人單核細(xì)胞THP-1源性泡沫細(xì)胞內(nèi)雷帕霉素含量測(cè)定的HPLC法的建立及應(yīng)用Δ

胡華鐘，王仲萍，陳亦清，朱秋連，林彩燕，嚴(yán)鵬科#（.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院藥學(xué)部，廣州 5050；.廣州同鵬中旭醫(yī)藥科技有限公司，廣州 5050）

人單核細(xì)胞THP-1源性泡沫細(xì)胞內(nèi)雷帕霉素含量測(cè)定的HPLC法的建立及應(yīng)用Δ

胡華鐘1＊，王仲萍2，陳亦清2，朱秋連1，林彩燕1，嚴(yán)鵬科1#（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院藥學(xué)部，廣州 510510；2.廣州同鵬中旭醫(yī)藥科技有限公司，廣州 510510）

目的：建立人單核細(xì)胞THP-1源性泡沫細(xì)胞內(nèi)雷帕霉素（RAPA）含量的測(cè)定方法，研究RAPA靶向制劑（RAPA-NP-Apt）對(duì)泡沫細(xì)胞的靶向作用。方法：以氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞建立泡沫細(xì)胞模型，取200 ng/mL的RAPA和200、400、800 ng/mL的RAPA-NP-Apt與泡沫細(xì)胞共同孵育60 min。采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定細(xì)胞內(nèi)RAPA含量，色譜柱為Diamonsil C18，流動(dòng)相為乙腈-水（90∶10，V/V），流速為1.0 mL/min，柱溫為40℃，檢測(cè)波長為278 nm，進(jìn)樣量為20 μL。結(jié)果：RAPA檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為50～6 400 ng/mL（r＝0.999 96），平均回收率為98.72%（RSD＝0.62%，n＝3），日內(nèi)、日間RSD均不大于6.15%（n＝6），穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD＜2%（n＝6），重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＝1.64%（n＝6）。RAPA和低、中、高質(zhì)量濃度的RAPA-NP-Apt與泡沫細(xì)胞共孵育后RAPA的含量分別為12、43、98、140 ng/106個(gè)細(xì)胞。結(jié)論：本方法操作簡單，穩(wěn)定性和重復(fù)性好，可用于泡沫細(xì)胞內(nèi)RAPA的含量測(cè)定。RAPA-NP-Apt可提高RAPA對(duì)泡沫細(xì)胞的靶向作用。

高效液相色譜法；雷帕霉素；含量測(cè)定；靶向藥物；泡沫細(xì)胞

雷帕霉素（RAPA）是一種疏水性大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑，能特異性抑制冠脈支架置入后血管平滑肌細(xì)胞的過度增殖，降低冠脈支架置入后再狹窄的發(fā)生率[1]。但該藥物全身給藥對(duì)再狹窄療效不佳，故一直采用藥物涂層于支架的方法，局部用藥治療動(dòng)脈粥樣硬化（Athero-sclerosis，AS）病變。由于給藥方式、劑量、給藥時(shí)間受限等因素，易造成晚期支架內(nèi)血栓形成和支架內(nèi)再狹窄等臨床安全性問題[2-4]。

泡沫細(xì)胞的形成是AS早期的標(biāo)志，在AS的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。本課題組已將前期研究獲得的特異性靶向泡沫細(xì)胞的適配子與雷帕霉素納米粒構(gòu)建成靶向納米給藥體系，旨在替代現(xiàn)有的抗再狹窄藥物涂層于支架的靶向模式，防治支架內(nèi)再狹窄。本研究采用高效液相色譜法建立了細(xì)胞內(nèi)RAPA含量的測(cè)定方法，分析RAPA靶向制劑對(duì)AS泡沫細(xì)胞的靶向作用，以期為研發(fā)具抗AS作用的RAPA靶向制劑提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1200高效液相色譜儀，包括G1322A在線脫氣機(jī)、G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器、G4212B二極管陣列紫外檢測(cè)器（DAD）和色譜化學(xué)工作站（美國Agilent公司）；5804低溫離心機(jī)（德國Eppendorf公司，離心半徑：95 mm）；BP310P電子天平（德國Sartorius公司）；M3800-C超聲波清洗機(jī)（美國Bransonic公司）。

1.2 藥品與試劑

RAPA靶向制劑（RAPA-NP-Apt，批號(hào)：2015090606，載藥量：13%）、氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL，批號(hào)：2015062301，規(guī)格：14 mg/L）均由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院藥劑科實(shí)驗(yàn)室自制；RAPA對(duì)照品（廣州慈銘生物公司，批號(hào)：140503，純度：99.4%）；油紅O（美國Sigma公司）；乙腈為色譜純，丙酮、乙醇為分析純。

