從微生態(tài)與心血管損傷關(guān)系探討清熱解毒化濁片對腸源性內(nèi)毒素血癥大鼠tPA與PAI-1的影響*

趙國榮戴玉微崔玉暉毛婭男陳研焰艾碧琛肖碧躍何宜榮

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，湖南 長沙 410208）

·研究報告·

從微生態(tài)與心血管損傷關(guān)系探討清熱解毒化濁片對腸源性內(nèi)毒素血癥大鼠tPA與PAI-1的影響*

趙國榮1△戴玉微1崔玉暉1毛婭男1陳研焰2艾碧琛1肖碧躍1何宜榮1

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，湖南 長沙 410208）

目的 從微生態(tài)與心血管損傷關(guān)系探討清熱解毒化濁片對心與動脈的影響。方法 70只SD大鼠隨機分為正常組和造模組，造模組采用高脂、酒精復(fù)合因素干預(yù)12周建立腸源性內(nèi)毒素血癥（IETM）大鼠模型。造模成功后，按隨機數(shù)列表法分為模型組、清熱解毒化濁片組。經(jīng)過4周治療后采血檢測內(nèi)毒素（LPS）水平，觀察心肌及主動脈組織病理變化，免疫組化法測定組織型纖溶酶原激活物 （tPA）、纖溶酶原激活物抑制劑（PAI）在心肌及主動脈組織中的表達。結(jié)果 1）與正常組比較，模型組血漿LPS明顯升高（P＜0.01）；心肌及主動脈組織PAI-1表達明顯升高（P＜0.01）、tPA明顯減低（P＜0.01）；2）與模型組比較，清熱解毒化濁片組，血漿LPS明顯降低（P＜0.01）；心肌組織tPA表達升高（P＜0.05），PAI-1表達明顯降低（P＜0.01）；主動脈組織tPA表達明顯升高（P＜0.01），PAI-1表達降低（P＜0.05）；光鏡下觀察，清熱解毒化濁片組大鼠心肌及主動脈炎性浸潤情況明顯改善。結(jié)論 清熱解毒化濁片可通過降低血漿LPS，協(xié)調(diào)tPA與PAI-1的平衡，保護腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致的心與動脈損傷。

清熱解毒化濁片 微生態(tài) IETM 心血管 tPA PAI-1

人體存在大量微生物群，它們散布在胃腸道、口腔、皮膚、泌尿道等部位，與其生存的微環(huán)境共同組成人體的微生態(tài)系統(tǒng)，而腸道是人體最主要和復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)。通過環(huán)境條件的相互作用，從物質(zhì)代謝、免疫調(diào)節(jié)、營養(yǎng)吸收和屏障作用等多方面影響人體。正常情況下，腸道菌群在腸道屏障和肝臟代謝下維持動態(tài)平衡，當肝臟受損使得腸道微生態(tài)發(fā)生失調(diào)，腸道菌種的改變會激活腸道的免疫系統(tǒng)，促進腸道的炎癥反應(yīng)，改變腸道黏膜的通透性，而菌群的代謝物，如致病菌的內(nèi)毒素進入血循環(huán)，對機體產(chǎn)生廣泛損傷。這種腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變和失衡對心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。清熱解毒化濁片為趙國榮教授創(chuàng)立，投入臨床多年證實治療病毒性免疫性肝損傷療效確切［1-3］，并且前期實驗表明［3-6］清熱解毒化濁片可以降低血漿內(nèi)毒素水平，調(diào)節(jié)肝細胞脂質(zhì)代謝，終止肝損傷的惡性循環(huán)，在對IETM肝肺損傷大鼠模型復(fù)制中也證實［6］其對肺臟也起到可保護作用。而清熱解毒化濁片是否對腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致的心肌與主動脈損傷也有保護作用尚未可知，因此本實驗以IETM大鼠為研究對象，觀察清熱解毒化濁片對大鼠心肌及主動脈tPA、PAI-1的表達及病理改變?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠70只，體質(zhì)量為（200± 10）g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。許可證號：SYXK（湘）2013-0005，合格證號：43004700007002。

1.2 試藥與儀器 清熱解毒化濁片由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供 （批號：20140605），52°紅星二鍋頭由北京紅星股份有限公司提供（批號：20140128），大鼠普通飼料及高脂飼料由湖南斯萊克景達實驗動物公司提供。高脂飼料配比［8］：77.5%基礎(chǔ)飼料+2%膽固醇+ 10%豬油+0.5%膽鹽+8%蛋黃粉+2%白糖。鱟試劑由上海潤成生物科技有限公司提供；tPA、PAI-1鼠抗體均由武漢博士德生物工程有限公司提供；通用型PV-9000試劑盒由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供；羅氏全自動分析儀，Motic B5顯微成像系統(tǒng)，石蠟切片機、攤片機。

