杏葉總黃酮提取工藝及抗氧化性研究

李濟芳，李芳，金舒寧，柯可，王景雪，李晨

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

杏葉總黃酮提取工藝及抗氧化性研究

李濟芳，李芳，金舒寧，柯可，王景雪，李晨

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

以杏葉為材料，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，用正交試驗的方法優(yōu)化醇提法的提取工藝，得到最佳提取條件為：料液比1∶40（g/mL），溫度60℃，提取時間6 h，乙醇體積分數(shù)30%。在此條件下，杏葉總黃酮得率達23.98%。醇提物通過旋蒸純化，濃縮后溶入95%乙醇中得到純化杏葉黃酮。通過杏葉黃酮對DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基的清除抑制能力研究其抗氧化活性。結(jié)果表明，杏葉黃酮對DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基具有較高的清除抑制能力，且杏葉黃酮對自由基的清除能力均隨著其濃度增加而增加。當黃酮質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時，對DPPH自由基清除率為44.69%；當黃酮質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時，對羥自由基清除率為76.28%，對超氧陰離子自由基清除能力為84.75%。由此可知，杏葉黃酮具有較強的抗氧化活性。試驗結(jié)果可為植物源抗衰老食品添加劑的研究提供理論依據(jù)。

杏葉；總黃酮；醇提法；正交試驗；抗氧化

近年來，具有抗氧化作用的植物提取物逐漸引起了人們的廣泛重視。植物提取物具有安全、高效、穩(wěn)定、可控、無毒等優(yōu)點，因此，植物源的天然抗氧化劑也成為人們研究開發(fā)的重點。天然抗氧化劑能有效清除自由基從而保護機體健康，從植物中尋找高效、廉價、無毒的天然抗氧化劑成為目前抗氧化劑發(fā)展的一個必然趨勢。植物提取物中的黃酮類物質(zhì)不僅具有抑菌活性[1]，而且還具有良好的抗氧化和消除自由基的作用，對人體具有重要的生理保健功效[2]。因杏葉具有純天然、來源廣、價格經(jīng)濟等優(yōu)點，本試驗選用杏葉作為研究材料。

杏（Armeniaca vulgaris Lam.）的果核中含有豐富的苦杏仁苷，其對人體的免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤有良好的功效[3]。杏的種皮中含有較多黑色素，有良好的抗氧化功能[4]。杏果肉的黃酮提取物具有降血脂的功效，且在抗氧化試驗中，對DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基均有良好的清除作用[5-6]。但是對杏葉提取物卻未見研究報道。

本研究從杏葉中提取總黃酮，在單因素試驗的基礎(chǔ)上做正交試驗，確定了提取杏葉總黃酮的最佳提取條件后，用醇提法提取杏葉的黃酮類物質(zhì)，將黃酮類物質(zhì)旋蒸濃縮得到杏葉黃酮，檢測純化物黃酮含量，并進行其對DPPH自由基、羥基自由基及超氧陰離子自由基清除抑制能力的測定，評價其抗氧化活性，旨在為新的抗氧化植物源的研究開發(fā)利用以及為研發(fā)抗衰老的植物源食品添加劑提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

杏葉取材于山西大學(xué)校園內(nèi)，將植物葉子陰干，粉碎機粉碎后密封避光保存；蘆丁標準樣品；無水乙醇；95%乙醇；亞硝酸鈉；硝酸鋁；氫氧化鈉；DPPH；Vc標準品；硫酸亞鐵；Tris；鄰苯三酚；水楊酸；過氧化氫；鹽酸等化學(xué)試劑均為分析純。

DK-8D型電熱恒溫水槽，上海精宏試驗設(shè)備有限公司；UV-2000紫外分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司；Scout SE電子天平，奧豪斯儀器（常州）有限公司；GZX-9076MBE電熱鼓風干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HC-2066高速離心機，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；HC-150T2高速粉碎機，永康市綠可食品機械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總黃酮含量的測定[7]

