熄風(fēng)靜寧顆粒對(duì)Tourette綜合征模型大鼠腦紋狀體多巴胺D2受體和多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mRNA表達(dá)的影響*

李 燕王新征王俊宏孫 婷康珈寧

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院，北京 100700；2.北京市朝陽(yáng)區(qū)常營(yíng)社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，北京100024；3.河南省南陽(yáng)市中醫(yī)院，河南 南陽(yáng) 473003）

·研究報(bào)告·

熄風(fēng)靜寧顆粒對(duì)Tourette綜合征模型大鼠腦紋狀體多巴胺D2受體和多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mRNA表達(dá)的影響*

李 燕1王新征2王俊宏1孫 婷1康珈寧3

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院，北京 100700；2.北京市朝陽(yáng)區(qū)常營(yíng)社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，北京100024；3.河南省南陽(yáng)市中醫(yī)院，河南 南陽(yáng) 473003）

目的 觀察熄風(fēng)靜寧顆粒對(duì)Tourette綜合征（TS）模型大鼠腦紋狀體多巴胺D2受體（DRD2）和多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（DAT）mRNA表達(dá)的影響。方法 Wistar雄性大鼠36只隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、氟哌啶醇組、熄風(fēng)靜寧顆粒低劑量組、中劑量組、高劑量組，采用亞氨基二丙腈（IDPN）腹腔注射建立TS大鼠模型，造模后連續(xù)給藥6周，采用RT–PCR法檢測(cè)大鼠腦紋狀體中DRD2和DAT mRNA表達(dá)的情況。結(jié)果 IDPN誘導(dǎo)的模型大鼠的體質(zhì)量顯著低于正常大鼠（P＜0.01）；給藥前后熄風(fēng)靜寧顆粒中劑量組TS模型大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)與正常大鼠體質(zhì)量的增長(zhǎng)無(wú)差異；TS模型大鼠腦紋狀體DRD2 mRNA與正常組比較呈現(xiàn)高表達(dá)（P＜0.01）；熄風(fēng)靜寧顆粒中、高劑量組和氟哌啶醇可降低TS模型大鼠腦紋狀體DRD2 mRNA的表達(dá)（P＜0.05）；TS模型大鼠腦紋狀體DAT mRNA表達(dá)與正常組比較顯著增高（P＜0.01）；中藥顆粒高劑量組能夠降低TS模型大鼠腦紋狀體DAT mRNA的表達(dá)，但氟哌啶醇作用更明顯（P＜0.05）。結(jié)論 熄風(fēng)靜寧顆粒尚具有部分調(diào)節(jié)機(jī)體狀態(tài)的作用；Tourette綜合征存在多巴胺功能的亢進(jìn)，熄風(fēng)靜寧顆粒能夠通過(guò)降DRD2受體的敏感性，抑制多巴系統(tǒng)系統(tǒng)功能的亢進(jìn)而發(fā)揮藥物治療的作用。

熄風(fēng)靜寧顆粒 Tourette綜合征 多巴胺D2受體 多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

Tourette綜合征（TS）又稱多發(fā)性抽動(dòng)癥，或抽動(dòng)-穢語(yǔ)綜合征，是一種兒童時(shí)期起病，以頭面部、肢體或軀干的多發(fā)性肌肉抽動(dòng)和（或）發(fā)聲性抽動(dòng)為特征的精神障礙性疾病。目前TS研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)病機(jī)制與多巴胺D2受體（DRD2）密切相關(guān)［1-3］。TS患者存在DA釋放和攝取調(diào)節(jié)的異常［4-5］，而多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（DAT）是起調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵因素。臨床上熄風(fēng)靜寧顆粒治療TS具有療效顯著、副作用少的優(yōu)勢(shì)。探討熄風(fēng)靜寧顆粒對(duì)TS模型大鼠腦紋狀體DRD2和DAT mRNA的影響，明確其作用機(jī)制，對(duì)以后的臨床應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)意義?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠36只，清潔級(jí)，雄性，4周齡，體質(zhì)量80～100 g。購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2007-0001。分籠喂養(yǎng)，自由攝食飲水，溫度（22±2）℃，濕度50%～70%，通風(fēng)。

