熒光光譜法和分子對(duì)接研究拉米夫定、依非韋倫、替諾福韋與牛血清白蛋白的相互作用及機(jī)制Δ

劉 榮（上海市公共衛(wèi)生臨床中心藥劑科，上海 201508）

熒光光譜法和分子對(duì)接研究拉米夫定、依非韋倫、替諾福韋與牛血清白蛋白的相互作用及機(jī)制Δ

劉 榮＊（上海市公共衛(wèi)生臨床中心藥劑科，上海 201508）

目的：研究拉米夫定、依非韋倫、替諾福韋與牛血清白蛋白（BSA）的相互作用及其機(jī)制。方法：通過(guò)熒光光譜法研究不同溫度下不同濃度的拉米夫定、依非韋倫、替諾福韋與BSA的結(jié)合反應(yīng)，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，根據(jù)Stern-Volmer方程等公式計(jì)算動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)（KSV）、表觀猝滅常數(shù)（Kq）、結(jié)合常數(shù)（KA）、結(jié)合位點(diǎn)（n）和熱力學(xué)焓變（ΔH）、自由能變（ΔG）、熵變（ΔS），并運(yùn)用Sybyl 6.7 Flex X模塊建立這3種藥物與BSA的分子對(duì)接模型。結(jié)果：3種藥物與BSA相互作用的Kq均大于2.0×1010L/（mol·s），且隨溫度的升高而降低，n均接近于1，其熱力學(xué)函數(shù)ΔG＜0、ΔS＜0、ΔH＜0。分子對(duì)接模型顯示，3種藥物主要與BSA的Sudlow部位Ⅰ亞結(jié)構(gòu)域發(fā)生結(jié)合。結(jié)論：3種藥物與BSA之間存在相互作用，熒光猝滅方式以靜態(tài)猝滅為主，結(jié)合反應(yīng)為自發(fā)分子作用過(guò)程，結(jié)合作用力均以氫鍵和范德華力為主。熒光試驗(yàn)和分子對(duì)接研究結(jié)果一致，兩者可相互補(bǔ)充。

拉米夫定；依非韋倫；替諾福韋；牛血清白蛋白；熒光光譜法；分子對(duì)接

血清白蛋白（SA）作為循環(huán)系統(tǒng)中最豐富的可溶性蛋白，在所有蛋白質(zhì)中一直是研究最廣泛的一類[1]。SA能夠與許多內(nèi)源性和外源性物質(zhì)（如藥物、氨基酸、脂肪酸、膽紅素、膽汁酸、甲狀腺素等）結(jié)合，起到存儲(chǔ)和轉(zhuǎn)運(yùn)的作用[2-5]。在藥動(dòng)學(xué)（吸收、分配、代謝和排泄）中，由于在血漿中的大多數(shù)藥物都與人血清白蛋白（HSA）結(jié)合，所以HSA控制著藥物的分配過(guò)程，因而HSA在藥動(dòng)學(xué)研究中具有重要意義。前人已經(jīng)做過(guò)很多這方面的研究，如Chaudhuri S等[6]通過(guò)熒光光譜法和分子對(duì)接模型研究了血紅蛋白與抗氧化非瑟酮和3-羥基黃酮的相互作用；Sandhya B等[7]通過(guò)熒光光譜法、圓二色性（CD）和三維熒光研究了司他夫定與HSA的相互作用；Bocedi A等[8]通過(guò)熒光光譜研究抗人類免疫缺陷病毒（HIV）藥物與HSA的結(jié)合情況。

在臨床治療中，抗HIV藥物的反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑能夠有效抑制耐藥病毒株，具有較好的抗病毒作用，目前臨床已形成了穩(wěn)定且有效的聯(lián)合治療方案，即高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療（Highly active antiretroviral therapy，HAART）。替諾福韋（Tenofovir，TFV）和拉米夫定（Lamivudine，3TC）屬于核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（Nucleoside reverse transcriptase inhibitors，NRTIs），依非韋倫（Efavirenz，EFV）屬于非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors，NNRTIs），三者聯(lián)用是重要的一線抗艾滋病治療的聯(lián)合用藥方案。但是目前在臨床使用中發(fā)現(xiàn)，在中國(guó)人群中有很大部分人群在服藥半年后出現(xiàn)耐藥情況。故很有必要研究這些藥物與HSA的結(jié)合情況，其對(duì)研究這些藥物在體內(nèi)的運(yùn)輸、分布、代謝是非常重要的。由于牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）簡(jiǎn)單易得、穩(wěn)定性高，與HAS高度相似，故在許多生物化學(xué)以及藥理學(xué)研究中，均將BSA作為HSA的替代品[9]。筆者采用熒光光譜法和分子對(duì)接研究了拉米夫定、依非韋倫、替諾福韋與BSA的相互作用及其機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

