGE轉(zhuǎn)移至PVDF膜后，用5%脫脂奶粉室溫條件下?lián)u床上搖動封閉2 h。4℃孵育一抗過夜［IL-1β和FLIP以1∶500，TNF-α按1∶1000、半胱氨酸蛋白酶-8（Caspase-8）按1∶400，加入BCA稀釋］，洗滌3次，每次10 min，后將膜置于1∶10000稀釋的二抗稀釋液中，室溫振蕩孵育1~1.5 h。孵育結(jié)束后，漂洗濾膜3次，每次15 min。將膜置于凝膠成像系統(tǒng)曝光體系中，均勻滴加ECL混合液，曝光。采用凝膠成像系統(tǒng)軟件對顯影結(jié)果進(jìn)行分析，計算目的條帶相對表達(dá)量（相對表達(dá)量=目的條帶表達(dá)量/內(nèi)參表達(dá)量）。

2 結(jié) 果

2.1 風(fēng)濕痹痛方對CIA大鼠足腫脹度的影響 見表1。末次給藥后，檢測風(fēng)濕痹痛方對大鼠足腫脹度的影響。由表1可見，CIA大鼠各組足腫脹度與模型組相比具有降低趨勢，其中，風(fēng)濕痹痛方高劑量組和雷公藤多苷片組與模型組相比存在顯著性差異 （P＜0.05或P＜0.01）。提示風(fēng)濕痹痛方能改善大鼠足腫脹度。

表1 風(fēng)濕痹痛方對CIA大鼠足腫脹度的影響（cm，）

表1 風(fēng)濕痹痛方對CIA大鼠足腫脹度的影響（cm，）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

組別 n空白組 10模型組 10雷公藤多苷片組 10腫脹度0.14±0.05**0.78±0.09 0.38±0.19**風(fēng)濕痹痛方高劑量組 10 0.48±0.18*風(fēng)濕痹痛方中劑量組 10 0.60±0.14風(fēng)濕痹痛方低劑量組 10 0.63±0.24

2.2 風(fēng)濕痹痛方對CIA大鼠血清TNF-α、sFas、sFasL含量的影響 見表2。模型組大鼠血清中sFas、sFasL含量明顯高于正常對照組（P＜0.05），與模型組相比，雷公藤多苷片組和不同劑量風(fēng)濕痹痛方組大鼠血清中的sFas、sFasL含量均有降低趨勢，其中雷公藤多苷片組和風(fēng)濕痹痛方高劑量組sFas、sFasL含量明顯降低（P＜0.05）。與模型組相比，雷公藤多苷片組和不同劑量風(fēng)濕痹痛方組大鼠血清中的TNF-α均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。提示風(fēng)濕痹痛方通過調(diào)節(jié)sFas/sFasL含量促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而減輕關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)。

表2 風(fēng)濕痹痛方對CIA大鼠清細(xì)胞因子的影響（ng/L，）

表2 風(fēng)濕痹痛方對CIA大鼠清細(xì)胞因子的影響（ng/L，）

組別 n空白組 10模型組 10雷公藤多苷片組 10風(fēng)濕痹痛方高劑量組 10風(fēng)濕痹痛方中劑量組 10風(fēng)濕痹痛方低劑量組 10 sFas sFasl TNF-α 72.91±6.37*66.71±10.87*98.86±15.23 84.93±12.95 106.01±31.44 124.52±26.56 65.41±1.87*67.45±3.15*102.64±19.62 64.61±3.81**68.61±2.30*122.30±16.34 78.32±13.16 81.87±14.22 125.61±21.47 81.17±11.36 93.61±27.27 122.95±21.19

2.3 風(fēng)濕痹痛方對CIA大鼠滑膜組織TNF-α、IL-1β、caspas-8、FLIP表達(dá)的影響 見表3。與模型組相比，各組CIA大鼠滑膜組織TNF-α、IL-1β和FLIP表達(dá)含量無明顯差異 （P＞0.05）；Caspase-8的表達(dá)呈上升趨勢，其中風(fēng)濕痹痛方高劑量組、雷公藤多苷片組大鼠滑膜組織Caspase-8的含量較模型組顯著升高 （P＜0.05）。提示風(fēng)濕痹痛方能提高Caspase-8的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，減輕關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)。

表3 各組大鼠滑膜組織TNF-α、IL-1β、Caspas-8、FLIP表達(dá)的影響（）

表3 各組大鼠滑膜組織TNF-α、IL-1β、Caspas-8、FLIP表達(dá)的影響（）

組別 n空白組 10模型組 10雷公藤多苷片組 10風(fēng)濕痹痛方高劑量組 10風(fēng)濕痹痛方中劑量組 10風(fēng)濕痹痛方低劑量組 10 Caspase-8 TNF-α 1.06±0.15*1.29±0.17 0.24±0.18 1.30±0.93 0.70±0.09*1.15±0.30 0.83±0.20*1.34±0.40 0.63±0.18 0.67±0.38 0.30±0.14 0.98±0.22 IL-1β FLIP 0.58±0.24 0.72±0.14 0.63±0.22 0.82±0.29 1.74±0.85 0.79±0.14 1.68±0.63 0.91±0.32 1.54±0.56 0.74±0.26 0.78±0.15 0.76±0.15