1.2.1.1 蘆丁標準曲線的繪制稱取10.0 mg蘆丁，用95%乙醇完全溶解后定容至100 mL作為標準溶液。精密量取0，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mL標準溶液分別置于10 mL具塞試管中，用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定其吸光度值。其步驟為：分別加5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL，搖勻，放置6 min。再加10%硝酸鋁溶液0.5 mL，搖勻，放置6 min。最后加4%氫氧化鈉溶液4 mL，用95%乙醇定容至10 mL，搖勻，放置15 min。以相應(yīng)試劑為空白，于510 nm處測定不同濃度的蘆丁溶液吸光值。以蘆丁濃度為橫坐標、吸光度值A(chǔ)為縱坐標繪制蘆丁標準曲線。

1.2.1.2 樣品黃酮含量的測定取植物葉子粉末，根據(jù)設(shè)定的料液比、乙醇體積分數(shù)、溫度、水浴時間用醇提法進行提取，將醇提物離心，吸取上清液1.0 mL，置于10 mL具塞試管中，按標準曲線的操作方法測定吸光度值，以相應(yīng)濃度乙醇代替上清液為空白，待測液稀釋合適倍數(shù)，在510 nm處測定吸光度值，根據(jù)蘆丁標準曲線計算總黃酮含量。

1.2.2 醇提法提取總黃酮的工藝優(yōu)化

1.2.2.1 杏葉單因素試驗參考植物源黃酮提取的相關(guān)文獻[8-11]，確定出杏葉單因素試驗中各因素的水平（表1）。

表1 單因素試驗因素水平

根據(jù)表1的參數(shù)設(shè)置，按1.2.1.2的方法進行操作。根據(jù)總黃酮含量計算黃酮得率，確定杏葉提取的最佳條件范圍。

1.2.2.2 杏葉正交試驗根據(jù)1.2.2.1的試驗結(jié)果得出杏葉的最佳提取條件，在最佳條件的基礎(chǔ)上設(shè)計四因素三水平正交試驗，試驗設(shè)計列于表2，3次重復(fù)。

表2 正交試驗因素水平

1.2.3 杏葉總黃酮提取物的濃縮及初步純化將杏葉醇提法得到的總黃酮進行旋蒸，茄型瓶壁上固體用95%乙醇溶解。瓶中未被旋蒸干燥的物質(zhì)進行減壓過濾后在烘箱中干燥，干燥后的粉末用95%乙醇溶解，得到杏葉黃酮，并按1.2.1.2的操作方法在510 nm處測定吸光度值，計算得到的杏葉黃酮濃度，將制備好的杏葉黃酮放入錐形瓶中標記冷藏保存待用。

1.2.4 杏葉黃酮對DPPH自由基清除效果的測定

參考韋獻雅等[12]、張京芳等[13]的文獻，將DPPH自由基用95%乙醇配制成0.1 mmol/L溶液。在2 mL不同質(zhì)量濃度（0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL）杏葉黃酮樣品中分別加入2 mLDPPH自由基溶液，在暗處放置30 min，于517 nm處測定吸光度值（A樣品），對照以相同體積95%乙醇代替樣品測定吸光度值（A對照），清除自由基能力用SC表示，吸光度值用A表示。所有的吸光度值均測定3次，結(jié)果取平均值。計算公式如下。1.2.5杏葉黃酮對羥自由基清除能力的測定將杏葉黃酮稀釋成黃酮質(zhì)量濃度分別為0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mg/mL的乙醇溶液，在不同質(zhì)量濃度的1 mL樣品溶液中依次加入9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、30%過氧化氫各1 mL，靜置15 min，在510 nm處測定吸光度值（Ax），對照以相同體積蒸餾水代替樣品測定吸光度值（A0），本底值以相同體積蒸餾水代替30%H2O2測定吸光度值（Ax0）。清除自由基能力用SC表示[14]。計算公式如下。

