安子合劑對抗磷脂抗體陽性流產(chǎn)小鼠TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的影響Δ

柳 靜，陸啟濱（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，南京 210029）

安子合劑對抗磷脂抗體陽性流產(chǎn)小鼠TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的影響Δ

柳 靜＊，陸啟濱#（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，南京 210029）

目的：研究安子合劑對抗磷脂抗體（APA）陽性流產(chǎn)小鼠Toll樣受體4（TLR4）/髓樣分化因子88（MyD88）/核因子κB（NF-κB）信號通路的影響，探討其抗APA陽性流產(chǎn)作用機(jī)制。方法：將BALB/c小鼠（♀）隨機(jī)分為空白對照組、模型組、阿司匹林組（陽性對照，0.019 5 g/kg）和安子合劑低、中、高劑量組（37.7、75.4、150.8 g/kg，以生藥計(jì)），每組10只。除空白對照組外，其余各組小鼠均以人β2-糖蛋白Ⅰ為誘導(dǎo)劑建立APA陽性流產(chǎn)模型。從妊娠第1天起，各給藥組小鼠ig相應(yīng)藥物，空白對照組和模型組小鼠ig等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)9 d。分別采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法和免疫組化法測定胎盤組織TLR4、髓樣分化蛋白2（MD2）、MyD88、NF-κB mRNA及其蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與空白對照組比較，模型組小鼠胎盤組織TLR4、MD2、MyD88、NF-κB mRNA及其蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，阿司匹林組和安子合劑低、中劑量組小鼠胎盤組織TLR4、MD2、MyD88 mRNA及其蛋白表達(dá)水平，安子合劑高劑量組小鼠胎盤組織TLR4蛋白表達(dá)水平，以及各給藥組小鼠胎盤組織NF-κB蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；安子合劑低劑量組小鼠胎盤組織TLR4、MD2 mRNA表達(dá)水平和MD2、MyD88蛋白表達(dá)水平較阿司匹林組更低（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論：安子合劑可抑制APA陽性流產(chǎn)小鼠TLR4/MyD88/NF-κB信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，這可能是其抗APA陽性流產(chǎn)的作用機(jī)制之一。

安子合劑；抗磷脂抗體；TLR4/MyD88/NF-κB信號通路；流產(chǎn)小鼠；胎盤組織

抗磷脂抗體（Antiphospholipid antibody，APA）陽性流產(chǎn)是自身免疫流產(chǎn)中最為常見的一種，可引起復(fù)發(fā)性流產(chǎn)以及嚴(yán)重的產(chǎn)科并發(fā)癥（如早產(chǎn)、宮內(nèi)生長遲緩或胎盤機(jī)能不全等），危害女性生殖健康[1]。APA包括抗心磷脂抗體（Anticardiolipin antibody，ACA）、抗β2-糖蛋白Ⅰ抗體（Anti-β2-glycoproteinⅠantibody）和狼瘡抗凝物（Lupus anticoagulant），其中抗β2-糖蛋白Ⅰ被認(rèn)為是妊娠丟失的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。研究發(fā)現(xiàn)抗β2-糖蛋白Ⅰ可與其抗原結(jié)合形成復(fù)合物，活化Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4），引起髓樣分化蛋白2（Myeloid differentiation-2，MD2）的分泌，啟動髓樣分化因子88（Myeloid differentiation factor 88，MyD88）進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終激活核因子κB（Nuclear factor-κB，NF-κB），誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活化，釋放血栓及炎癥相關(guān)細(xì)胞因子，導(dǎo)致妊娠排斥和丟失。TLR4/MyD88/NF-κB信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)異常成為APA陽性流產(chǎn)機(jī)制研究中新的研究熱點(diǎn)[2]。

中醫(yī)安胎法源遠(yuǎn)流長，是中醫(yī)婦科學(xué)中頗有優(yōu)勢和特色的治法之一。南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院婦科研制的安子合劑由續(xù)斷、桑寄生、菟絲子、苧麻根、丹參、黃芩、白術(shù)、太子參、甘草等12種中藥材組成，具有補(bǔ)腎健脾、清熱活血的功效，其自1999年成為院內(nèi)制劑以來，臨床應(yīng)用的保胎成功率達(dá)90.0%[3]。前期研究表明，安子合劑具有降低孕鼠外周血ACA滴度、調(diào)節(jié)免疫功能、影響細(xì)胞增殖等作用[4-6]，但其作用靶點(diǎn)尚不十分明確。本研究在前期工作及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[4-6]的基礎(chǔ)上，以人β2-糖蛋白Ⅰ為免疫原建立APA陽性流產(chǎn)小鼠模型，探討安子合劑對模型小鼠胎盤組織TLR4/MyD88/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵分子的影響，旨在從免疫炎癥角度揭示其抗APA陽性流產(chǎn)的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