1.2 試藥與儀器 氟哌定喘片，2 mg/片，寧波大紅鷹藥業(yè)股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H33020585，生產(chǎn)批號(hào)：131003。熄風(fēng)靜寧中藥配方顆粒（辛夷花10 g，蒼耳子3 g，元參10 g，板藍(lán)根10 g，木瓜10 g，清半夏10 g，伸筋草20 g，鉤藤15 g，菊花15 g，白芍15 g，全蝎3 g，珍珠母30 g，酸棗仁30 g，炙甘草10 g），由北京康仁堂藥業(yè)有限公司制備。亞氨基二丙腈（IDPN）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；超純RNA提取試劑盒，批號(hào)CW0581；HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒，批號(hào)CW0744；SYBR Green PCR Mixtur，批號(hào) CW0957；Dnase 1，批號(hào)CW2090，以上均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物有限公司。熒光定量PCR儀，ABI7500；高速冷凍離心機(jī)，Hettich德國(guó)；電泳儀，北京六一儀器廠；電泳槽，北京六一儀器廠；凝膠成像儀，Tanon-6600天能公司；分光光度計(jì)，UV-2000上海尤尼柯公司；移液器（不同量程），Eppendorf。

1.3 分組與造模 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字法分為空白對(duì)照組、模型組、氟哌啶醇組、熄風(fēng)靜寧顆粒低、中、高劑量組，每組6只。除空白對(duì)照組外，其余5組小鼠腹腔注射IDPN，150 mg/kg，空白對(duì)照組腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液，每日1次，連續(xù)7 d。注射IDPN及干預(yù)治療15 min后開(kāi)始觀察大鼠行為活動(dòng)，包括：嗅、咬、舔（不包含理毛）、迅速移位、挖洞、急速跳躍等。由熟練掌握大鼠刻板行為并能準(zhǔn)確評(píng)分但不熟悉組別的實(shí)驗(yàn)人員每天觀察動(dòng)物行為并評(píng)分。評(píng)分≥1分可判定造模成功。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考Napier and Istre報(bào)道［6］。

1.4 干預(yù)措施 造模7 d后，正常對(duì)照組與模型組灌胃蒸餾水10 mL/kg，熄風(fēng)靜寧顆粒顆粒低、中、高劑量組分別按1.2、2.4、4.8 g/kg體質(zhì)量給予熄風(fēng)靜寧顆?；鞈乙海哙ご冀M按0.5 mg/kg體質(zhì)量給予氟哌啶醇混懸液，每天1次，各組均連續(xù)灌胃6周。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）體質(zhì)量測(cè)定。于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始第1天，及以后每7天為1個(gè)周期，測(cè)定大鼠的體質(zhì)量并記錄。2）標(biāo)本采集。處死前1天禁食，不禁水。末次給藥60 min后，3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，快速斷頭取腦，冰上剝離紋狀體，液氮速凍后迅速轉(zhuǎn)移至于-80℃冰箱凍存 （參照Paxinos和Watson鼠腦立體定位圖譜及李耀宇成年大鼠紋狀體三維結(jié)構(gòu)定位紋狀體）［7-8］。3）樣本檢測(cè)。引物設(shè)計(jì)：按NCBI primerblast和primer5.0進(jìn)行設(shè)計(jì)。目的基因RT-PCR檢測(cè)引物，引物序列見(jiàn)表1?？俁NA提?。河贸僐NA提取試劑盒提取腦組織樣本中總RNA，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，并進(jìn)行濃度測(cè)定，總RNA-80℃保存，防止降解。反轉(zhuǎn)錄：每樣本抽取2 μg的總RNA，用HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，合成的cDNA于-80℃冰箱保存。使用SYBR Green PCR Mixtur試劑盒，應(yīng)用ABI7500型實(shí)時(shí)檢測(cè)擴(kuò)增儀，通過(guò)兩步法PCR反應(yīng)程序?qū)崿F(xiàn)對(duì)mRNA的定量表達(dá)。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min，59℃復(fù)性和延伸60 s，95℃變性10 s，共45個(gè)循環(huán)。確認(rèn)溶解曲線和擴(kuò)增曲線，記錄每個(gè)基因的Ct值。運(yùn)用2-△△ct方法進(jìn)行相對(duì)定量分析，ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct管家基因）實(shí)驗(yàn)組-（Ct目的基因-Ct管家基因）對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)中DAT、DRD2引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18.0軟件包，計(jì)量資料以（）表示，正態(tài)分布。組間比較，采用單因素方差分析，方差齊，LSD檢驗(yàn)；方差不齊，Games-Howell檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠不同時(shí)期的體質(zhì)量比較 見(jiàn)表2。造模后初期與后期，各組TS模型大鼠體質(zhì)量與正常大鼠體質(zhì)量存在顯著差異（P＜0.01），隨著時(shí)間的推移這種現(xiàn)象不變。熄風(fēng)靜寧顆粒中劑量組大鼠體質(zhì)量的增長(zhǎng)與正常組體質(zhì)量的增長(zhǎng)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠不同時(shí)期的體質(zhì)量及增長(zhǎng)值比較（g，）

