陸地棉轉(zhuǎn)錄因子GhNAC7的克隆及功能分析

鄭學(xué)偉，SHAH Syed Tariq，范術(shù)麗，魏恒玲，龐朝友，李鴻彬，喻樹迅

（1石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子 832000；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南安陽(yáng) 455000）

陸地棉轉(zhuǎn)錄因子GhNAC7的克隆及功能分析

鄭學(xué)偉1,2，SHAH Syed Tariq2，范術(shù)麗2，魏恒玲2，龐朝友2，李鴻彬1，喻樹迅2

（1石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子 832000；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南安陽(yáng) 455000）

【目的】從陸地棉中克隆GhNAC7，分析其結(jié)構(gòu)和功能，研究其在棉花不同組織中以及葉片不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量。并轉(zhuǎn)入擬南芥進(jìn)一步探究其在棉花葉片衰老過程中的作用?！痉椒ā坷弥袊?guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建立的棉花衰老葉片cDNA文庫(kù)中的序列，獲得1個(gè)含有NAM結(jié)構(gòu)域的EST，使用Oligo 6.71設(shè)計(jì)引物，重新在陸地棉葉片cDNA中進(jìn)行克隆。使用Gene Structure Display Server軟件分析GhNAC7結(jié)構(gòu)，使用在線工具PlantCARE分析啟動(dòng)子序列，利用在線工具GenScan進(jìn)行氨基酸序列翻譯。同時(shí)，利用擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（TAIR）進(jìn)行序列比對(duì)，選取得分較高的NAC家族基因，使用MEGA 6.06軟件和GeneDoc軟件進(jìn)行進(jìn)化樹分析和氨基酸比對(duì)。以XbaⅠ和SacⅠ為酶切位點(diǎn)構(gòu)建35S::GhNAC7-GFP融合表達(dá)載體，分析其在洋蔥表皮細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)，進(jìn)行亞細(xì)胞定位。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析GhNAC7在棉花不同組織、不同葉片發(fā)育時(shí)期以及在200 μmol·L-1ABA調(diào)控下的表達(dá)量。通過構(gòu)建pGhNAC7-GUS融合表達(dá)載體并轉(zhuǎn)擬南芥，分析其啟動(dòng)子特異性。以EcoRⅠ和SalⅠ為酶切位點(diǎn)，利用pBI101和pBI121載體，分別構(gòu)建融合表達(dá)載體并轉(zhuǎn)擬南芥進(jìn)行過表達(dá)分析?！窘Y(jié)果】從陸地棉中成功克隆GhNAC7，其全長(zhǎng)為1 064 bp，包含3個(gè)外顯子，2個(gè)內(nèi)含子。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，GhNAC7開放閱讀框?yàn)?34 bp，可編碼277個(gè)氨基酸，其蛋白質(zhì)分子量為31.35 kD，等電點(diǎn)為9.22。結(jié)構(gòu)域分析表明其屬于NAC轉(zhuǎn)錄因子的NAM亞家族，進(jìn)化樹分析顯示GhNAC7與ANAC041、ANAC083同源性最高，其中，GhNAC7與ANAC083結(jié)構(gòu)域位置均為17—58 aa。其啟動(dòng)子核心元件包含一系列與衰老、激素、脅迫相關(guān)的順式作用元件。亞細(xì)胞定位表明其蛋白為核蛋白。組織特異性表明GhNAC7在真葉、子葉、花、花藥和衰老真葉中均明顯表達(dá)，其中在衰老的真葉中表達(dá)量最高。啟動(dòng)子特異性分析表明，其GUS活性在衰老的葉片中最強(qiáng)。在擬南芥中過表達(dá)該基因，轉(zhuǎn)基因植株比野生型表現(xiàn)出明顯的衰老癥狀。熒光定量PCR分析表明，ABA處理后6 h GhNAC7明顯上調(diào)表達(dá)，并在48 h表達(dá)量達(dá)到最高，這表明ABA可調(diào)控GhNAC7表達(dá)從而調(diào)節(jié)棉花葉片衰老?！窘Y(jié)論】GhNAC7可以促進(jìn)棉花葉片衰老并受ABA的調(diào)控。

陸地棉；NAM結(jié)構(gòu)域；葉片衰老；GhNAC7；過表達(dá)