DX-45光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；Mikro 200R冷凍離心機(jī)（德國Hettich公司）；Nanodrop 2000核酸定量儀（美國Thermo公司）；Veriti@96 Well Thermal Cycler實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）系統(tǒng)（美國ABI公司）。

1.2 藥品與試劑

安子合劑（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑部自制，批號：1308002，規(guī)格：250 mL/瓶，其中含原藥材0.58 g/mL）；阿司匹林腸溶片（石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司，批號：018140883，規(guī)格：每片25 mg）；人β2-糖蛋白Ⅰ（以色列ProSpec公司，批號：PRO-388，純度：＞98%）；弗氏完全佐劑（CFA）、弗氏不完全佐劑（IFA）購自美國Sigma公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol試劑（日本Takara公司，批號：A4537、AA2103-1）；TLR4、MD2抗體（英國Abcam公司，批號：ab13556、ab73550）；MyD88、NF-κB抗體（美國CST公司，批號：4283S、8242P）；TLR4、MD2、MyD88、NF-κB引物均由南京金斯瑞公司合成；TLR4、MD2、MyD88、NF-κB免疫組化試劑盒（美國Bio-world公司，批號：20317592-1、203106740-1、20300164-1、20300068-1）。

1.3 動物

SPF級健康BALB/c小鼠90只[♀：60只，8周齡，體質(zhì)量（25±2）g；♂：30只，8～10周齡，體質(zhì)量（25±2）g]，均購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物許可證號為SCXK（蘇）2011-0003，合格證號為201401513。采用SPF級小鼠標(biāo)準(zhǔn)全營養(yǎng)飼料飼養(yǎng)。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將60只BALB/c小鼠（♀）隨機(jī)為6組，每組10只，分別為空白對照組、模型組、阿司匹林組（陽性對照，0.019 5 g/mL）[5-6]和安子合劑低、中、高劑量組（以生藥計(jì)給藥劑量分別為37.7、75.4、150.8 g/mL，按成人臨床劑量的1、2、4倍劑量換算而得）。除空白對照組外，其余各組小鼠參照文獻(xiàn)[7-8]中方法以人β2-糖蛋白Ⅰ為免疫原建立APA陽性流產(chǎn)小鼠模型：將β2-糖蛋白Ⅰ溶于無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）中，調(diào)整質(zhì)量濃度為400 μg/mL。從實(shí)驗(yàn)第1天開始ip人β2-糖蛋白Ⅰ與CFA體積比為1∶1的混合液50 μL；實(shí)驗(yàn)第8天以IFA代替CFA加強(qiáng)免疫1次，劑量同第1次免疫。于實(shí)驗(yàn)第18天，各組♀小鼠與♂小鼠以2∶1的比例合籠，自合籠之日起，每天早上8：00和下午14：00分別觀察1次，若觀察到角化細(xì)胞中夾有大量精子和/或見到陰栓則計(jì)為妊娠第0.5天。從妊娠第1天起各給藥組小鼠均按0.1 mL/10 g ig給藥，空白對照組和模型組小鼠ig等體積蒸餾水，每天1次，連續(xù)9 d。在妊娠第9.5天時頸椎脫臼法處死小鼠，留取胎盤組織進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測定。

2.2 RT-PCR法測定小鼠胎盤組織TLR4、MD2、MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)水平

采用Trizol液處理剪碎的胎盤組織并提取總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模版進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系：Real-time PCR Master Mix混合液10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板2 μL，滅菌雙蒸水7.2 μL，體系共20 μL。在基因表達(dá)的半定量分析中，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，通過與GAPDH表達(dá)量比較實(shí)現(xiàn)待測基因表達(dá)量的標(biāo)準(zhǔn)化。反應(yīng)條件：擴(kuò)增階段為95℃、5 min；95℃、15 s，60℃、60 s，共40個循環(huán)；溶解曲線階段為95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、15 s。用RT-PCR系統(tǒng)自帶軟件進(jìn)行溶解曲線分析，以2－ΔΔct法[9]計(jì)算目的基因mRNA的相對表達(dá)量?；蛞镄蛄屑爱a(chǎn)物長度見表1。

