氣體信號(hào)分子H2S對(duì)擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育的影響

岳斌，裴雁曦，劉旦梅，劉志強(qiáng)

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

氣體信號(hào)分子H2S對(duì)擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育的影響

岳斌，裴雁曦，劉旦梅，劉志強(qiáng)

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

硫化氫（H2S）是繼一氧化氮和一氧化碳之后的第3種氣體信號(hào)分子。對(duì)于H2S調(diào)節(jié)植物脅迫響應(yīng)的研究已經(jīng)有大量的報(bào)道，而H2S在植物發(fā)育過(guò)程中的影響還有待研究。以NaHS作為外源H2S供體，觀察其對(duì)野生型擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育的影響。結(jié)果表明，H2S可延緩擬南芥抽薹，提高葉綠素含量、凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（T）、氣孔導(dǎo)度（G），降低細(xì)胞間隙CO2濃度（C）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR和半定量PCR結(jié)果表明，H2S可提高擬南芥光合作用相關(guān)基因Rubicso，RCA，LHCB3，LHCB2，GPD的表達(dá)量。外源生理濃度H2S可提高擬南芥光合性能，延緩抽薹時(shí)間。

硫化氫；擬南芥；光合作用

硫化氫（Hydrogen sulfide，H2S）氣體無(wú)色有臭雞蛋氣味，分子量小可以自由穿過(guò)細(xì)胞膜，其身份已經(jīng)從早期的毒性氣體轉(zhuǎn)變?yōu)闅怏w信號(hào)分子。H2S自1996年經(jīng)ABE等[1]首次證明作為一種神經(jīng)活性物質(zhì)存在于人體，其生理調(diào)節(jié)作用逐漸為人們所重視。2001年，ZHAO等[2]測(cè)定H2S在動(dòng)物血管組織中的含量約為（45.6±14.2）μmol/L，并發(fā)現(xiàn)其具有調(diào)節(jié)K+-ATP通道的功能。YANG等[3]在《Science》發(fā)表論文，證明H2S可在動(dòng)物體內(nèi)內(nèi)源產(chǎn)生，可以調(diào)節(jié)血管舒張。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，H2S可促進(jìn)人體角質(zhì)細(xì)胞的增殖和分化[4]。

H2S在植物體內(nèi)同樣可內(nèi)源產(chǎn)生[5-7]，可有效緩解逆境及重金屬等對(duì)植物造成的傷害[8-10]。在菠菜儲(chǔ)存過(guò)程中，H2S可提高其抗氧化能力[11]。在香蕉冷藏過(guò)程中，H2S可降低MDA含量，增強(qiáng)其能量代謝過(guò)程中H+-ATPase，Ca2+-ATPase，琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C氧化酶的活力[12]。2016年，裴雁曦[13]對(duì)H2S在植物體的信號(hào)分子功能進(jìn)行了較為詳細(xì)的介紹。

綠色植物通過(guò)光合作用同化CO2和H2O，制造有機(jī)物并釋放O2，這是植物自身生長(zhǎng)發(fā)育，也是整個(gè)生物界賴以生存的基礎(chǔ)。在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，光合作用效率是植物生產(chǎn)力和作物產(chǎn)量高低的根本決定因素[14]。研究表明，楊樹(shù)的苗木生長(zhǎng)量，特別是苗高與凈光合作用速率聯(lián)系密切[15]。植物的光合能力受自身葉片結(jié)構(gòu)特征與生化組成，以及外界環(huán)境因素的影響[16-17]；紅藍(lán)比3∶1的LED光源補(bǔ)光處理可顯著提高草莓葉綠素a的含量[18]；在干旱脅迫下沙棘葉片可通過(guò)增加天線色素的熱耗散，增強(qiáng)抗氧化酶活性，穩(wěn)定光合作用系統(tǒng)的功能[19]；干旱脅迫會(huì)使小麥和糜子的凈光合速率降低[20-21]；小麥揚(yáng)花期和灌漿期的光合速率隨著水分的減少而呈降低趨勢(shì)[22]；寧夏枸杞葉片的凈光合作用速率隨氣溫升高而降低[23]。

