RasGRP1基因多態(tài)與蘇淮豬體尺性狀關聯(lián)分析

*0070；2.生豬健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 0070；.南京農(nóng)業(yè)大學養(yǎng)豬研究所，江蘇 南京 210095；.淮安市淮陰種豬場，江蘇 淮安 2222）

RasGRP1基因多態(tài)與蘇淮豬體尺性狀關聯(lián)分析

吳 慧1，2，黃瑞華3，李平華3，周 煉1，2，傅道斌4，李 強4，李新云1，2*，趙書紅1，2
（1.華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，湖北 武漢
430070；2.生豬健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430070；3.南京農(nóng)業(yè)大學養(yǎng)豬研究所，江蘇 南京 210095；4.淮安市淮陰種豬場，江蘇 淮安 223322）

欄目協(xié)辦

蘇淮豬是我國培育的一個優(yōu)良品種，具有肉質(zhì)好、抗逆性強等優(yōu)良特性，但生長相對較慢，瘦肉率偏低，導致養(yǎng)殖效益偏低，改良其體型、生長等性能指標對蘇淮豬的推廣具有重要意義。該實驗中首先測量了354頭蘇淮母豬的部分體尺，對其體尺性狀進行了表型相關分析。性狀相關分析結果表明蘇淮母豬體長與體高、胸圍、腹圍、管圍極顯著相關（P＜0.01）；體高與體長、胸圍、腹圍、腿臀圍極顯著相關（P＜0.01）；胸圍與體長、體高、腹圍、腿臀圍極顯著相關（P＜0.01）；腹圍與體長、體高、胸圍、腿臀圍極顯著相關（P＜0.01）；管圍與體長極顯著相關（P＜0.01）；腿臀圍與體高、胸圍、腹圍極顯著相關（P＜0.01）。利用網(wǎng)上已有的豬基因組測序數(shù)據(jù)，對RasGRP1基因進行了選擇信號分析，結果表明RasGRP1基因在西方豬種中受到高強度選擇。通過對RasGRP1基因啟動子區(qū)域G/A多態(tài)位點進行PCR-RFLP分型，結果表明，在蘇淮母豬群體中存在多態(tài)，其中A等位基因頻率為0.672 3，為優(yōu)勢等位基因；關聯(lián)分析結果顯示RasGRP1基因G/A多態(tài)與蘇淮母豬體高呈顯著關聯(lián)（P＜0.05），與管圍關聯(lián)接近顯著（P=0.054 8）。其中，AG型個體的體高及管圍性狀均值均高于GG型個體（P＜0.05），但AA和GG個體間差異不顯著（P＞0.05），這表明該位點對體尺性狀的效應主要是由非加性效應導致的。該實驗結果為蘇淮母豬種質(zhì)特性研究提供了基礎數(shù)據(jù)。

蘇淮豬；RasGRP1基因；SNP；體尺性狀；關聯(lián)分析

蘇淮豬的前身是新淮豬，是將新淮母豬與大白公豬雜交，在F2代中選擇黑豬組建零世代基礎群，然后經(jīng)7個世代選育而成的[1]。蘇淮豬具有耐粗飼、飼喂成本低、抗病能力強、適應性強、肉質(zhì)鮮美等優(yōu)點，被專家們稱為“中國的杜洛克”[2]，但蘇淮豬也有瘦肉率相對較低，生長速度相對緩慢的缺點。改良蘇淮豬的生長、胴體及體型性狀將有利于提升蘇淮豬的經(jīng)濟價值，強化其品種特性。

選擇性清掃（selective sweep）是定位受選擇重要經(jīng)濟性狀相關基因的重要方法。在西方豬種培育過程中，其生長、體型、胴體等性狀受到長期人工定向選擇，通過選擇信號分析能鑒定出這些性狀主效基因。本實驗中對西方商品豬進行了選擇性清掃分析，結果發(fā)現(xiàn)RasGRP1基因受到高強度選擇。RasGRP1為Ras的激活蛋白，屬于小G蛋白Ras鳥嘌呤核苷酸交換因子（gua nine nucleotide exchange factors，GEFs）家族中的一員，該家族包括RasGRP1到RasGRP4四個成員。RasGRP1主要表達于T細胞和胸腺細胞。Ras蛋白家族是多種細胞信號通路的開關，參與調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡、分化等過程[3]。研究表明RasGRP1缺陷的小鼠表現(xiàn)出嚴重的胸腺發(fā)育停滯[4]。已有研究表明RasGRP1主要在機體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，但該基因在其他組織器官中的作用研究的還較少。此外，已有部分研究表明免疫和生長存在互作[5-6]。目前，RasGRP1基因在豬生長及體尺性狀中的作用研究還未見報道。