表2 各組大鼠不同時(shí)期的體質(zhì)量及增長(zhǎng)值比較（g，）

與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

組別 n正常組 6模型組 6氟哌啶醇組 6初始 造模后 給藥6周后 體質(zhì)量增長(zhǎng)值113.00±9.63 175.33±13.11 394.00±42.09 218.67±31.23 118.00±6.57 137.00±9.96**324.33±24.37**187.33±26.39*124.17±5.85 129.83±8.70**312.50±22.65**182.67±20.10*熄風(fēng)靜寧顆粒低劑量組 6 120.33±2.88 131.00±14.94**320.00±30.36**189.00±16.16*熄風(fēng)靜寧顆粒中劑量組 6 125.17±3.76 133.33±8.55**327.83±33.21**194.50±26.88熄風(fēng)靜寧顆粒高劑量組 6 117.00±6.66 117.17±8.09**303.17±19.04**186.00±20.22*

2.2 各組大鼠腦紋狀體DRD2 mRNA表達(dá)比較 見(jiàn)表3。模型組大鼠腦紋狀體DRD2 mRNA較正常組表達(dá)顯著增加（P＜0.01）；熄風(fēng)靜寧顆粒中、高劑量，和氟哌啶醇可降低DRD2 mRNA的表達(dá)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

表3 各組大鼠腦紋狀體DRD2 mRNA表達(dá)水平比較（）

表3 各組大鼠腦紋狀體DRD2 mRNA表達(dá)水平比較（）

與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。與氟哌啶醇組比較，▲P＜0.05。

組別 n正常組 6模型組 6氟哌啶醇組 6 DRD2 mRNA DAT mRNA 0.93±0.05 0.83±0.11 1.28±0.11**2.30±0.33**1.08±0.08△1.25±0.12**△△熄風(fēng)靜寧顆粒低劑量組 6 1.25±0.17*2.50±0.69**熄風(fēng)靜寧顆粒中劑量組 6 1.08±0.10△1.79±0.25**熄風(fēng)靜寧顆粒高劑量組 6 1.07±0.26△1.67±0.18**△▲

2.3 各組大鼠腦紋狀體DAT mRNA表達(dá)的影響 見(jiàn)表3。造模后各組TS模型大鼠DAT mRNA表達(dá)均較正常組增高（均P＜0.01）。熄風(fēng)靜寧顆粒高劑量組能夠降低TS模型大鼠腦紋狀體DAT mRNA的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但氟哌啶醇作用更明顯（P＜0.01），兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討 論

TS是兒童期常見(jiàn)的一種神經(jīng)精神障礙性疾病，男女發(fā)病比例為5∶1，國(guó)外學(xué)者報(bào)道［9］患病率為0.05%～3.0%不等。近年來(lái)，研究顯示TS有增多的趨勢(shì)，長(zhǎng)時(shí)間的抽動(dòng)發(fā)作可給患兒帶來(lái)嚴(yán)重的壓力及疲勞感，影響患兒的學(xué)習(xí)及生活，且部分患兒的病情可延續(xù)至成年，甚者還有部分患者抽動(dòng)癥狀可以持續(xù)一生，嚴(yán)重影響患者就業(yè)、生存等社會(huì)行為。TS發(fā)病機(jī)制研究普遍認(rèn)為與多巴胺系統(tǒng)的過(guò)度活躍有關(guān)，但是其確切的機(jī)制尚不清楚。