H2S作為氣體信號(hào)分子，可增強(qiáng)植物生物和非生物抗逆性。本研究以NaHS作為外源H2S供體，觀察其對(duì)野生型擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育的影響，旨在為H2S調(diào)節(jié)植物生理功能提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料培養(yǎng)及處理

試驗(yàn)材料為野生型擬南芥（Col-0）。種子春化后播種在等體積土與蛭石組成的混合基質(zhì)中，培養(yǎng)條件為溫度23℃，相對(duì)濕度60%，光照強(qiáng)度3 000 lx，光周期16/8 h（晝/夜），長(zhǎng)出真葉后進(jìn)行處理。NaHS處理濃度分別為50，100μmo/L（每天熏蒸6h）。不施加NaHS的野生型擬南芥為對(duì)照組（CK）。

1.2 表型及生理指標(biāo)的測(cè)定

以NaHS作為外源H2S供體處理擬南芥，每3 d對(duì)植株的葉長(zhǎng)、葉寬、葉片數(shù)目及株高測(cè)量一次，并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

對(duì)處理17，24，31 d的植株進(jìn)行葉片氣體交換參數(shù)和葉綠素含量的測(cè)定。凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（E）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、細(xì)胞間隙CO2濃度（C）使用CB-1102便攜式光合蒸騰儀（北京雅欣理儀科技有限公司）進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定時(shí)需光源充足且穩(wěn)定，空氣中CO2含量穩(wěn)定。

葉綠素含量測(cè)定：取新鮮植物葉片樣品0.1 g，放入研缽中，加少量石英砂及2 mL 95%乙醇，研成勻漿，3000r/min，離心1min。取上清稀釋至20mL。利用紫外分光光度計(jì)測(cè)665，649 nm處的吸光值，分別以A665和A649表示。

其中，Ca為葉綠素a的濃度，Cb為葉素素b的濃度，CT為葉綠素總濃度。

所測(cè)葉片的葉綠素含量計(jì)算公式如下。

其中，V為提取液總量（mL），W為樣品質(zhì)量（g）。

1.3 基因表達(dá)檢測(cè)

擬南芥幼苗總RNA提取及基因表達(dá)檢測(cè)參考Jin等[24]的方法，分別用半定量PCR和qRT-PCR檢測(cè)光合基因表達(dá)量（引物如表1所示），以UBQ為內(nèi)參，qRT-PCR數(shù)據(jù)采集與分析使用IQ5軟件。

表1 引物

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)使用SPSS13軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 H2S對(duì)擬南芥表型的影響

葉片是綠色植物進(jìn)行光合作用的主要器官，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，H2S處理過(guò)的擬南芥與對(duì)照組相比，在葉片的長(zhǎng)度（圖1-A）、寬度（圖1-B）和葉片數(shù)目（圖1-C）上沒(méi)有顯著變化。觀察發(fā)現(xiàn)，H2S處理延緩了擬南芥的抽薹時(shí)間，造成植株高度差異（圖1-D），但H2S對(duì)抽薹后的植株高度沒(méi)有顯著影響。

2.2 H2S對(duì)擬南芥光合作用效率的影響

光合作用是自然界碳-氧平衡的重要媒介，是植物補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要過(guò)程。凈光合速率是凈光合作用產(chǎn)生糖類的速率。蒸騰速率能反映植物在一定時(shí)間內(nèi)單位葉面積蒸騰的水量。氣孔導(dǎo)度對(duì)蒸騰速率有著直接的影響。胞間CO2濃度受到氣孔導(dǎo)度、葉肉細(xì)胞光合活性的影響。分別測(cè)定H2S處理17，24，31 d的擬南芥及對(duì)照組的4種光合效率指標(biāo)。與對(duì)照組相比，處理24，31 d的擬南芥凈光合作用速率升高（圖2-A）。施加H2S處理17，31 d的擬南芥蒸騰速率（圖2-B）、葉片氣孔導(dǎo)度（圖2-C）均顯著高于對(duì)照組。施加H2S處理17，31 d的胞間CO2濃度（圖2-D）顯著低于對(duì)照組。