3 討 論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”的范疇［9］，主要病機(jī)為肝腎虧虛、風(fēng)寒濕邪外侵、化毒內(nèi)郁、氣滯血瘀、痰瘀阻絡(luò)，我們針對這一病機(jī)特點(diǎn)擬制了風(fēng)濕痹痛方，具有祛風(fēng)散寒除濕、解毒化痰、行氣止痛、祛瘀通絡(luò)、補(bǔ)益肝腎的作用。前期臨床觀察發(fā)現(xiàn)風(fēng)濕痹痛方治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有較好的療效。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病，其顯著的病變以滑膜組織炎性細(xì)胞浸潤、滑膜細(xì)胞增生、關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨質(zhì)破壞為主要病理表現(xiàn)。目前已有多種動物模型用于RA的研究，但與RA免疫反應(yīng)和病理改變等方面最為相近的是膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）模型，此模型也是篩選和研究治療RA藥物的理想模型［10］。故本試驗(yàn)采用了牛Ⅱ型膠原誘導(dǎo)大鼠CIA模型來探討風(fēng)濕痹痛方治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的療效和部分作用機(jī)制。大鼠造模14 d后，開始出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎癥狀，表現(xiàn)為雙側(cè)后足拓部腫脹。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，風(fēng)濕痹痛方能明顯降低CIA大鼠的足腫脹度，對大鼠膠原性關(guān)節(jié)炎具有明顯抗炎消腫作用。

研究結(jié)果表明，滑膜組織滑膜細(xì)胞的持續(xù)活化和增生導(dǎo)致的關(guān)節(jié)損傷與Fas/FasL系統(tǒng)凋亡障礙有關(guān)［11-12］。細(xì)胞凋亡是一個影響免疫細(xì)胞和靶細(xì)胞的多步驟的復(fù)雜過程，需要多種細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外信號及多種基因產(chǎn)物的相互作用［13］，其中最主要的是有關(guān)Fas/ FasL凋亡系統(tǒng)的研究。sFas與FasL有很高的親和力，因其缺乏死亡區(qū)，不具備生物活性，可以通過與膜Fas竟?fàn)幗Y(jié)合FasL而抑制Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。sFasL同樣對Fas誘導(dǎo)的凋亡起抑制性調(diào)節(jié)［14］。Fas與FasL結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)復(fù)合物，與Caspase-8酶原的死亡區(qū)域結(jié)合，進(jìn)一步使Caspase-8前體蛋白活化為Caspase-8，啟動Caspase級聯(lián)反應(yīng)，激活下游Caspase-6、Caspase-7、Caspase-3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［15］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，風(fēng)濕痹痛方能上調(diào)Caspase-8的表達(dá)，明顯降低sFas、sFasL水平，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，減少滑膜炎癥，減輕關(guān)節(jié)損傷。

綜上所述，風(fēng)濕痹痛方對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有免疫調(diào)節(jié)作用，其機(jī)制可能與提高Caspase-8表達(dá)的同時影響sFas/sFasL介導(dǎo)的滑膜細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，減少關(guān)節(jié)損傷有關(guān)。

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Study on Fengshi Bitong Prescription in the Treatment of Rats with Collagen-induced Arthritis

LIANG Wei，LIANG Tao，ZHANG Liling，et al.

The Department of Traditional Chinese Medicine of No.454 Hospital of PLA，Jiangsu，Nanjing 210002，China.

Objective：To discuss the therapeutic effects and preliminary mechanism of Fengshi Bitong（FSBT）prescription on treatment of rheumatoid arthritis（RA）.Methods：Rats were given foot intradermal injection of bovine type collagen emulsion to establish collagen-induced arthritis（CIA）model.After successful modelling，they were randomly divided into 6 groups：normal control group；CIA model group；tripterygium glycosides group（7.5 mg/kg）；FSBT groups（9.5，19，38 g/kg），and were continuous administered for 14 days.The effect of FSBT on paw edema was observed.Serum levels of TNF-α，sFas，sFasL were detected by ELISA.Expression of TNF-α，IL-1β，caspase-8 and FLIP of CIA rats′synovial tissue were detected by Western Blot.Results：In model group，the paw edema was significant compared with normal control group，and FSBT could significantly reduce the paw edema.The serum levels of sFas，sFasL in FSBT high dose group（38 g/kg）were significantly decreased（P＜0.05）compared with CIA model group.Expression of caspase-8 was significantly increased（P＜0.05）.Conclusion：FSBT may have immune regulation effects on rheumatoid arthritis.Its mechanism may be related to increasing the expression of caspase-8 and affecting apoptosis of synovial cell，which is mediated by sFas/sFasL.

Collagen-induced arthritis；Fengshi Bitong prescription；Rats；Cytokine；Apoptosis

R285.5

A

1004-745X（2017）01-0083-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.01.025

2016-09-19）

解放軍第四五四醫(yī)院課題資助項(xiàng)目（12YY003）

△通信作者（電子郵箱：jyz454@sohu.com）