熄風(fēng)靜寧顆粒是我國(guó)著名中醫(yī)兒科專家劉弼臣教授治療TS的經(jīng)驗(yàn)方，主要由辛夷花、蒼耳子、玄參、板藍(lán)根、木瓜、法半夏、伸筋草、天麻、鉤藤、白芍、蟬蛻、僵蠶、全蝎等藥物組成。前期研究證實(shí)其具有改善TS模型大鼠刻板行為活動(dòng)及調(diào)節(jié)腦紋狀體多巴胺DA含量的作用。本實(shí)驗(yàn)在對(duì)大鼠體質(zhì)量觀察中發(fā)現(xiàn)，IDPN作為神經(jīng)毒素，可以影響大鼠體質(zhì)量的增長(zhǎng)。但是熄風(fēng)靜寧顆粒（中劑量）在發(fā)揮治療作用的同時(shí)，可以對(duì)抗這種毒副作用。這與前期研究，熄風(fēng)靜寧顆粒具有免疫調(diào)節(jié)的藥效學(xué)具有一致性［10］，推測(cè)熄風(fēng)靜寧顆粒尚具有部分調(diào)節(jié)機(jī)體的狀態(tài)的作用，有利于疾病的治療。這需要以后更深入的研究證實(shí)。

TS患者紋狀體內(nèi)多巴胺神經(jīng)過(guò)度支配或突觸后DRD2超敏感是目前公認(rèn)的TS發(fā)病的神經(jīng)生物化學(xué)因素。DA分別與紋狀體內(nèi)神經(jīng)元上的DRD1和DRD2結(jié)合，最終使大腦皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)區(qū)興奮或去抑制，而產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)［11］。目前多項(xiàng)研究證實(shí)TS患者腦內(nèi)DRD2受體的表達(dá)較正常人增高，如Yoon等［12］通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)TS患兒額部大腦皮層DRD2密度分布較正常兒童增高，Minzer等［13］也發(fā)現(xiàn)TS患者的前額皮質(zhì)DRD2的分布密度增加是正常對(duì)照組的1.4倍。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IDPN誘導(dǎo)TS模型大鼠腦紋狀體DRD2 mRNA表達(dá)較正常組顯著增加，與上述研究結(jié)論一致，提示TS模型大鼠腦內(nèi)存在DRD2數(shù)目上調(diào)，呈現(xiàn)DRD2超敏感狀態(tài)，與目前認(rèn)為的TS病理生理改變一致。IDPN是一種中樞神經(jīng)毒素，抽動(dòng)的造模機(jī)制主要是通過(guò)破壞了錐體外系的DA系統(tǒng)，產(chǎn)生持久的降低DA濃度的效應(yīng)，使動(dòng)物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)DA受體超敏現(xiàn)象，導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)刻板行為［14］，這一誘導(dǎo)機(jī)制在本實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證。氟哌啶醇是一種DRD2拮抗劑，是治療TS的代表性藥物，通過(guò)作用于DRD2受體，使DA不能與DRD2結(jié)合，從而降低DA神經(jīng)元的活性而抑制大腦皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)區(qū)的興奮性，緩解抽動(dòng)癥狀。本實(shí)驗(yàn)中氟哌啶醇和熄風(fēng)靜寧顆粒中、高劑量可降低TS模型大鼠腦紋狀體DRD2 mRNA的表達(dá)，證明了熄風(fēng)靜寧顆粒具有類似氟哌啶醇DRD2拮抗劑的作用，通過(guò)降低DRD2受體的敏感性，進(jìn)而調(diào)節(jié)多巴胺系統(tǒng)的功能，達(dá)到臨床治療的目的。