2.3 H2S對(duì)擬南芥葉綠素含量的影響

葉片內(nèi)的色素可調(diào)節(jié)光能的捕獲和傳遞。葉綠素是光合作用的基礎(chǔ)，擬南芥光合效率的變化與葉綠素含量變化聯(lián)系緊密。H2S處理24 d的擬南芥葉綠素含量顯著高于對(duì)照組（圖3）。

2.4 H2S對(duì)擬南芥光合基因表達(dá)量的影響

光合性能的調(diào)節(jié)與光合基因的表達(dá)量息息相關(guān)。核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶（ribulose-bisphosphate carboxylase/oxygenase，Rubicso），核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶激活酶（rubicsoactivase，RCA）和光合系統(tǒng)Ⅱ葉綠素結(jié)合蛋白LHCB3，LHCB2及NADP依賴的三磷酸甘油醛脫氫酶（NADP-dependentglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GPD）作為光系統(tǒng)結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白對(duì)植物光合碳同化起重要作用。Rubicso是光合作用C3反應(yīng)中重要的羧化酶，也是光呼吸中不可缺少的加氧酶。鈍化態(tài)Rubisco必須經(jīng)過(guò)RCA的活化才能表現(xiàn)出其羧化/加氧活性。光合系統(tǒng)Ⅱ葉綠素結(jié)合蛋白可吸收光能及傳遞光能到作用中心。三磷酸甘油醛脫氫酶催化3-磷酸甘油醛氧化（脫氫）和磷酸化，生成1，3-二磷酸甘油酸，是糖代謝的中心環(huán)節(jié)。對(duì)不同處理的擬南芥植株進(jìn)行qRT-PCR和半定量PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，施加H2S處理后的擬南芥植株內(nèi)光合基因Rubicso，RCA，LHCB3，LHCB2和GPD的表達(dá)量升高（圖4）。

3 討論與結(jié)論

擬南芥發(fā)育過(guò)程中，葉片長(zhǎng)度、寬度、植株所含葉數(shù)及高度的變化與其所處的環(huán)境息息相關(guān)。H2S可以提高銅離子脅迫下小麥種子發(fā)芽率以及根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)[25]。在本試驗(yàn)中，經(jīng)由H2S處理的擬南芥植株的葉片長(zhǎng)度、寬度及葉片數(shù)目與對(duì)照相比無(wú)明顯變化；植株高度低于不施加H2S處理的對(duì)照組，即H2S處理的擬南芥植株與對(duì)照組相比，抽薹時(shí)間得到延緩。幼苗在適宜的生長(zhǎng)條件下，由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)為生殖生長(zhǎng)，花芽分化后，花莖迅速發(fā)育開(kāi)始抽薹[26]。當(dāng)水分、肥料、溫度等環(huán)境條件優(yōu)越時(shí)，植株的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)占優(yōu)勢(shì)，生殖生長(zhǎng)進(jìn)程就相應(yīng)推遲[27]。在本試驗(yàn)中，H2S處理的擬南芥植株光合作用效率高于對(duì)照組，獲得更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以滿足植物生長(zhǎng)的需要，從而使擬南芥在生長(zhǎng)過(guò)程中偏離了正常的生長(zhǎng)周期，抽薹時(shí)間得到延緩。