1.3 細(xì)胞株

人單核細(xì)胞THP-1購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所。

2 方法與結(jié)果

2.1 泡沫細(xì)胞模型的建立及鑒定

THP-1細(xì)胞培養(yǎng)于6孔培養(yǎng)板中，置于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。試驗(yàn)前用100 nmol/L的丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）誘導(dǎo)72 h，使其分化成巨噬細(xì)胞，再用80 mg/L的ox-LDL孵育72 h，誘導(dǎo)成泡沫細(xì)胞[5]。取泡沫細(xì)胞用油紅O[油紅O-去離子水（3∶2）]染色10 min，再用60%的異丙醇漂洗，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和脂滴的變化。結(jié)果顯示，細(xì)胞胞漿體積增大且細(xì)胞內(nèi)含大量紅色脂滴，與泡沫細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)相符，表明泡沫細(xì)胞誘導(dǎo)成功。THP-1細(xì)胞及其泡沫細(xì)胞的鑒定結(jié)果見圖1。

圖1 THP-1細(xì)胞及其泡沫細(xì)胞的鑒定圖（油紅O染色，×400）Fig 1 Identification of THP-1 cells and foam cells（Oil red O staining，×400）

2.2 溶液的制備

2.2.1 RAPA對(duì)照品溶液 精密稱取RAPA對(duì)照品0.1 g，置于100 mL量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，制成1 mg/mL的RAPA對(duì)照品溶液。

2.2.2 細(xì)胞內(nèi)液 泡沫細(xì)胞用冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3次，去上清，加入200 μL的乙腈，超聲振蕩20 min

破壁，再收集，渦旋振蕩20 min，13 000 r/min（離心半徑：95 mm）離心10 min，收集上清液，即得。

2.2.3 RAPA標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞液 取細(xì)胞內(nèi)液875 μL，加125 μL的RAPA對(duì)照品溶液，混勻即得。

2.2.4 細(xì)胞樣品溶液 取泡沫細(xì)胞（106mL－1），分別加入含RAPA[溶于0.1%二甲基亞砜（DMSO）]或RAPANP-Apt的培養(yǎng)基，孵育60 min后，細(xì)胞用冷的PBS清洗3次，去上清。加入200 μL的乙腈，超聲20 min破壁，再收集，渦旋振蕩20 min，13 000 r/min（離心半徑：95 mm）離心10 min，收集上清液，即得。

2.3 含量測(cè)定方法的建立

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（90∶10，V/V），流速：1 mL/min；檢測(cè)波長：278 nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.3.2 專屬性試驗(yàn) 取細(xì)胞內(nèi)液、RAPA標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞液、RAPA細(xì)胞樣品溶液，分別按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)液中RAPA的出峰時(shí)間約為5.811 min，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾其測(cè)定。色譜圖見圖2。

圖2 高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms

2.3.3 線性關(guān)系考察 按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備質(zhì)量濃度分別為50、100、200、400、800、1 600、3 200、6 400 ng/mL的RAPA標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞液，照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以雷帕霉素質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，得回歸方程為y＝510.369 19x+ 2.381 436 5（r＝0.999 96）。結(jié)果表明，RAPA檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為50～6 400 ng/mL，定量限為1 ng。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備質(zhì)量濃度分別為200、800、1 600 ng/mL的RAPA標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。同日內(nèi)檢測(cè)6次考察日內(nèi)精密度，連續(xù)測(cè)定6 d考察日間精密度。結(jié)果，日內(nèi)RSD分別為4.02%、4.38%、3.50%（n＝6），日間RSD分別為4.45%、5.51%、6.15%（n＝6），均不大于6.15%，表明精密度良好。

2.3.5 回收率試驗(yàn) 按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備質(zhì)量濃度分別為200、800、1 600 ng/mL的RAPA標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞液，分別加入RAPA對(duì)照品16.24 ng，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，平均回收率為98.72%，RSD＝0.62%（n＝3），表明準(zhǔn)確性良好，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab 1 Results of recovery test（n＝3）

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 制備質(zhì)量濃度為800 ng/mL的RAPA標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞液，分別在0、2、4、6、8、12、24、48 h時(shí)按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，考察穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，峰面積的RSD＝2.84%（n＝8），表明RAPA標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 制備質(zhì)量濃度為800 ng/mL的RAPA標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，重復(fù)測(cè)定6次，考察重復(fù)性。結(jié)果顯示，峰面積的RSD＝1.64%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.8 樣品含量的測(cè)定 取含200 ng/mL RAPA的培養(yǎng)基和含200、400、800 ng/mL（低、中、高質(zhì)量濃度）RAPA-NP-Apt的培養(yǎng)基，按“2.2.4”項(xiàng)下方法孵育細(xì)胞，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定細(xì)胞內(nèi)RAPA的含量。采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組樣本均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，兩組樣本均數(shù)間的比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示，RAPA和低、中、高質(zhì)量濃度的RAPA-NP-Apt與泡沫細(xì)胞共孵育后RAPA的含量分別為12、43、98、140 ng/106個(gè)細(xì)胞。與RAPA比較，3個(gè)質(zhì)量濃度的RAPA-NP-Apt在泡沫細(xì)胞中的含量均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果見圖3。