LS55型熒光分光光度計(jì)（美國(guó)PerkinElmer公司）；PHS-3C型pH計(jì)（上海理達(dá)儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

3TC對(duì)照品（英國(guó)葛蘭素史克公司，批號(hào)：K026520，純度：＞99%）；TFV對(duì)照品、EFV對(duì)照品（上海安譜科學(xué)儀器有限公司，批號(hào)：CDDM-A825000、CDDM-E425000，純度：均＞99%）；BSA（上海愛(ài)紫特生物科技有限公司，批號(hào)：150320，規(guī)格：每瓶30 g）；三羥甲基氨基甲烷（阿拉丁化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 BSA貯備液 精密稱定BSA溶于Tris-HCl緩沖液（pH 7.4，下同）中制成BSA貯備液（1.0×10－4mol/L），于4℃避光保存。

2.1.2 工作液 精密稱定3TC、TFV、EFV對(duì)照品溶于Tris-HCl緩沖液中，制成最終濃度均為1.0×10－4mol/L的工作液。

2.2 光譜測(cè)定

在9個(gè)10 mL的量瓶?jī)?nèi)用微量取樣器分別注入1 000 μL BSA貯備液，再分別加入不同量的工作液，使藥物終濃度分別為0、1×10－7、5×10－7、1×10－6、2×10－6、5×10－6、1× 10－5、2.5×10－5、5×10－5mol/L，用Tris-HCl緩沖液定容，混勻，置于25℃的水浴中孵育2 h。于熒光分光光度計(jì)上檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，掃描波長(zhǎng)范圍為285～450 nm的發(fā)射光譜，觀察熒光強(qiáng)度大小的變化并記錄340 nm波長(zhǎng)處熒光發(fā)射光譜強(qiáng)度。試驗(yàn)過(guò)程中用電子循環(huán)水浴控制樣品溫度。另外用同樣的方法掃描在37℃下反應(yīng)產(chǎn)物的發(fā)射光譜，觀察340 nm波長(zhǎng)處熒光強(qiáng)度大小的變化。

2.3 分子對(duì)接

在SGI Fuel R14000工作站上通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)平臺(tái)Sybyl 6.7 Flex X模塊完成計(jì)算工作。BSA的晶體結(jié)構(gòu)來(lái)源于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（Protein databank，PDB）。3TC、TFV、EFV的初始分子結(jié)構(gòu)均從其與相應(yīng)目標(biāo)蛋白的晶體復(fù)合物中提取。提取分子在進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)修正的基礎(chǔ)上，加氫原子及Gasteriger-Huckel電荷后進(jìn)行分子優(yōu)化，完成對(duì)接的配體準(zhǔn)備工作。根據(jù)文獻(xiàn)[8]報(bào)道的化合物類似物結(jié)合模式選擇相應(yīng)的結(jié)合區(qū)域，從結(jié)合區(qū)域中選擇多見(jiàn)于與抗HIV類藥物結(jié)合的氨基酸殘基Trp214作為對(duì)接結(jié)合亞域的關(guān)鍵性殘基，并且以此為中心選擇10 ?的對(duì)接區(qū)域檢索。對(duì)每個(gè)化合物對(duì)接計(jì)算所獲得的構(gòu)象，對(duì)評(píng)分排名前10位的對(duì)接構(gòu)象結(jié)構(gòu)進(jìn)行疊合及相似性分析，選擇最有代表性及合理性的對(duì)接構(gòu)象進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 光譜

25℃下反應(yīng)后，BSA在3種藥物不同濃度下的熒光光譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 BSA在3種藥物不同濃度下的熒光光譜圖Fig 1 Fluorescence spectroscopy of BSA under different concentrations of 3 kinds of drugs

由圖1顯示，保持BSA濃度不變，隨著3TC、TFV、EFV濃度的增加，BSA的熒光發(fā)射強(qiáng)度有規(guī)律地減少，這表明3TC、TFV、EFV可以猝滅BSA的內(nèi)部熒光，也發(fā)生了能量的轉(zhuǎn)移，3TC、TFV、EFV與BSA之間存在相互作用。根據(jù)Stern-Volmer方程：