1.2.6 杏葉黃酮對超氧陰離子自由基抑制能力的測定將杏葉黃酮稀釋成黃酮質(zhì)量濃度分別為0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mg/mL的乙醇溶液，在不同質(zhì)量濃度的1 mL樣品溶液中加入Tris-HCl溶液（pH值8.2）4.5mL、蒸餾水3.2mL，混勻后37℃預(yù)熱20 min，取出后立即加入預(yù)熱的3 mmol/L鄰苯三酚0.5 mL，迅速搖勻后于波長320 nm處每隔30 s測吸光度，計算線性變化范圍內(nèi)吸光度增加值（ΔAx），對照以相同體積蒸餾水代替樣品測定吸光度值（ΔA0），清除自由基能力用SC表示[15-16]。計算公式如下。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標準曲線的繪制

按1.2.1.1方法測定不同質(zhì)量濃度的蘆丁吸光度（A），以吸光度值為縱坐標Y，蘆丁標準品質(zhì)量濃度X為橫坐標，進行線性回歸繪制標準曲線。

從圖1可以看出，在510 nm處得到回歸方程為y＝0.744 3x-0.002 9（R2＝0.999 4）。

2.2 杏葉總黃酮提取單因素試驗結(jié)果

按照試驗方法1.2.2.1杏葉總黃酮提取單因素預(yù)試驗的設(shè)計，提取杏葉總黃酮，結(jié)果列于表3。

表3 杏葉總黃酮提取單因素各水平的總黃酮含量%

從表3可以看出，杏葉總黃酮較適宜的提取條件為：料液比1∶30（g/mL），溫度80℃，時間6 h，乙醇體積分數(shù)40%。

2.3 杏葉總黃酮提取正交試驗結(jié)果

醇提法提取植物黃酮類物質(zhì)的影響因素較多，綜合考慮了各種影響因素，經(jīng)過提取時間、乙醇體積分數(shù)、溫度以及料液比等單因素試驗確定杏葉總黃酮提取的最佳提取條件后，采用L9（34）正交表做正交試驗，結(jié)果如表4所示。

表4 L9（34）正交試驗設(shè)計及總黃酮得率

對表4試驗結(jié)果進行方差分析，結(jié)果如表5所示。由表5可知，重復(fù)間方差不顯著，處理間方差均達到極顯著。說明該試驗設(shè)計合理，結(jié)果可靠，各處理因素均對杏葉總黃酮提取率有極顯著影響。

根據(jù)極差分析結(jié)果（表4）可知，影響杏葉總黃酮提取率的因素依次為C＞A＞D＞B，即水浴時間＞料液比＞乙醇體積分數(shù)＞水浴溫度，最佳提取工藝為A3B1C3D1，即料液比1∶40（g/mL），溫度60℃，時間6 h，乙醇體積分數(shù)30%。在此工藝水平下，杏葉總黃酮平均提取率可以達到23.98%。

表5 正交試驗結(jié)果方差分析

2.4 杏葉黃酮對DPPH自由基的清除效果

得到杏葉總黃酮溶液后，按照試驗方法1.2.3對杏葉總黃酮進行了濃縮和初步純化得到杏葉黃酮。按照1.2.4試驗方法測定杏葉黃酮對DPPH自由基的清除效果。由圖2可知，杏葉黃酮對DPPH自由基清除能力隨黃酮質(zhì)量濃度增加而增加，在0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，清除率由3.74%上升至44.69%。以Vc為參照，在黃酮質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時，計算得到杏葉黃酮對DPPH自由基清除能力為Vc的47.69%，由此可知，杏葉黃酮具有較強的DPPH自由基清除能力。

2.5 杏葉黃酮對羥基自由基的清除效果

根據(jù)1.2.5試驗方法測定杏葉黃酮對羥基自由基的清除效果，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，杏葉黃酮的羥基自由基清除能力隨黃酮質(zhì)量濃度增加而增加，在0.1～0.8 mg/mL范圍內(nèi)，清除率由38.62%上升至76.28%。以Vc為參照，在黃酮質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時，計算得出杏葉黃酮的羥基自由基清除能力為Vc的76.28%，可知杏葉黃酮具有強的羥基自由基清除能力。