表1 基因引物序列及擴(kuò)增長度Tab 1 Gene primers and amplification length

2.3 免疫組化法測定小鼠胎盤組織TLR4、MD2、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)水平

常規(guī)制備小鼠胎盤組織石蠟切片。常規(guī)脫蠟、脫水，PBS沖洗3次，每次3 min；3%雙氧水（H2O2）常溫孵育15 min，PBS沖洗3次，每次3 min；3%牛血清白蛋白（BSA）封閉30 min后加入相應(yīng)一抗，濕盒4℃孵育過夜，PBS沖洗3次，每次5 min；加入50 μL生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育20 min，PBS沖洗3次，每次5 min；加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，室溫孵育20 min后PBS沖洗3次，每次5 min；加入二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液，室溫下顯色2～5 min，鏡下控制；蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。陽性產(chǎn)物均定位于細(xì)胞漿，以細(xì)胞漿著色呈棕褐色為陽性細(xì)胞。以計(jì)算機(jī)圖像分析軟件（Image-Pro Plus，IPP）分析TLR4、MD2、MyD88、NF-κB的積分光密度（IOD）值，以此反映陽性表達(dá)的強(qiáng)弱。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠胎盤組織TLR4、MD2、MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)水平測定結(jié)果

與空白對照組比較，模型組小鼠胎盤組織TLR4、MD2、MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，阿司匹林組和安子合劑低劑量組小鼠胎盤組織TLR4、MD2、MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.01），安子合劑中劑量組小鼠胎盤組織TLR4、MD2、MyD88 mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05或P＜0.01），安子合劑高劑量組上述指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與阿司匹林組比較，安子合劑低劑量組小鼠胎盤組織TLR4、MD2、MyD88、NF-κ B mRNA表達(dá)水平降低更為明顯，其中TLR4、MD2 mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)果詳見表2。

表2 各組小鼠胎盤組織TLR4、MD2、MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)水平測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 2 The mRNA expression levels of TLR4，MD2，MyD88 and NF-κB in placental tissue of mice in each group（±s，n＝10）

表2 各組小鼠胎盤組織TLR4、MD2、MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)水平測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 2 The mRNA expression levels of TLR4，MD2，MyD88 and NF-κB in placental tissue of mice in each group（±s，n＝10）

注：與空白對照組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與阿司匹林組比較，ΔΔP＜0.01Note：vs.blank control group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01；vs.aspirin group，ΔΔP＜0.01

組別空白對照組模型組阿司匹林組安子合劑低劑量組安子合劑中劑量組安子合劑高劑量組NF-κB 1.10±0.42 7.36±1.00＊＊5.12±2.65##3.95±1.91##5.23±3.38 5.56±4.19 TLR4 1.08±0.32 11.87±1.51＊＊6.73±2.61##3.82±0.89##ΔΔ5.99±1.64##9.51±3.86 MD2 1.10±0.33 8.37±2.73＊＊4.70±1.80##1.74±0.72##ΔΔ5.00±1.79##7.09±3.69 MyD88 1.26±0.94 3.47±1.58＊＊1.77±0.59##1.45±0.95##1.75±1.67#2.71±2.31

3.2 各組小鼠胎盤組織TLR4、MD2、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)水平測定結(jié)果

與空白對照組比較，模型組小鼠胎盤組織TLR4、MD2、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠胎盤組織TLR4、MD2、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)水平不同程度地降低，除安子合劑高劑量組小鼠胎盤組織MD2、MyD88蛋白表達(dá)水平降低不顯著外其余各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；與阿司匹林組比較，安子合劑低劑量組小鼠胎盤組織中MD2、MyD88表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），結(jié)果詳見表3、圖1。

表3 各組小鼠胎盤組織TLR4、MD2、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)水平測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 3 The protein expression levels of TLR4，MD2，MyD88 and NF-κB in placental tissue of mice in each group（±s，n＝10）