1.3 模型制備 70只SD大鼠，隨機分為空白組10只和造模組60只。根據(jù)文獻［9-10］予高脂飼料喂養(yǎng)大鼠，同時每天按10 mL/kg劑量予52°二鍋頭灌胃1次，并每周稱大鼠體質(zhì)量，按照體質(zhì)量調(diào)整白酒劑量。以血液內(nèi)毒素（LPS）、心肌及主動脈組織病理切片判斷造模成功與否。

1.4 分組及給藥 將造模成功后的大鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組（10只）清熱解毒化濁片組（10只），清熱解毒化濁片組按0.081 g/mL灌胃，模型組及正常組給予等容積蒸餾水灌胃，每組動物灌胃量均為1 mL/ 100（g·d），持續(xù)時間為4周。

1.5 標本采集與檢測 末次給藥結(jié)束后，禁食不禁水12 h，麻醉后腹主動脈采血，取血漿檢測LPS含量。同時，迅速摘取心肌及主動脈組織，用10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，用HE染色，光鏡下觀察心肌及主動脈組織病理學(xué)改變；用免疫組化法檢測心肌及主動脈中tPA、PAI-1的表達。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件處理。計量資料以（）表示，滿足正態(tài)性者，組間比較采用單因素方差分析；不滿足正態(tài)性時選用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌及主動脈組織病理形態(tài)學(xué)比較

見圖1~圖2。心肌組織光鏡可見：正常組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)正常，未見變性、壞死炎細胞浸潤；模型組大鼠心肌細胞肥大、排列紊亂，出現(xiàn)炎性細胞浸潤、水腫；清熱解毒化濁片組大鼠心肌細胞排列較整齊，組織結(jié)構(gòu)較完整，炎性細胞浸潤不明顯。主動脈組織光鏡可見：正常組大鼠主動脈內(nèi)皮細胞完整，動脈壁內(nèi)膜光滑無增生，未見炎性細胞浸潤。模型組大鼠主動脈壁內(nèi)膜粗糙、增厚，內(nèi)皮細胞增生突出，出現(xiàn)炎性細胞浸潤。清熱解毒化濁片組主動脈壁內(nèi)略顯粗糙，炎性細胞浸潤不明顯。

圖1 各組心肌組織（HE染色，400倍）

圖2 各組主動脈組織（HE染色，400倍）

2.2 各組大鼠血漿LPS水平比較 見表1。LPS的檢測可以提示模型是否成功。從結(jié)果可知，與正常組比較，模型組具有顯著性差異（P＜0.01）。

2.3 各組大鼠tPA、PAI-1的表達比較 見表2，圖3~ 6。與正常組比較，模型組大鼠心肌、主動脈組織tP、PAI-1表達存在顯著性差異 （P＜0.01）。經(jīng)過治療后，與模型組比較，清熱解毒化濁片組心肌組織tPA表達升高（P＜0.05），PAI-1表達明顯降低（P＜0.01）；主動脈組織tPA表達明顯升高 （P＜0.01），PAI-1表達降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠LPS水平比較（）

表1 各組大鼠LPS水平比較（）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與正常組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別 n LPS（EU/mL）正常組 10模型組 10 0.033±0.006 0.045±0.006△化濁片組 100.035±0.009**

表2 各組大鼠心肌、主動脈組織tPA、PAI-1表達比較（）

表2 各組大鼠心肌、主動脈組織tPA、PAI-1表達比較（）

組別 時間 tPA PAI-1正常組 心 肌 0.329±0.025 0.242±0.016（n＝10） 主動脈 0.293±0.029 0.032±0.006模型組 心 肌 0.270±0.021△△0.315±0.037△△（n＝10） 主動脈 0.361±0.019△△0.045±0.006△△化濁片組 心 肌 0.309±0.022*0.253±0.033**（n＝10） 主動脈 0.302±0.031**0.035±0.009*

圖3 各組大鼠心肌組織PAI-1陽性表達觀察（免疫組化，400倍）

圖4 各組大鼠主動脈組織PAI-1陽性表達觀察（免疫組化，400倍）

圖5 各組大鼠心肌組織tPA陽性表達觀察（免疫組化，400倍）

圖6 各組大鼠主動脈組織tPA陽性表達觀察（免疫組化，400倍）

3 討 論

3.1 中醫(yī)心脾與西醫(yī)心腸生理上的關(guān)系 在現(xiàn)代研究中，中醫(yī)的脾胃功能與腸道菌群有著密不可分的關(guān)系。脾胃為氣血生化之源，胃主受納食物，脾主運化將水谷化為精微，把食物的消化吸收及精微的輸布全身，使得臟腑組織得到營養(yǎng)。正常的腸道菌群能夠參與膽汁酸的肝腸循環(huán)，幫助食物的消化吸收，起到營養(yǎng)作用，這即同于脾胃腐熟水谷并散精的功能。而且中醫(yī)的“脾胃”還包括大小腸功能，小腸主受盛化物和秘別清濁，大腸主傳化糟粕，大小腸的正常的運行需依靠脾胃臟腑氣機升降之樞紐。因此，大小腸是脾胃功能的進一步延伸，故腸道菌群雖部位在腸，功能屬脾胃。