植物對(duì)光的吸收能力與光合作用效率密切相關(guān)，導(dǎo)致凈光合速率上升的原因主要有氣孔因素和非氣孔因素2種[28]，氣孔因素包括氣孔數(shù)量、氣孔孔徑、氣孔開(kāi)度等，非氣孔因素包括細(xì)胞內(nèi)部酶活性和光合組分等。氣孔是植物葉片與外界進(jìn)行氣體交換的主要通道。通過(guò)氣孔擴(kuò)散的氣體有O2，CO2。外源H2S處理可通過(guò)提高氣孔開(kāi)度增強(qiáng)水稻的光合作用[29]。H2S供體NaHS能增加菠菜（Spinaciaoleracea）葉片葉綠素含量、可溶性蛋白和生物量，并能改變?nèi)~綠體超微結(jié)構(gòu)和提高光合速率[30]。本試驗(yàn)中，H2S處理后植株的凈光合作用速率、蒸騰速率及葉片氣孔導(dǎo)度得到提高。本試驗(yàn)中凈光合速率和蒸騰速率的提高表明H2S處理可增強(qiáng)光合速率與蒸騰速率，使得植株合理分配光合產(chǎn)物。在測(cè)量過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，H2S處理后擬南芥植株胞間CO2濃度并不總低于對(duì)照組，推測(cè)葉肉細(xì)胞光合性能提高使胞間CO2濃度降低過(guò)程中受到外界CO2濃度的影響。

葉綠體是植物細(xì)胞特有的細(xì)胞器，光合作用主要發(fā)生在葉片的葉綠體中，其中，光能的吸收和轉(zhuǎn)換主要由葉綠素分子完成。持續(xù)的常溫弱光會(huì)使黃瓜的葉綠素含量降低，生長(zhǎng)放緩[31]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)H2S處理的植株其葉綠素含量得到了提高。推測(cè)H2S可通過(guò)提高葉綠素含量促進(jìn)光合效率的提高，為擬南芥的生長(zhǎng)提供充足的營(yíng)養(yǎng)。

H2S處理后的擬南芥植株光合基因Rubicso，RCA，LHCB3，LHCB2和GPD的表達(dá)量升高，表明其光合性能的提高是由于光合作用相關(guān)基因表達(dá)量增多而引起的。

綜上所述，通過(guò)外源施加生理濃度的H2S可提高光合基因Rubicso，RCA，LHCB3，LHCB2和GPD的表達(dá)量，進(jìn)而提高擬南芥植株中葉綠素的含量，提高凈光合作用速率、蒸騰速率、葉片氣孔導(dǎo)度等光合指標(biāo)，延長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的時(shí)間，推遲其抽薹。

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Hydrogen Sulfide as a Signal Molecules Influence the Growth and Development inArabidopsis thaliana

YUE Bin，PEI Yanxi，LIUDanmei，LIUZhiqiang
（College ofLife Science，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

Hydrogen sulfide（H2S）is regarded as the third gasotransmitter after nitric oxide and carbon monoxide.A large number of studies have been reported that H2S can regulate the processes in plants responding to stresses.However,the effects of H2S on plant development need to be further studied.In this study,the seedlings of Arabidopsis were treated with physiological concentrations of H2S which were reported previously and we found that H2S could prolong the time of bolting in Arabidopsis.Leaf chlorophyll content,net photosynthetic rate（Pn）,transpiration rate（T）and stomatal conductance（G）were improved with exogenous H2S treatments.Intercellular space CO2concentration（C）was decreased with the same treatments.The related-gene expressions ofphotosynthesis such as Rubicso，RCA,LHCB3,LHCB2 and GPD were up-regulated treated with exogenous H2S.In conclusion,treatments with physiological concentrations ofexogenous H2Scould enhance the photosynthetic abilities and decrease the boltingtime in Arabidopsis.

hydrogen sulfide;Arabidopsis thaliana;photosynthesis

Q945

A

1002-2481（2017）02-0178-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.02.07

2016-09-13

國(guó)家自然科學(xué)青年基金項(xiàng)目（31300236，31501772）；山西省自然科學(xué)青年基金項(xiàng)目（2014021026-1）

岳斌（1992-），男，山西運(yùn)城人，在讀碩士，研究方向：植物生理。劉志強(qiáng)為通信作者。