Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化大蒜油提取工藝Δ

康冰亞，劉瑞新，桂新景，段曉穎，李學(xué)林，徐立然（.河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450000；.河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，鄭州 450046；.河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院艾滋病研究中心，鄭州 450000）

Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化大蒜油提取工藝Δ

康冰亞1＊，劉瑞新1#，桂新景2，段曉穎1，李學(xué)林1，徐立然3（1.河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450000；2.河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，鄭州 450046；3.河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院艾滋病研究中心，鄭州 450000）

目的：優(yōu)化大蒜油的提取工藝。方法：以大蒜油提取率為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)水蒸氣蒸餾法提取大蒜中大蒜油的發(fā)酵時(shí)間、料液比、發(fā)酵溫度等條件進(jìn)行優(yōu)化研究，對(duì)優(yōu)化工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果：最優(yōu)提取工藝為發(fā)酵時(shí)間4.5 h、料液比1∶7、發(fā)酵溫度55℃。驗(yàn)證試驗(yàn)中大蒜油平均提取率為0.32%（RSD＝1.43%，n＝3），實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間的相對(duì)誤差為0.06%。結(jié)論：采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化所得大蒜油提取工藝簡(jiǎn)便、合理、可行，可為大蒜油工業(yè)化大生產(chǎn)提供參考。

大蒜油；水蒸氣蒸餾法；Box-Behnken響應(yīng)面法；提取工藝；優(yōu)化

大蒜（Allium sativum L.）是百合科多年生草本植物大蒜的干燥鱗莖，主要活性成分為大蒜油，是蒜中所有含硫化合物的總稱[1]。大蒜油被稱之為天然抗生素，國(guó)內(nèi)外已有諸多相關(guān)產(chǎn)品問(wèn)世，現(xiàn)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品及食品等領(lǐng)域。

目前，大蒜油的提取工藝主要有水蒸氣蒸餾法、溶劑浸出法和超臨界二氧化碳萃取法。溶劑浸出法是一種相對(duì)比較溫和的方法，但是其不足之處是提取物中其他的可溶性雜質(zhì)含量偏高，將大蒜油進(jìn)一步提純的操作較復(fù)雜且難度大[2]。超臨界二氧化碳萃取法可直接獲得純凈、高品質(zhì)、高得率的大蒜油，具有生產(chǎn)周期短、安全可靠等優(yōu)點(diǎn)，但其對(duì)設(shè)備的要求也較高，相應(yīng)地提高了提取成本，產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)相對(duì)比較困難，目前主要處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，不便用于大規(guī)模生產(chǎn)[3]。水蒸氣蒸餾法具有設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)[4]，是最常用的工業(yè)生產(chǎn)化方法之一。本試驗(yàn)采用水蒸氣蒸餾法提取大蒜油，以大蒜油提取率為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面法分析并優(yōu)化水蒸氣蒸餾法提取大蒜油的工藝條件，并在工藝參數(shù)與大蒜油提取率之間建立數(shù)學(xué)模型關(guān)系，為將來(lái)的規(guī)模化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

DS-1型高速組織搗碎機(jī)（上海標(biāo)本模型廠）；揮發(fā)油提取器（北京新科實(shí)驗(yàn)室玻璃儀器有限公司）；ABZDHW-2000型電熱套（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）。

1.2 藥材

大蒜（于2016年3月27日購(gòu)自鄭州市丹尼斯超市，產(chǎn)地：河南）。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取方法

稱取一定量的去皮大蒜，放入組織搗碎機(jī)中，加入適量蒸餾水，搗碎成細(xì)顆粒狀，置于圓底燒瓶中，常壓加一定量蒸餾水，在特定溫度下浸泡發(fā)酵一定時(shí)間。連接揮發(fā)油提取器，提取一定時(shí)間，收集提取物，并加適量石油醚（60～90℃）萃取。精密讀取大蒜油體積，計(jì)算其提取率[提取量（mL）/大蒜質(zhì)量（g）×100%]。