DAT是多巴胺神經(jīng)元末梢突觸前膜的膜蛋白，其功能是多巴胺神經(jīng)元發(fā)放神經(jīng)沖動(dòng)后，再攝取突觸間隙的DA，終止細(xì)胞間的信息傳導(dǎo)。DA總量的80%經(jīng)DAT轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，然后再釋放利用。DAT專一定位于多巴胺合成神經(jīng)元，被認(rèn)為是多巴胺能神經(jīng)元的獨(dú)特標(biāo)志，DAT的變化可以在一定程度上反映多巴胺系統(tǒng)的功能。Yoon［11］、Minzer［13］發(fā)現(xiàn)TS患者腦內(nèi)DRD2增高的同時(shí)，也存在DAT的增高。本研究發(fā)現(xiàn)造模后TS模型大鼠腦紋狀體DAT mRNA表達(dá)顯著增加，與上述研究結(jié)果一致，推測(cè)DAT表達(dá)增加的原因可能與TS患者體內(nèi)存在多巴胺系統(tǒng)功能的亢進(jìn)，引起突觸前膜多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體代償性升高有關(guān)。這一結(jié)果，支持TS多巴胺系統(tǒng)功能亢進(jìn)的發(fā)病理論。目前有研究發(fā)現(xiàn)氟哌啶醇能抑制紋狀體DAT基因表達(dá)［15-16］，在本實(shí)驗(yàn)中也得到證實(shí)，氟哌啶醇和高劑量熄風(fēng)靜寧顆粒降低了DAT mRNA的表達(dá)，而且氟哌啶醇作用更顯著。這種降低趨勢(shì)說(shuō)明了兩者在一定程度上抑制了TS多巴胺系統(tǒng)功能的亢進(jìn)，支持臨床療效的顯著性。

綜上所述，熄風(fēng)靜寧顆粒能夠通過(guò)降DRD2受體的敏感性，進(jìn)而抑制多巴胺系統(tǒng)功能的亢進(jìn)，發(fā)揮藥物的治療作用，為以后更廣泛的臨床應(yīng)用和開(kāi)發(fā)研究提供了依據(jù)。而且熄風(fēng)靜寧顆粒還尚具有部分調(diào)節(jié)機(jī)體狀態(tài)的作用，這有待以后更進(jìn)一步的研究證實(shí)。

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Effects of Xifeng Jingning Granule on Dopamine Receptor D2 and Dopamine Transporter mRNA Expression in Striatum of Tourette Syndrome Rat

LI Yan，WANG Xinzheng，WANG Junhong，et al.
Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China.

Objective：To investigate the mRNA expression of dopamine receptor D2（DRD2）and dopamine transporter（DAT）in rat brain striatum of tourette syndrome model.Methods：Male Wistar rats（n＝36）were randomly divided into 6 groups：control group，model group，haloperidol group，low-dose of Xifeng Jingning granule group，middle-dose of Xifeng Jingning granule group and high-dose of Xifeng Jingning granule group.The tourette syndrome model was established in rats by intraperitoneal injection of iminodipropionitrile（IDPN）.After modeling the rats were given medicines for 6 weeks.The mRNA expression of dopamine receptor D2（DRD2）and dopamine transporter（DAT）in rat brain striatum of Tourette Syndrome model were investigated by using real-time quantitative polymerase chain reaction（RT-PCR）.Results：The weight of tourette syndrome rats by intraperitoneal injection of iminodipropionitrile was significantly lower than normal rats（P＜0.01）.There was no difference on rat weight gain between middle-dose of Xifeng Jingning granule group and control group（P＞0.05）.Compared with control group，dopamine receptor D2 mRNA in striatum of tourette syndrome rats showed higher expression（P＜0.01）.Middle-dose，high-dose of Xifeng Jingning granule group and haloperidol group could reduce the expression of dopamine receptor D2 mRNA in tourette syndrome rat striatum （P＜0.05）.Compared with control group，dopamine transporter mRNA in tourette syndrome rat striatum showed higher expression（P＜0.01）.Dopamine transporter mRNA expression in tourette syndrome rat striatum in high-dose of Xifeng Jingning granule group and haloperidol group could get reduced，but more obviously in haloperidol group（P＜0.01）.Conclusion：Xifeng Jingning granule has a partial role in regulating body state；Tourette syndrome may induce overactivity ofdopamine system.The therapeutic effect of Xifeng Jingning granule can be implemented regulating the sensitivity of postsynaptic dopamine receptors，and then reducing overactivity of dopamine system.

Xifeng Jingning granule；Tourette Syndrome；Dopamine receptor D2；Dopamine Transporter

R285.5

A

1004-745X（2017）01-0023-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.01.007

2016-10-10）

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目（20120013120011）