本試驗測量了354頭蘇淮母豬體尺數(shù)據(jù)，對體尺性狀間進行了相關分析；同時在蘇淮母豬群體中，對RasGRP1基因啟動子區(qū)域一個受選擇的多態(tài)位點進行了基因型檢測及性狀關聯(lián)分析。本試驗結果為蘇淮豬種質(zhì)特性研究提供了基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料收集

本研究收集354頭蘇淮母豬體尺數(shù)據(jù)，采用基因組提取試劑盒（TIANGEN）提取DNA。該母豬群體擁有詳細的系譜資料，飼喂的營養(yǎng)標準和環(huán)境條件一致。測定性狀包括體長、體高、胸圍、腹圍、管圍與腿臀圍。所有測量值均校正到220日齡。

1.2 選擇性清掃信號分析

利用29頭西方商品豬種和21頭中國地方豬的全基因組重測序數(shù)據(jù)進行選擇性清掃分析[7-8]，具體算法參照已發(fā)表文獻中的方法[9]。

1.3 引物設計

根據(jù)Ensemble中ID為ENSSSCG00000004791豬RasGRP1基 因 序列，使用Primer Premier 5.0設計引物，設計引物如下，擴增RasGRP1基因啟動子區(qū)域371 bp片段。Primer-F： 5’-AAGATCACAGAATCCTTAGTCAAAT-3’；Primer-R：5’-G T T G C T T T G C T T T T CCCTTC-3’。引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成備用。

1.4 PCR擴增及PCR-RFLP方法進行基因分型

PCR擴增體系(10 μL)：DNA模板(50 ng/μL) 1 μL，PCR mix 5 μL，正反向引物各0.2 μL，加滅菌雙蒸水補足至10 μL。PCR反應程序為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火溫度30 s，72 ℃延伸25 s，循環(huán)數(shù)35個，72 ℃終延伸5 min，15 ℃保存2 min后停止反應。

1.5 數(shù)據(jù)分析

性狀間相關分析使用SPSS 2.0軟件。使用T檢驗對相關系數(shù)進行顯著性檢驗。性狀關聯(lián)分析使用SAS 9.2軟件，數(shù)學模型如下：

其中：Y為表型值；X為固定效應關聯(lián)矩陣；β為固定效應參數(shù)向量，包括基因型效應、公畜效應、公畜內(nèi)母畜效應；e為隨機殘差效應。

2 結果與分析

2.1 蘇淮母豬體尺性狀測定及性狀間相關分析

對蘇淮母豬體尺性狀進行了測定，測定結果均校正到220日齡，結果表明蘇淮母豬體長為（109.58±5.56）cm； 體 高 為（58.71±3.36）cm；胸 圍 為（102.85±8.00）cm； 腹圍 為（117.12±6.89）cm； 管 圍為（16.10±0.94）cm；腿 臀 圍 為（79.66±5.90）cm（表1）。相關分析結果表明蘇淮母豬體長與體高、胸圍、腹圍、管圍極顯著相關（P＜0.01）；體高與體長、胸圍、腹圍、腿臀圍極顯著相關（P＜0.01）；胸圍與體長、體高、腹圍、腿臀圍極顯著相關（P＜0.01）；腹圍與體長、體高、胸圍、腿臀圍極顯著相關（P＜0.01）；管圍與體長極顯著相關（P＜0.01）；腿臀圍與體高、胸圍、腹圍極顯著相關（P＜0.01）（表2）。

圖1 RasGRP1基因選擇信號分析（星號下為rs330828410SNP位點）

表1 蘇淮母豬體尺性狀均值

表2 蘇淮母豬體尺性狀相關分析

2.2 選擇信號分析與PCR-RFLP結果

西方豬種選擇信號分析結果發(fā)現(xiàn)，RasGRP1基因區(qū)域在中外豬種中的分化程度（0.55）高于全基因組顯著水平（0.2）。其中1號染色體148 271 478處（Ensemble Variant ID rs330828410）存在一個A＞G（星號標識）多態(tài)（圖1a，b），這個多態(tài)位點位于RasGRP1基因啟動子區(qū)域，造成一個PsiI酶切位點。RasGRP1基因酶切后存在3種基因型（圖2）。