表3 各組小鼠胎盤組織TLR4、MD2、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)水平測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 3 The protein expression levels of TLR4，MD2，MyD88 and NF-κB in placental tissue of mice in each group（±s，n＝10）

注：與空白對照組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與阿司匹林組比較，ΔP＜0.05Note：vs.blank control group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01；vs.aspirin group，ΔP＜0.05

組別空白對照組模型組阿司匹林組安子合劑低劑量組安子合劑中劑量組安子合劑高劑量組NF-κB/GAPDH 2 461±868 8 823±2 262＊＊3 838±1 167##3 835±897##4 392±799##5 744±1 905#TLR4/GAPDH 2 418±917 7 935±974＊＊4 330±776##3 738±1 086##4 331±1 656##5 914±1 554#MD2/GAPDH 2 701±669 9 351±2 172＊＊6 192±1 775##4 648±1 134##Δ5 895±1 521##6 685±2 755 MyD88/GAPDH 1 951±882 8 028±2 674＊＊4 035±857##2 934±1 113##Δ5 101±1 927##5 869±2 045

4 討論

APA陽性流產(chǎn)是臨床難治性流產(chǎn)，西醫(yī)學(xué)采用抗血小板凝聚、免疫抑制等方法進(jìn)行治療，但在藥物使用劑量、給藥途徑、安全性等方面需要進(jìn)一步探討。南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院婦科自20世紀(jì)90年代起對APA陽性免疫性流產(chǎn)類疾病相繼開展了流行病學(xué)、臨床及藥理學(xué)機(jī)制等研究工作，認(rèn)為脾腎兩虛、血熱夾瘀是其發(fā)病過程中的關(guān)鍵病機(jī)，并在此理論基礎(chǔ)上研制了具有益腎健脾、清熱和血和安胎作用的院內(nèi)制劑——安子合劑。方中君藥續(xù)斷、桑寄生、菟絲子等益腎安胎以治其本，有取古方壽胎丸之意；太子參、甘草與白術(shù)相伍，健脾以補(bǔ)腎；苧麻根清熱涼血、止血安胎，有滋陰益腎之效；黃芩清心肝之火，配白術(shù)清熱安胎；丹參養(yǎng)血和血、疏通脈絡(luò)、調(diào)暢胞宮氣血，以養(yǎng)胎元。諸藥合用，則標(biāo)本兼顧。

有研究表明，在復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)中TLR4影響了免疫耐受調(diào)節(jié)細(xì)胞CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的表達(dá)[10-11]，TLR4信號通路下游分子NF-κB活化產(chǎn)生的腫瘤壞死因子α（TNF-α）等炎性因子能抑制CD4+CD25+Treg細(xì)胞的表達(dá)[12]。結(jié)合本課題組前期研究結(jié)果：APA陽性先兆流產(chǎn)患者外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例較正常孕婦減少[4]。推測APA可通過激活TLR4/MyD88/NF-κB信號通路，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，同時還可能影響CD4+CD25+Treg細(xì)胞的數(shù)量和功能，引起免疫耐受失衡，使母體對胚胎組織產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，最終導(dǎo)致妊娠丟失。

圖1 各組小鼠胎盤組織TLR4、MD2、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)免疫組化圖（×200）Fig 1 The immunohistochemical pictures of TLR4，MD2，MyD88 and NF-κB protein expression in placental tissue of mice in each group（×200）

本研究結(jié)果表明，在正常妊娠小鼠母胎界面TLR4、MD2、MyD88、NF-κB mRNA及其蛋白表達(dá)水平均較低，這提示在正常妊娠狀態(tài)下TLR4/MyD88/NF-κB信號可能處于警備狀態(tài)，當(dāng)母胎界面受到病原體感染時信號可迅速激活，啟動免疫保護(hù)。采用人β2-糖蛋白Ⅰ誘導(dǎo)造模后發(fā)現(xiàn)，母胎界面TLR4、MD2、MyD88、NF-κB mRNA及其蛋白表達(dá)水平均顯著升高，這證實(shí)了在APA陽性流產(chǎn)病理過程中TLR4/MyD88/NF-κB信號通路被激活，可能引起了母胎界面免疫炎癥反應(yīng)、血栓形成、胎盤組織壞死等，從而導(dǎo)致早孕丟失和晚期妊娠并發(fā)癥發(fā)生的推斷[12-13]。阿司匹林為水楊酸類解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥，是目前臨床治療抗磷脂抗體綜合征復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的常用藥[14-15]，故本文以其為陽性對照。安子合劑給藥后能顯著下調(diào)母胎界面TLR4、MD2、MyD88、NF-κB mRNA和蛋白的表達(dá)，這提示其能抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，且低劑量安子合劑的作用較阿司匹林更為明顯；中、高劑量安子合劑下調(diào)小鼠胎盤組織TLR4、MD2、MyD88、NF-κB mRNA及其蛋白表達(dá)的作用不及低劑量，這表明安子合劑低劑量作為等效人臨床常用劑量具有一定的科學(xué)性，同時研究數(shù)據(jù)也提示患者應(yīng)按臨床用藥指導(dǎo)用藥，以獲得較好臨床療效和用藥經(jīng)濟(jì)性。