式中，F(xiàn)0、F分別為BSA溶液中加入熒光猝滅分子前后的熒光發(fā)射強(qiáng)度，Kq為表觀猝滅常數(shù)，[Q]為所加入的抗病毒藥物的總濃度，KSV為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)，τ0為BSA熒光壽命（約10－8s）。對(duì)BSA在340 nm波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，利用公式（1）對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合，即可求得25、37℃時(shí)，BSA與3TC、TFV和EFV相互作用的KSV、Kq和r，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同溫度下3種藥物與BSA的KSV、Kq和r測(cè)定結(jié)果Tab 1 KSV，Kqand r of 3 kinds of drugs with BSA under different temperatures

根據(jù)文獻(xiàn)[10]中有關(guān)動(dòng)態(tài)猝滅的數(shù)據(jù)，蛋白質(zhì)等生物大分子的最大雙分子猝滅常數(shù)是2.0×1010L/（mol·s），KSV隨著溫度的升高而增加。BSA與3TC、TFV、EFV相互作用的Kq均大于2.0×1010L/（mol·s），且隨著溫度的升高而降低，說(shuō)明BSA與3TC、TFV、EFV分子間的能量轉(zhuǎn)移屬于非輻射轉(zhuǎn)移過(guò)程，靜態(tài)猝滅是BSA發(fā)生熒光猝滅的主要原因，這可能是由BSA在基態(tài)時(shí)與抗病毒藥物反應(yīng)形成新的配合物引起。

對(duì)于靜態(tài)猝滅，猝滅劑與熒光分子之間的結(jié)合常數(shù)（KA）可由熒光強(qiáng)度與猝滅劑濃度的關(guān)系求出：

按式（2）即可計(jì)算出3TC、TFV、EFV與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)（KA）以及結(jié)合位點(diǎn)（n），結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同溫度下3種藥物與BSA的KA與n測(cè)定結(jié)果Tab 2 KAand n of 3 kinds of drugs with BSA under different temperatures

由表2可知，BSA與3TC、TFV、EFV之間n隨溫度升高而降低，表明3TC、TFV、EFV與BSA之間有很強(qiáng)的結(jié)合力，形成了一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)；r均大于0.9，表明3TC、TFV、EFV與BSA之間相互作用的結(jié)合模式符合式（2）。

3.2 熱力學(xué)函數(shù)

在溫度變化不大時(shí)，反應(yīng)的焓變（ΔH）可以看作一個(gè)常數(shù)。通過(guò)公式可以求出反應(yīng)的自由能變（ΔG），然后再分別求出ΔH和熵變（ΔS）：

式中k1和k2分別是25、37℃下所得線性方程的截距。SA結(jié)構(gòu)很復(fù)雜，其與藥物之間往往同時(shí)存在幾種作用力。本研究用熒光光譜法測(cè)定了BSA與3TC、TFV、EFV相互作用體系在25、37℃下的K，結(jié)合公式（3）（4）計(jì)算3TC、TFV、EFV與BSA的熱力學(xué)函數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，3TC、TFV、EFV與BSA結(jié)合過(guò)程的ΔG＜0、ΔS＜0，表明其作用過(guò)程是一個(gè)熵和自由能均減小的自發(fā)分子作用過(guò)程；3TC、TFV、EFV與BSA結(jié)合過(guò)程的ΔH＜0、ΔS＜0，說(shuō)明其作用力均是以氫鍵和范德華力為主。

表3 不同溫度下3種藥物與BSA的ΔH、ΔG、ΔS測(cè)定結(jié)果Tab 3 ΔH，ΔG and ΔS of 3 kinds of drugs with BSA under different temperatures

3.3 分子對(duì)接

3種藥物與BSA的分子對(duì)接模型圖見(jiàn)圖2。

圖23 種藥物與BSA的分子對(duì)接模型圖Fig 2 Molecular docking model of 3 kinds of drugs with BSA

由圖2顯示，3TC、TFV、EFV主要與BSA的SudlowⅠ亞結(jié)構(gòu)域發(fā)生結(jié)合。TFV分子中的丙基側(cè)鏈與Trp213形成疏水相互作用；3TC的嘧啶酮結(jié)構(gòu)可與Leu197和Trp213形成“三明治”樣的π-π類型相互作用；EFV與 Trp213發(fā)生類似的π-π堆積作用。