圖2 RasGRP1基因SNP位點PsiI酶切判型結果

2.3 RasGRP1 A＞G SNP位點與蘇淮母豬體尺性狀關聯(lián)分析

對354頭蘇淮母豬進行了基因型分析，其中AA型168頭，AG型140頭，GG型46頭。A基因頻率為0.672 3，為優(yōu)勢等位基因。關聯(lián)分析結果顯示，該位點與蘇淮豬體高呈顯著關聯(lián)（P＜0.05），與管圍關聯(lián)接近顯著（P=0.054 8），其中，AG型個體的體高及管圍性狀均值均顯著高于GG型個體（P＜0.05），但AA和GG個體間差異不顯著（P＞0.05）。該位點與其他體尺性狀關聯(lián)不顯著（表3）。

3 討論

本研究測定了蘇淮母豬的體尺性狀，并分析了各個體尺性狀間的相關。根據(jù)本研究結果，大部分體尺性狀存在表型相關，這也是合乎邏輯的，體尺性狀主要取決于骨骼生長，而全身的骨骼是一個整體，因此會存在相關。根據(jù)本文的研究，我們認為如果需要改良蘇淮豬的體型，可以主選1～2個體尺性狀即可達到目的。

表3 RasGRP1基因G/A SNP位點與蘇淮母豬體尺性狀的關聯(lián)分析結果

選擇性清掃分析是鑒定養(yǎng)殖動物重要經(jīng)濟性狀主效基因的主要方法，目前已有多篇文獻報道運用此方法鑒定了動物經(jīng)濟性狀主效基因[10-12]。眾所周知，西方豬種在培育的過程中，其生長、體型及胴體等性狀受到長期定向人工選擇，導致西方豬種和中國地方品種在體型、生長方面存在很大差異，因此，通過選擇信號分析有利于發(fā)現(xiàn)與上述性狀的重要候選基因。本研究中，利用全基因組選擇性清掃分析發(fā)現(xiàn)RasGRP1基因在西方豬種中受到高強度選擇，最終選擇了啟動子區(qū)域的一個SNP位點進行后續(xù)研究，該SNP位于轉(zhuǎn)錄因子NR3C1的核心motif（TGTACAGATTGTAAA）中，該SNP可能影響NR3C1轉(zhuǎn)錄因子的結合，很可能是該選擇信號區(qū)域的致因突變，故我們選擇了這個SNP進行關聯(lián)分析研究。

基因頻率分析結果表明RasGRP1基因的A等位基因是優(yōu)勢等位基因。根據(jù)全基因組選擇分析可以發(fā)現(xiàn)A等位基因主要是存在西方豬種中，而蘇淮豬中含有75%的大白豬血液，推測這是導致A等位基因為優(yōu)勢等位基因的主要原因。性狀關聯(lián)分析結果表明，RasGRP1基因多態(tài)與蘇淮母豬體高顯著關聯(lián)，與管圍關聯(lián)接近顯著。這表明RasGRP1基因能夠影響蘇淮母豬的體尺性狀。目前的研究表明RasGRP1基因主要在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮作用[13]，而許多研究表明生長與免疫存在互作。Williams等人發(fā)現(xiàn)減少豬只與病原接觸，抑制免疫系統(tǒng)激活，能夠促進機體生長、提高飼料利用效率[5]。因此，我們推測RasGRP1基因可能會通過機體免疫系統(tǒng)間接影響體尺性狀。另外，我們發(fā)現(xiàn)RasGRP1基因兩種純合子間體高和管圍性狀差異均不顯著，而雜合子均值大于兩純合子。這表明該基因的效應主要是由非加性效應導致的，非加性效應是形成雜種優(yōu)勢的一個重要原因，因此該基因的雜合子高于兩純合子可能是由于非加性效應導致的雜種優(yōu)勢。非加性效應形成的機理非常復雜，需要進一步研究。盡管非加性效應在目前的育種中很難利用，但是非加性效應是遺傳方差的重要組成部分，也是導致群體遺傳變異的重要因素，因此，也是需要深入研究的。另外，根據(jù)雜種優(yōu)勢，也可以安排合理的雜交生產(chǎn)，提高生產(chǎn)效益。

綜上所述，本實驗測量了354頭蘇淮母豬體尺數(shù)據(jù)，對體尺表型進行了性狀間相關分析，并在蘇淮母豬群體中進行了性狀關聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)RasGRP1基因能夠影響蘇淮母豬體尺性狀，并鑒定了一個關鍵的多態(tài)位點。

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2016-12-05）

國家自然科學基金（31372291）

吳慧，華中農(nóng)業(yè)大學碩士研究生，主要從事動物分子育種方向的研究，E-mail：wuhuixqh@163.com

李新云，華中農(nóng)業(yè)大學教授，博士生導師，研究方向為豬骨骼肌生長發(fā)育的分子機理，E-mail：hzaulxy@163.com