綜上所述，安子合劑可抑制APA陽性流產(chǎn)小鼠TLR4/MyD88/NF-κB信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，這可能是其抗APA陽性流產(chǎn)的作用機(jī)制之一。本研究為中醫(yī)藥靶向治療免疫性、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)提供了新的科學(xué)依據(jù)。

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Effects of Anzi Mixture on TLR4/MyD88/NF-κB Signaling Pathway of Antiphospholipid Antibodies Positive Abortive Mice

LIU Jing，LU Qibin（Dept.of Gynaecology，the Affiliated Hospital of Nanjing University of TCM，Nanjing 210029，China）

OBJECTIVE：To study the effects of Anzi mixture on Toll like receptor 4（TLR4）/myeloid differentiation factor 88（MyD88）/nuclear facter-κB（NF-κB）signaling pathway of antiphospholipid antibodies（APA）positive abortive mice，and to investigate the mechanism of anti-APA positive abortion.METHODS：BALB/c mice（female）were randomly divided into blank control group，model group，aspirin group（positive control，0.019 5 g/kg）and Anzi mixture low-dose，medium-dose and high-dose groups（37.7，75.4，150.8 g/kg，calculated by crude drug），with 10 mice in each group.Except for blank control group，other groups were given human β2-glycoproteinⅠas derivant to establish APA positive abortion model.From the first day of pregnancy，treatment groups were given relevant medicine intragastrically，and blank control group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically，once a day，for consecutive 9 d.mRNA and protein levels of TLR4，myeloid differentiation 2（MD2），MyD88 and NF-κB in placental tissue of mice were determined by RT-PCR and immunohistochemical method.RESULTS：Compared with blank control group，mRNA and protein expression of TLR4，MD2，MyD88 and NF-κB in placental tissue were increased markedly in the model group（P＜0.01）.Compared with model group，mRNA and protein expression of TLR4，MD2 and MyD88 in aspirin group and Anzi mixture low-dose and medium-dose groups were decreased significantly as well as the protein expression of TLR4 in Anzi mixture high-dose group and the protein expression of NF-κB in all medicine groups（P＜0.05 or P＜0.01）.mRNA expression of TLR4 and MD2 and the protein expression of MD2 and MyD88 in Anzi mixture low-dose groups were lower than those in aspirin group（P＜0.05 or P＜0.01）.CONCLUSIONS：Anzi mixture can inhibit TLR4/MyD88/ NF-κB signaling pathway of APA positive abortive mice，which may be one of anti-APA positive abortion mechanisms.

Anzi mixture；Antiphospholipid antibody；TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway；Abortive mice；Placental tissue

R285.5

A

1001-0408（2017）01-0031-05

2016-08-18

2016-10-29）

（編輯：林 靜）

江蘇省中醫(yī)藥局國家中醫(yī)臨床研究基地開放課題（No.JD201507）；江蘇省中醫(yī)藥局中醫(yī)藥領(lǐng)軍人才課題（No. LJ200910）；江蘇省中醫(yī)院2014年度院級課題博士項(xiàng)目（No.Y14019）

＊副主任中醫(yī)師，博士研究生。研究方向：流產(chǎn)類疾病、絕經(jīng)綜合征。E-mail：13813824496@126.com

#通信作者：主任中醫(yī)師，碩士。研究方向：流產(chǎn)類疾病、絕經(jīng)綜合征。電話：025-86617141-91403。E-mail：wenwd@nuaa.edu.cn

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.01.08