4 討論

在本研究中，抗病毒藥物與BSA的結(jié)合情況通過(guò)測(cè)定熒光光譜進(jìn)行。靜態(tài)猝滅是由于藥物與BSA發(fā)生了配合反應(yīng)，合成了不發(fā)熒光的基態(tài)或激發(fā)態(tài)的藥物-BSA復(fù)合物引起的。激發(fā)態(tài)下的藥物-BSA復(fù)合物一般不會(huì)快速解離而是直接返回到基態(tài)，因此復(fù)合物是熒光發(fā)生改變的主要原因，而溫度升高會(huì)影響到藥物-BSA復(fù)合物的合成或降低其穩(wěn)定性，使KSV隨著溫度升高而減小。本研究結(jié)果顯示，3TC、TFV、EFV與BSA間的熒光猝滅主要以靜態(tài)猝滅為主。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)3TC、TFV、EFV與BSA的n隨著溫度的升高而降低，這表明在3TC、TFV、EFV與BSA的結(jié)合過(guò)程中有以共價(jià)形式存在的相互作用，但在其中起主要作用的還是以非離子形式存在的相互作用。

藥物分子和蛋白質(zhì)之間的作用力主要有疏水作用力、氫鍵、范德華力和靜電引力等。不同藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合的作用力類型是不同的。從熱力學(xué)觀點(diǎn)看，在一定的溫度和壓力下，藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合反應(yīng)能否自發(fā)進(jìn)行取決于體系的ΔG，ΔG＜0有利于反應(yīng)的自發(fā)進(jìn)行。Ross PD等[11]總結(jié)出判斷生物大分子與小分子結(jié)合力性質(zhì)和生物大分子自身結(jié)合力性質(zhì)的熱力學(xué)規(guī)律，即根據(jù)反應(yīng)前后熱力學(xué)ΔH和ΔS的相對(duì)大小，來(lái)判斷藥物與蛋白質(zhì)之間的主要作用力類型：ΔH＞0、ΔS＞0為疏水作用力；ΔH＜0、ΔS＜0為氫鍵和范德華力；ΔH＜0、ΔS＞0為靜電引力。本研究結(jié)果顯示，3TC、TFV、EFV與BSA結(jié)合過(guò)程的ΔG＜0、ΔS＜0，表明其作用過(guò)程是一個(gè)熵和自由能均減小的自發(fā)分子作用過(guò)程；ΔH＜0、ΔS＜0，表明其作用力均是以氫鍵和范德華力為主。

雖然BSA共含有7個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域，能夠與相應(yīng)的配體發(fā)生結(jié)合，但與抗HIV藥物結(jié)合的區(qū)域則相對(duì)比較保守。3TC、EFV主要與HSA的SudlowⅠ亞結(jié)構(gòu)域發(fā)生結(jié)合[8]。由于TFV已知是NRTIs，并且在結(jié)構(gòu)上與EFV非常接近，因此可以合理假設(shè)TFV也結(jié)合在HSA的相同位點(diǎn)上。本研究發(fā)現(xiàn)，3TC、TFV、EFV與BSA的結(jié)合模式與HSA類似；此外，考慮到BSA與抗HIV藥物的相互作用可改變BSA的Trp213構(gòu)象，并且誘導(dǎo)產(chǎn)生固有的色氨酸熒光猝滅效應(yīng)，因此選擇Trp213作為模擬藥物-蛋白相互作用的關(guān)鍵性氨基酸殘基。

根據(jù)TFV與BSA的分子對(duì)接結(jié)果，TFV分子中的丙基側(cè)鏈與Trp213形成疏水相互作用，且其結(jié)構(gòu)上的6-位氨基與Leu480上的酰胺基團(tuán)形成氫鍵。3TC的嘧啶酮結(jié)構(gòu)可與Leu197和Trp213形成“三明治”樣的π-π類型相互作用；此外，3TC嘧啶酮上的氨基基團(tuán)還與Ser201、Arg198形成了定向的氫鍵相互作用。此類相互作用都可能對(duì)3TC所表現(xiàn)出的相對(duì)較高的BSA親和力有貢獻(xiàn)。而EFV的苯環(huán)還可與Trp213發(fā)生類似的π-π堆積作用；此外，該苯環(huán)還可與Arg194上的堿性胍基產(chǎn)生一個(gè)額外的陽(yáng)離子-π相互作用。這樣的疏水作用同樣也應(yīng)對(duì)EFV的高BSA親和力有貢獻(xiàn)。本文所考察的3種抗HIV藥物都結(jié)合在BSA的相同結(jié)構(gòu)亞域（均以Trp213為中心）之中，雖然各自的結(jié)合方式并不相同，但其對(duì)血漿蛋白結(jié)合行為及潛在的藥物-藥物相互作用產(chǎn)生了影響。若患者同時(shí)服用3種藥物，可導(dǎo)致藥物在血漿中競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合相同位點(diǎn)，故三者間存在相互作用。

熒光光譜法與分子對(duì)接是研究抗病毒藥物與BSA的相互作用的有效互補(bǔ)的2種研究方法。BSA與藥物結(jié)合的信息可使研究者更好地了解藥物在體內(nèi)的吸收、分布情況以及藥物的毒性。

[1] Zhang Y，Lee P，Liang S，et al.Structural basis of nonsteroidal anti-inflammatory drug diclofenac binding to human serum albumin[J].Chem Biol Drug，2015，86（5）：1178-1184.