關(guān)于中醫(yī)的心與西醫(yī)的心的認識，心是主血脈，全身的血，都在脈中運行，依靠心氣推動輸送全身發(fā)揮濡養(yǎng)作用；這與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的心臟認識有一致之處，心臟是血液循環(huán)的動力器官，在生命活動中，向器官、組織提供充足的血流量，以供氧和供能來維持細胞的正常代謝和功能。但中醫(yī)的心還包括主神志，也與心主血脈生理功能密切相關(guān)的，血液是神志活動的物質(zhì)基礎(chǔ)，如《靈樞·營衛(wèi)生會》說“血者，神氣也”。因此，可知中醫(yī)心的功能包含于西醫(yī)的心的功能。

中醫(yī)整體觀里，人體是一個互相聯(lián)系的整體，各臟腑之間關(guān)系緊密，生理上互相依賴，病理上互相影響。脾胃屬于中焦，心臟居于上焦，二者以隔為界，因經(jīng)脈相連，經(jīng)氣互通，并且脾胃屬土，心屬火，心為脾之母，脾為心之子，心與脾為母子關(guān)系，心病可傳脾，脾胃失調(diào)也可影響心，母病及子，子病及母。心主血主脈，脾主運化主統(tǒng)血，運化水谷輸布精微營養(yǎng)五臟，并能生血統(tǒng)血維持氣血的正常運行。由此可知，心脈氣血與脾的盛衰息息相關(guān)。

3.2 高脂、酒精飲食是IETM形成的物質(zhì)基礎(chǔ) 研究表明［11］，腸道菌群參加了宿主體內(nèi)糖、脂、蛋白質(zhì)等多種營養(yǎng)物的代謝，益于腸道消化，能夠調(diào)節(jié)宿主能量代謝及維護腸黏膜正常功能等。而宿主的生活方式、飲食結(jié)構(gòu)等因素的發(fā)生變化可以引發(fā)腸道菌群的結(jié)構(gòu)改變，使腸道內(nèi)毒素水平升高，并且長期食用高脂、酒精飲食會導(dǎo)致原發(fā)性肝臟損傷。因此，腸源性內(nèi)毒素在原發(fā)性肝損傷基礎(chǔ)上進入體循環(huán)形成IETM，引起促炎因子瀑布式釋放，在全身形成炎性反應(yīng)，從而使心、肝、肺重要臟器均受損害。

3.3 IETM引發(fā)的全身炎性反應(yīng)對心血管的影響 目前觀點認為［12-13］，動脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病，高脂飲食及伴隨的內(nèi)毒素血癥和血管內(nèi)免疫是重要的始動和影響因素之一。腸道菌群紊亂后腸道內(nèi)的內(nèi)毒素過多損傷腸黏膜屏障，并可能通過激活Toll樣受體信號傳導(dǎo)通路，產(chǎn)生TNF-α，IL-6等炎性細胞因子，減少內(nèi)皮細胞產(chǎn)生tPA，增加PAI-1的生成，形成內(nèi)皮功能障礙，從而影響動脈粥樣硬化的發(fā)生。另一方面，高脂肪、高膽固醇食物中富含卵磷脂、膽堿、肉堿等營養(yǎng)素，在通過對血漿心血管疾病相關(guān)因子篩查中發(fā)現(xiàn)［14］，與卵磷脂代謝相關(guān)的3種代謝產(chǎn)物膽堿、甜菜堿、氧化三甲胺（TMAO）與心血管疾病發(fā)生有密切聯(lián)系。組織纖溶酶原激活物tPA及其負調(diào)控因子PAI-1是人體的纖溶系統(tǒng)的重要構(gòu)成部分，二者之間的生理平衡對血流通暢起著重要調(diào)節(jié)作用。PAI-1水平的升高，能夠促進巨噬細胞釋放并且使得纖維蛋白在體內(nèi)沉積與低密度脂蛋白結(jié)合，刺激血管平滑肌細胞增生，這些都能促進動脈粥樣硬化斑塊形成。而導(dǎo)致受損的內(nèi)皮細胞中PAI-1過度表達與內(nèi)毒素和血脂升高密切相關(guān)。