2.6 杏葉黃酮對超氧陰離子自由基的清除效果

根據(jù)1.2.6試驗方法測定杏葉黃酮對超氧陰離子自由基的清除效果。從圖4可以看出，杏葉黃酮對超氧陰離子自由基清除能力隨黃酮質(zhì)量濃度的增加而增加，在0.1～0.8 mg/mL范圍內(nèi)，清除率由27.12%上升至84.75%。以蘆丁為參照，在黃酮質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時，計算得出杏葉黃酮對超氧陰離子自由基清除能力為蘆丁的142.86%，可知杏葉黃酮具有很強的超氧陰離子自由基清除能力。

3 討論

本試驗以杏葉為提取原料，采用醇提法提取杏葉的總黃酮，確定了提取工藝的最佳條件，即料液比1∶40（g/mL），溫度60℃，提取時間6 h，乙醇體積分數(shù)30%；利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方法對粗提物進行了濃縮和初步純化。并對杏葉黃酮進行了體外抗氧化活性測定，證明杏葉黃酮具有較強的DPPH自由基清除能力、強的羥基自由基清除能力和很強的超氧陰離子自由基抑制能力，且杏葉黃酮對自由基的清除能力均隨濃度增加而增加。在0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，杏葉黃酮對DPPH自由基清除率由3.74%上升至44.69%，對DPPH自由基清除能力的最高為Vc的47.69%；杏葉黃酮質(zhì)量濃度在0.1～0.8 mg/mL范圍內(nèi)，對羥基自由基清除能力由38.62%上升至76.28%，對羥基自由基清除能力的最高為Vc的76.28%；對超氧陰離子自由基清除能力由27.12%上升至84.75%，且對超氧陰離子自由基清除能力的最高為蘆丁的142.86%。由此可確定，杏葉提取物中含有較為豐富的黃酮類物質(zhì)，并且其具有較強的體外抗氧化活性。

杏葉目前在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中是作為廢料被丟棄的，每年有大量的杏葉遺留在田間，若能加以利用，無疑將會為農(nóng)民帶來一定的額外收益。本試驗結(jié)果顯示，杏葉經(jīng)過簡單的提取加工將會得到抗氧化效果較好的杏葉黃酮，杏葉黃酮可以進一步制作成食品添加劑及保健品。這一研究結(jié)果，為杏葉制品的進一步研發(fā)提供了理論依據(jù)，同時也能夠把杏葉變廢為寶，符合國家低碳環(huán)保建設(shè)的要求，不僅具有學(xué)術(shù)研究意義，而且也具有生產(chǎn)實踐意義。

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Study on Extraction Process and Antioxidative Activity of Total Flavonoids from Apricot（Armeniaca vulgarisLam）Leaves

LI Jifang，LI Fang，JINShuning，KE Ke，WANGJingxue，LI Chen
（College ofLife Science，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

Based on the single factor experiments,the orthogonal texts were employed to optimize the extraction conditions of flavonoids from Armeniaca vulgaris Lam leaves.The results of optimal extraction conditions were material-liquid ratio of 1∶40（g/mL）, extraction temperature of60℃,extraction time of6 hours and ethanol concentration of30%.Under the optimal conditions,the maximum extraction rate oftotal flavonoids was 23.98%.The alcohol extracts were purified byrotaryevaporation and re-dissolution in 95%ethanol. The results of antioxidation experiments showed that the purified total flavonoids of apricot leaves had strong scavenging capacity on DPPH·,·OH and O2-which increased in a dose-dependent manner.When the total flavonoid concentration was 1.0 mg/mL,the scavenging capacity against DPPH·was 44.69%.When the total flavonoid concentration was 0.8 mg/mL,the scavenging capacity against·OH and O2-was 76.28%,84.75%,respectively.Accordingly,the purified total flavonoids ofapricot leaves had strong antioxidant activity.And the results can provide a theoretical basis for the studyofplant-derived anti-agingfood additives.

apricot leaves;total flavonoids;ethanol extraction;orthogonal test;antioxidant activity

TQ914.1

A文獻標識碼：1002-2481（2017）02-0258-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.02.29

2016-10-11

山西大學(xué)第十三期本科生科研訓(xùn)練項目

李濟芳（1995-），女，山西大同人，在讀本科，研究方向：植物生物技術(shù)。王景雪為通信作者。