[2] Zsila F，Bikadi Z，Simonyi M.Probing the binding of the flavonoid，quercetin to human serum albumin by circular dichroism，electronic absorption spectroscopy and molecular modelling methods[J].Biochem Pharmacol，2003，65（3）：447-456.

[3] Fanali G，F(xiàn)asano M，Ascenzi P，et al.α-Tocopherol binding to human serum albumin[J].Biofactors，2013，56（3）：294-303.

[4] Yue Y，Dong Q，Zhang Y，et al.Synthesis of imidazole derivatives and the spectral characterization of the binding properties towards human serum albumin[J].Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc，2016，11（153）：688-703.

[5] 蘭蕊，龔小保，黃利桂，等.熒光光譜法測(cè)定3種黃酮類化合物與人血清白蛋白相互作用的機(jī)制研究[J].中國(guó)藥房，2016，27（22）：3054-3057.

[6] Chaudhuri S，Chakraborty S，Sengupta PK.Probing the interactions of hemoglobin with antioxidant flavonoids via fluorescence spectroscopy and molecular modeling studies[J].Biophy Chem，2011，154（1）：26-34.

[7] Sandhya B，Hegde AH，Seetharamappa J.Elucidation of binding mechanism and identification of binding site for an anti HIV drug，stavudine on human blood proteins[J]. Mol Biol Rep，2013，40（5）：3817-3827.

[8] Bocedi A，Notaril S，Narciso P，et al.Binding of anti-HIV drugs to human serum albumin[J].IUBMB Life，2004，56（10）：609-614.

[9] Bujacz A.Structures of bovine，equine and leporine serum albumin[J].Acta Crystallogr D Biol Crystallogr，2012，68（Pt10）：1278-1289.

[10] Jahanban-Esfahlan A，Panahi-Azar V，Sajedi S.Spectroscopic and molecular docking studies on the interaction between N-acetyl cysteine and bovine serum albumin[J]. Biopolymers，2015，103（11）：638-645.

[11] Ross PD，Subramanian S.Thermodynamics of protein association reactions：forces contributing to stability[J].Biochemistry，1981，20（11）：3096-3102.

Interaction between Bovine Serum Albumin with Lamivudine，Efavirenz，Tenofovir and Its Mechanism by Fluorescence Spectroscopy and Molecular Docking

LIU Rong（Dept.of Pharmacy，Shanghai Public Health Clinical Center，Shanghai 201508，China）

OBJECTIVE：To study the interaction between bovine serum albumin（BSA）with lamivudine，efavirenz，tenofovir and its mechanism.METHODS：Fluorescence spectroscopy was used to determine the interaction between BSA with different concentrations of lamivudine，efavirenz，tenofovir under different temperatures.The fluorescence intensity of them were determined respectively；quenching constant（KSV），apparent quenching constant（Kq），binding constant（KA），binding site（n），thermodynamic enthalpy change（ΔH），free energy diversification（ΔG）and entropy change（ΔS）were calculated according to Stern-Volmer equation and so on.Molecular docking model of 3 drugs with BSA was established by using Sybyl 6.7 Flex X model.RESULTS：Kqfor the interaction between 3 drugs with BSA were all higher than 2.0×1010L/（mol·s），and were decreased with the increase of temperature；all n were close to 1，and thermodynamic functions ΔG＜0，ΔS＜0，ΔH＜0.Molecular docking model showed that 3 drugs were mainly bound with BSA at SudlowⅠ subdomain site.CONCLUSIONS：There are the interaction between 3 drugs with BSA；fluorescence quenching mainly manifests as static quenching；binding reaction belongs to spontaneous molecular action process；binding force mainly includes hydrogen bond and Van der Waals’force.The result of fluorescence experiment is consistent with those of molecular docking，and they complement each other.

Lamivudine；Efavirenz；Tenofovir；Bovine serum albumin；Fluorescence spectroscopy；Molecular docking

O657.3；R978.7

A

1001-0408（2017）01-0049-05

2016-05-17

2016-07-15）

（編輯：鄒麗娟）

上海市公共衛(wèi)生臨床中心科研課題計(jì)劃面上項(xiàng)目（No.2014M07）

＊主管藥師，碩士。研究方向：藥物分析。電話：021-37990333-5313。E-mail：liurong@shaphc.org

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.01.13