2.2 單因素試驗(yàn)初步篩選影響因素與水平

查閱文獻(xiàn)[5-6]，分別設(shè)置發(fā)酵時(shí)間（h）、料液比（大蒜質(zhì)量-加水量，m∶V）、發(fā)酵溫度（℃）和蒸餾時(shí)間（h）4個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)置5個(gè)水平，以大蒜油提取率為指標(biāo)對(duì)影響因素進(jìn)行初步篩選。

2.2.1 發(fā)酵時(shí)間 設(shè)置發(fā)酵溫度為25℃、蒸餾時(shí)間為2 h、料液比為1∶4，考察發(fā)酵時(shí)間為1、2、3、4、5 h時(shí)對(duì)大蒜油提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1A。

圖1 各因素對(duì)大蒜油提取率的影響Fig 1 Effects of various factors on extraction rate of garlic oil

由圖1A可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，大蒜油提取率呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為4 h時(shí)，大蒜油提取率達(dá)到峰值，之后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。故以發(fā)酵時(shí)間4 h為宜。

2.2.2 料液比 設(shè)置蒸餾時(shí)間為2 h、發(fā)酵溫度為25℃、發(fā)酵時(shí)間為1 h，考察料液比分別為1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8時(shí)對(duì)大蒜油提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1B。

從圖1B可知，當(dāng)料液比為1∶4、1∶5時(shí)，大蒜油提取率未發(fā)生明顯變化；當(dāng)料液比設(shè)為1∶6時(shí)，大蒜油提取率呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)；當(dāng)料液比設(shè)為1∶7、1∶8時(shí)，大蒜油提取率又略呈現(xiàn)先下降、后又微升的趨勢(shì)。故選擇料液比1∶6為宜。

2.2.3 發(fā)酵溫度 設(shè)置蒸餾時(shí)間為2 h、料液比為1∶4、發(fā)酵時(shí)間為1 h，考察發(fā)酵溫度為15、25、35、45、55℃時(shí)對(duì)大蒜油提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1C。

從圖1C可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，大蒜油的提取率呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)；當(dāng)溫度達(dá)到35℃時(shí)，大蒜油提取率最高，之后略呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。故選擇發(fā)酵溫度35℃為宜。

2.2.4 蒸餾時(shí)間 設(shè)置發(fā)酵溫度為25℃、料液比為1∶4、發(fā)酵時(shí)間為1 h，考察蒸餾時(shí)間為1、2、3、4、5 h對(duì)大蒜油提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1D。

由圖1D可知，各蒸餾時(shí)間不同引起的大蒜油提取率的變化不太明顯，蒸餾前3 h呈現(xiàn)略微上升的趨勢(shì)，之后呈現(xiàn)略微下降的趨勢(shì)。從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，雖然蒸餾3 h比蒸餾2 h大蒜油提取率略高，但隨著蒸餾時(shí)間的延長(zhǎng)能耗增大。因此，從節(jié)約成本及降低能耗的角度考慮，確定蒸餾時(shí)間為2 h，并不再進(jìn)行優(yōu)化。

上述單因素結(jié)果表明，初步篩選的較優(yōu)提取條件為發(fā)酵時(shí)間4 h、料液比1∶6、發(fā)酵溫度35℃、蒸餾時(shí)間2 h。最終選取發(fā)酵時(shí)間3～5 h、料液比1∶5～1∶7、發(fā)酵溫度15～55℃進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面法設(shè)計(jì)，優(yōu)化大蒜油提取工藝參數(shù)。

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化大蒜油提取工藝

選取發(fā)酵時(shí)間（X1）、料液比（X2）、發(fā)酵溫度（X3）為考察變量，大蒜油提取率（Y）為響應(yīng)值，采用Box-Behnken design（BBD）試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，總共設(shè)計(jì)17組試驗(yàn)點(diǎn)。因素與水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

應(yīng)用Design Expert 6.0.5軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到Y(jié)對(duì)X1、X2、X3之間的二次多項(xiàng)回歸方程為：Y＝0.31+0.036X1－0.030X2+0.054X3－0.092X12－ 0.060X22－ 0.047X32+7.500×10－3X1X2+ 0.055X1X3+0.083X2X3，剔除不顯著項(xiàng)后 Y＝0.31+ 0.036X1－0.030X2+0.054X3－0.092X12－0.060X22－0.047X32+0.055X1X3+0.083X2X3。由方程可知，各因素對(duì)大蒜油提取率的影響大小排序?yàn)閄3＞X1＞X2，即發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間＞料液比。對(duì)上述回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab 2 Design and results of test