3.4 清熱解毒化濁片通過降低內(nèi)毒素水平從而減輕心與動脈損傷 西醫(yī)學(xué)認為腸道菌群失調(diào)引發(fā)的內(nèi)毒素血癥與宿主的飲食結(jié)構(gòu)、生活方式等密切相關(guān)，而中醫(yī)學(xué)同樣認為，長期肥甘厚味或者貪杯飲酒，使得中焦脾胃運化失調(diào)，濕濁壅遏，蘊久生熱，熱積為毒。筆者前期研究［15-16］發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)的“毒”和西醫(yī)的“內(nèi)毒素”之間存在著密切相關(guān)性。西醫(yī)的“內(nèi)毒素”在人體泛濫可以引起全身炎性反應(yīng)綜合征，而中醫(yī)的濕熱濁毒的病變中心雖然在脾胃，但由于熱蒸濕動，濕熱邪氣出現(xiàn)蒸蒙上焦、郁阻中焦、流注下焦，使其病變范圍廣泛而病情復(fù)雜。對于濕熱濁毒證，中醫(yī)選用甘露消毒丹，治療以分消濕熱，清熱解毒。清熱解毒化濁片是從甘露消毒丹化裁而來，方中連翹輕清透達，黃芩苦寒清泄，兩者共清上焦熱毒；茵陳清利肝脾濕熱，石菖蒲、藿香、白豆蔻行氣化濕，悅脾和中，令氣暢濕行，四藥合而清暢中焦?jié)駸?；滑石、木通利濕化濁，使邪從小便而解。全方合清上、暢中、滲下三法，共奏清熱解毒，利濕化濁之功，使上中下三焦之邪得以分消。并且我們在前期研究［7］中發(fā)現(xiàn)，清熱解毒化濁片可以通過降低內(nèi)毒素水平，減輕IETM導(dǎo)致的肝肺損傷，再次佐證清熱解毒化濁片可以清除上中下三焦?jié)駸岫緷帷?/p>

綜上所述，本實驗結(jié)果顯示清熱解毒化濁片能夠降低內(nèi)毒素水平，促進tPA的表達，降低PAI-1的表達。清熱解毒化濁片治療腸道菌群所致的心肌及主動脈損傷的機制可能與降低內(nèi)毒素，協(xié)調(diào)纖溶系統(tǒng)tPA/ PAI-1之間動態(tài)平衡有關(guān)。

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Discussion on the Influence of Tablet Qingrejieduhuazhuo on tPA and PAI-1 in Rats with IETM from the Relation between Micro-ecology and Cardiovascular Damage

ZHAO Guorong，DAI Yuwei，CUI Yuhui，et al.
Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410208，China.

Objective：To discuss the influence of Tablet Qingrejieduhuazhuo on heart and arteries from the relation between micro-ecology and cardiovascular damage.Methods：70 SD rats were randomly divided into the normal group and the model group.Intestinal endotoxemia（IETM）rat models were established by intervention with high fat and alcohol composite factors for 12 weeks in the model group.The successful rat models were randomly divided into the model group and the Tablet Qingrejieduhuazhuo group.After 4 weeks of treatment，the endotoxin level was tested through blood sampling，the pathological changes in myocardium and aorta tissues were observed，the expression of tissue-type plasminogen activator（tPA）and plasminogen activator inhibitor（PAI）in myocardium and aorta tissues were measured by immunohistochemistry.Results：1）Compared with the normal group，plasma LPS increased significantly（P＜0.01）in the model group；expression of PAI-1 increased significantly（P＜0.01），and that of tPA decreased significantly（P＜0.01），in myocardium and aortic tissues；compared with the model group，plasma LPS decreased significantly（P＜0.01）in the Tablet Qingrejieduhuazhuo group；expression of tPA increased（P＜0.05），and that of PAI-1 decreased significantly（P＜0.01）in myocardial tissues；expression of tPA increased significantly（P＜0.01），and that of PAI-1 decreased（P＜0.05）in aortic tissues；2）The inflammatory invasion of myocardium and arteries in rats of the Tablet Qingrejieduhuazhuo improved significantly，observed under the light microscope.Conclusion：This study shows that Tablet Qingrejieduhuazhuo can protect myocardium and arteries damaged by flora disequilibrium in intestinal canal，by reducing plasma LPS and balancing tPA and PAI-1.

Tablet Qingrejieduhuazhuo；Micro-ecology；IETM；Cardiovascular；tPA；PAI-1

R285.5

A

1004-745X（2017）01-0046-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.01.013

2016-09-01）

湖南省教育廳重點項目資助（12A101）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥臨床基礎(chǔ)重點學(xué)科資助

△通信作者（電子郵箱：zhaoguorong1116@sina.com）