圖3 樣品含量的測(cè)定結(jié)果Fig 3 Results of content determination of samples

3 討論

Guo J等[6]用熒光分析法來檢測(cè)適配子介導(dǎo)的靶向制劑對(duì)腦瘤細(xì)胞的靶向性，證明了靶向制劑對(duì)腦瘤細(xì)胞的靶向性良好。但熒光分析只能定性分析，不能定量分析，誤差比較大。本文采用高效液相色譜法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)RAPA含量，分辨率和靈敏度更高，分析速度快，重復(fù)性更好，定量更精確。

高效液相色譜法的樣品提取一般采用液-液萃取法[7]，但液-液萃取法只能萃取到樣品中純的藥物，不能萃取到具有水溶性的納米粒里面的藥物。而本文的樣品是由納米粒包載的藥物，所以采用液-液萃取法提取的藥物的濃度檢測(cè)不準(zhǔn)確。經(jīng)過筆者的改進(jìn)，采用超聲破碎后再用液-液萃取法，既可以破碎細(xì)胞，又可以破壞納米粒的結(jié)構(gòu)，讓包載在納米粒中的RAPA溶出，使其可以直接定量分析，提高了試驗(yàn)的準(zhǔn)確度。

本文研究結(jié)果表明，RAPA-NP-Apt比RAPA有更好的生物相容性。低、中、高質(zhì)量濃度的RAPA-NP-Apt在泡沫細(xì)胞中含量較RAPA高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），進(jìn)一步說明了RAPA-NP-Apt可提高RAPA對(duì)泡沫細(xì)胞的靶向作用。

本文建立了測(cè)定泡沫細(xì)胞內(nèi)RAPA含量的方法，可用于分析RAPA靶向制劑對(duì)泡沫細(xì)胞的靶向作用，為RAPA靶向制劑用于治療AS的研究奠定了基礎(chǔ)。

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Establishment and Application of HPLC Method for Content Determination of Rapamycin in Human Monocyte THP-1 Derived Foam Cells

HU Huazhong1，WANG Zhongping2，CHEN Yiqing2，ZHU Qiulian1，LIN Caiyan1，YAN Pengke1（1.Dept.of Pharmacy，the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510510，China；2.Guangzhou Tongpeng Zhongxu Pharmaceutical Technology Co.，Ltd.，Guangzhou 510510，China）

OBJECTIVE：To establish the method for the content determination of rapamycin（RAPA）in human monocyte THP-1 derived foam cells，and to study the effects of RAPA targeting preparation（RAPA-NP-Apt）targeting at foam cells.METHODS：Foam cells model were established through THP-1 cells were induced by oxidized low density lipoprotein.Foam cells were incubated with 200 ng/mL RAPA or 200，400，800 ng/mL RAPA-NP-Apt for 60 min.The content of RAPA was determined by HPLC.The determination was performed on Diamonsil C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-water（90∶10，V/V）at flow rate of 1.0 mL/min.The column temperature was set at 40℃，and the detection wavelength was 278 nm.The sample size was 20 μL.RESULTS：The concentration of RAPA ranged 50-6 400 ng/mL（r＝0.999 96）with average recovery of 98.72%（RSD＝0.62%，n＝3）.RSDs of inter-day and intra-day were not more than 6.15%（n＝6），RSD of stability was lower than 2%（n＝6），and RSD of repeatability was 1.64%（n＝6）.After foam cells were incubated with RAPA or low-concentration，medium-concentration and high-concentration of RAPA-NP-Apt，the contents of RAPA were 12，43，98，140 ng/106cells.CONCLUSIONS：The method is simple，stable and reproducible.It can be used for content determination of RAPA in foam cells.RAPA-NP-Apt can improve the effects of RAPA targeting at foam cells.

HPLC；Rapamycin；Content determination；Targeting medicine；Foam cells

R927.2

A

1001-0408（2017）01-0043-03

2016-05-16

2016-07-17）

（編輯：鄒麗娟）

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2013B021800192）；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2013J4100040）

＊碩士研究生。研究方向：動(dòng)脈粥樣硬化。電話：020-62784060。E-mail：2012386379@qq.com

#通信作者：主任藥師，教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制與藥物干預(yù)。E-mail：yanpk988@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.01.11