表3 回歸模型的方差分析結(jié)果Tab 3 Variance analysis result of regression model

從表3可以看出，回歸方程顯著性檢驗(yàn)P＜0.05，表明響應(yīng)面回歸模型達(dá)到顯著水平。模型失擬項(xiàng)表示模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值不擬合的概率[7]，表4中失擬項(xiàng)的P為0.535 4＞0.100，說(shuō)明該方程對(duì)試驗(yàn)結(jié)果擬合良好。模型中X3、X12、X2X3項(xiàng)具有顯著性，表明各個(gè)自變量與因變量之間不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，而具有一定的交互作用。對(duì)各因素繪制曲面圖和等高線圖，以直觀地反映各因素的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響以及最優(yōu)條件下各因素的取值結(jié)果，詳見(jiàn)圖2。

由圖2可見(jiàn)，X2與X3的曲線較陡，且等高線為橢圓形，表明二者之間具有顯著性交互作用；X1與X3、X1與X2的曲線比較平緩，等高線基本為圓形，表明兩兩之間交互作用不顯著，與方差分析結(jié)果一致。

圖2 各因素對(duì)大蒜油提取率的曲面圖和等高線圖Fig 2 Surface plot and contour map for various factors to extraction rate of garlic oil

根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面法試驗(yàn)所得結(jié)果和二次多項(xiàng)回歸方程，采用Design Expert 6.0.5軟件擬合可得最優(yōu)工藝條件為發(fā)酵時(shí)間4.5 h、料液比1∶7、發(fā)酵溫度55℃。此條件下大蒜油提取率預(yù)測(cè)值為0.34%。

平行、精密稱定3份大蒜，每份500 g，根據(jù)優(yōu)化工藝對(duì)3批樣品進(jìn)行提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果大蒜油平均提取率為0.32%（RSD＝1.43%，n＝3），與預(yù)測(cè)值基本接近（相對(duì)誤差為0.06%），表明預(yù)測(cè)值與真實(shí)值之間有較好的一致性，進(jìn)一步驗(yàn)證了模型的可靠性。

3 討論

3.1 提取方法

大蒜油中主要藥效成分是大蒜素，經(jīng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，大蒜具有的廣譜殺菌作用主要是由大蒜素引起的[8]，而如何將大蒜油從大蒜中有效提取出來(lái)尚有一定的難度，這主要是由于大蒜素是在蒜酶作用下轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的，而在提取操作中蒜酶極易失活。本試驗(yàn)采用水蒸氣蒸餾法，雖與其他方法相比有一定優(yōu)勢(shì)，但亦有不足之處，如蒸餾的高溫可能會(huì)導(dǎo)致一部分有效成分揮發(fā)或分解。如果在制備大蒜油的過(guò)程中采用保持低溫或隔絕空氣等特殊的生產(chǎn)技術(shù)，如低溫萃取或冷凍干燥技術(shù)，可能會(huì)提高制備的大蒜油的質(zhì)量，這將是本課題組下一步的研究方向。

3.2 各因素對(duì)提取率變化的影響原因分析

3.2.1 發(fā)酵時(shí)間 在單因素試驗(yàn)中，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，大蒜油提取率呈現(xiàn)先上升后下降。原因可能是大蒜中的蒜氨酸與蒜氨酸酶在細(xì)胞破碎后發(fā)生了酶解反應(yīng)所致。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，蒜氨酸酶與蒜氨酸充分反應(yīng)接觸，直至反應(yīng)完全，生成一種名為硫代亞磺酸酯的化合物，該化合物不穩(wěn)定，很快變成一系列的分子[9]，同時(shí)大蒜素的生成則減少。

3.2.2 料液比 在單因素試驗(yàn)中，隨著料液比的增大，大蒜油提取率呈現(xiàn)先平衡、再上升后又略下降、再微上升的趨勢(shì)。原因可能是當(dāng)料液比為1∶4～1∶5時(shí)，由于水量不夠，不能夠充分浸潤(rùn)大蒜，產(chǎn)生的蒸氣量不夠，從而導(dǎo)致大蒜油提取不完全；而當(dāng)繼續(xù)增大液體的比例時(shí)（1∶7～1∶8），可能又對(duì)大蒜產(chǎn)生了稀釋作用，從而導(dǎo)致其提取率略微下降。

3.2.3 發(fā)酵溫度 在單因素試驗(yàn)中，隨著發(fā)酵溫度的增加，大蒜油的提取率呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。原因可能是大蒜油的產(chǎn)生是一個(gè)酶促反應(yīng)，而蒜氨酸酶的活性受溫度的影響，當(dāng)蒜漿的發(fā)酵處于一定溫度時(shí)，蒜氨酸酶的活力最高，大蒜揮發(fā)油的轉(zhuǎn)化速量最快，產(chǎn)量也就較高[10]；而溫度低時(shí)，酶的活性小，產(chǎn)品轉(zhuǎn)化時(shí)間長(zhǎng)；溫度太高，偏離酶活性最適期，產(chǎn)品產(chǎn)量又降低。

3.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法的選取

由于本試驗(yàn)中的3個(gè)自變量因素皆為連續(xù)性變量，對(duì)于連續(xù)性變量的多因素試驗(yàn)，Box-Behnken響應(yīng)面法是一種較適合的分析方法。Box-Behnken響應(yīng)面法通過(guò)非線性模型擬合得出的最優(yōu)提取條件更接近客觀實(shí)際，避免了傳統(tǒng)正交設(shè)計(jì)和均勻設(shè)計(jì)法的不足，具有試驗(yàn)精度高、模型預(yù)測(cè)性好的優(yōu)點(diǎn)，并已用于優(yōu)化各種中藥的提取以及制劑處方工藝的試驗(yàn)中[11-13]。而本試驗(yàn)的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果也表明，采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化大蒜油提取工藝簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、可行。

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Optimization of the Extraction Technology of Garlic Oil by Box-Behnken Response Surface Method

KANG Bingya1，LIU Ruixin1，GUI Xinjing2，DUAN Xiaoying1，LI Xuelin1，XU Liran3（1.Third Grade Laboratory，State Administration for TCM，the First Affiliated Hospital of Henan Traditional Chinese Medicine University，Zhengzhou 450000，China；2.College of Pharmacy，Henan University of TCM，Zhengzhou 450046，China；3. AIDS Research Center，the First Affiliated Hospital of Henan University of TCM，Zhengzhou 450000，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of garlic oil.METHODS：Using extraction rate of garlic oil as index，based on single factor test，Box-Behnken response surface method was used to optimize conditions of steam distillation method for the extraction of garlic as fermentation time，solid to liquid ratio，fermentation temperature and the verification test were made for the optimized technology.RESULTS：The optimal extraction technology was as follows as fermentation time of 4.5 h，solid to liquid ratio of 1∶7，fermentation temperature of 55℃.The average extraction rate of garlic oil in verification test was 0.32%（RSD＝1.43%，n＝3）；the relative error between the measured value and predicted value was 0.06%.CONCLUSIONS：Box-Behnken response surface method is simple，reasonable and feasible to optimize the extraction technology of garlic oil，which can provide a scientific basis for industrial production.

Garlic oil；Steam distillation；Box-Behnken response surface method；Extraction technology；Optimization

R284.2

A

1001-0408（2017）01-0103-04DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.01.27

2016-06-12

2016-08-12）

（編輯：劉 萍）

國(guó)家中醫(yī)藥管理局國(guó)家中醫(yī)藥臨床研究基地業(yè)務(wù)建設(shè)科研專項(xiàng)課題（No.JDZX2015162）；鄭州市科技局項(xiàng)目（No.CZSYJJ-14012）

＊主管中藥師，碩士。研究方向：中藥制劑。電話：0371-66233639。E-mail：kangby2008@163.com

#通信作者：副主任藥師，博士。研究方向：中藥制劑及分析。電話：0371-66233639。E-mail：liuruixin7@163.com