0 引言

【研究意義】棉花作為世界上種植最為廣泛的農(nóng)作物之一，其纖維是紡織工業(yè)中應(yīng)用最普遍的天然纖維。但是，棉花在實(shí)際種植過程中受各種環(huán)境因素的影響（例如干旱、鹽脅迫、黃萎病等），嚴(yán)重影響了棉花纖維的質(zhì)量和產(chǎn)量。越來越多的研究表明 NAC家族轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與各種脅迫過程，并發(fā)揮著顯著作用[1-4]，NAC家族轉(zhuǎn)錄因子也參與一些高度復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，并對(duì)環(huán)境信號(hào)和多種生長(zhǎng)發(fā)育過程進(jìn)行有效整合，進(jìn)而調(diào)節(jié)葉片衰老[5]。因此，開展棉花特別是陸地棉 NAC基因的功能研究顯得格外重要?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】NAC轉(zhuǎn)錄因子廣泛分布于陸生植物中，它是植物中所特有的具有多種生物功能的轉(zhuǎn)錄因子。隨著SOUER等[6]從矮牽牛中成功克隆到第一個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子NAM，越來越多的NAC家族轉(zhuǎn)錄因子在不同植物中被報(bào)道。擬南芥中包含138個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子，水稻中有158個(gè)，狗尾草中有149個(gè)，三葉楊中有 289個(gè)[7]，其他植物（如大麥、玉米、柑橘南瓜、甘蔗、陸地棉、小麥等）中也發(fā)現(xiàn)了 NAC基因家族相關(guān)基因。因此，NAC家族轉(zhuǎn)錄因子被認(rèn)為是植物中最大轉(zhuǎn)錄因子家族之一[8]。NAC轉(zhuǎn)錄因子具有多種功能，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、逆境脅迫應(yīng)答和激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程中具有重要作用[9]。GhNAP可以緩解atnap突變體的延遲衰老，引起擬南芥早衰。在棉花中，GhNAP的下調(diào)延遲了葉片衰老。同時(shí)，GhNAP受ABA的誘導(dǎo)表達(dá)并通過 ABA調(diào)控途徑調(diào)節(jié)葉片衰老[10]。EVANS等[11]研究還發(fā)現(xiàn)GhNAC18受水楊酸、茉莉酸甲酯和乙烯誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，但是在脫落酸的誘導(dǎo)下卻下調(diào)表達(dá)。脅迫處理中，在干旱，過氧化氫，低溫（4℃）下其表達(dá)上調(diào)，但是在鹽脅迫中表達(dá)受到抑制。有趣的是，GhNAC18的轉(zhuǎn)錄激活功能在衰老葉片中受到抑制，其表達(dá)量下降，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其在衰老的起始階段發(fā)揮著重要作用。研究證實(shí)，GhATAF1在非

生物脅迫中發(fā)揮著重要作用，其在ABA、冷脅迫和鹽脅迫的調(diào)控下上調(diào)表達(dá)。GhATAF1也受茉莉酸，水楊酸和黃萎病菌的誘導(dǎo)表達(dá)，這暗示了其不僅參與非生物脅迫，而且參與了生物脅迫過程。此外，過表達(dá)GhATAF1增加了棉花對(duì)黃萎病和灰霉病的易感性，并伴隨著茉莉酸介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的抑制和水楊酸介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的激活[12]。同樣，SlNAC35表達(dá)受干旱脅迫、鹽脅迫、細(xì)菌病原體和信號(hào)分子誘導(dǎo)，暗示其與生物和非生物刺激相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)SlNAC35可以通過調(diào)節(jié)NtARF的表達(dá)，從而促進(jìn)根的生長(zhǎng)發(fā)育[13]。NIU等[14]發(fā)現(xiàn)BnaNAC55能夠激活一些與活性氧和防御有關(guān)基因的表達(dá)。無(wú)論是在油菜和本氏煙草中表達(dá)BnaNAC55，都會(huì)導(dǎo)致ROS積累，并最終導(dǎo)致植物過敏性細(xì)胞死亡。值得關(guān)注的是，大麥中HvNAC005與發(fā)育衰老相關(guān)，是大麥衰老的正調(diào)節(jié)因子，且在ABA處理下，受其啟動(dòng)子中 ABA介導(dǎo)的元件的響應(yīng)，其表達(dá)明顯上調(diào)[15]。此外，水稻OsNAC6[16]和SNAC2[17]、辣椒 CaNAC1[18]、擬南芥 NAC1[19]等基因在相關(guān)植物脅迫應(yīng)答和生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】NAC家族轉(zhuǎn)錄因子功能在擬南芥、水稻等植物中被廣泛的研究，但是對(duì)于棉花尤其是陸地棉相關(guān)的NAC家族轉(zhuǎn)錄因子研究卻很少，而關(guān)于調(diào)節(jié)衰老相關(guān)的 NAC基因更是鮮有報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究從陸地棉中克隆獲得一個(gè)全新的 NAC基因——GhNAC7，進(jìn)一步分析其在棉花葉片衰老中的作用，為進(jìn)一步研究其參與葉片衰老的機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為其他棉花 NAC轉(zhuǎn)錄因子基因的后續(xù)深入研究提供重要的借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為中棉所10號(hào)（CCRI 10），于2013年4月種植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所白壁鎮(zhèn)試驗(yàn)田，田間采用常規(guī)大田管理。

溫室試驗(yàn)處理所用材料中棉所 10號(hào)和擬南芥于2013年6月均種植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室溫室，試驗(yàn)條件分別設(shè)置為25℃，光照16 h/黑暗8 h；22℃，光照16 h/黑暗8 h。

1.2 試驗(yàn)處理及取樣

大田棉花分別取花、花藥、纖維（0、5、10、15、20和25DPA）、子葉、真葉、衰老葉片、根和莖為試驗(yàn)材料，每種樣品3個(gè)重復(fù)，所取樣品均用液氮迅速冷凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

溫室樣品選取長(zhǎng)勢(shì)一致的中棉所 10號(hào)棉花幼苗進(jìn)行處理。其中，用200 μmol·L-1脫落酸（ABA）進(jìn)行噴灑葉片處理。溫室樣品處理時(shí)均以無(wú)菌水處理的棉花幼苗為空白對(duì)照。分別在處理后 6、12、24、36和48 h取子葉。所取樣品迅速用液氮冷凍，-80℃保存用于提取DNA和RNA。

為研究GhNAC7在自然衰老中的表達(dá)情況，從棉花材料中棉所10號(hào)的七葉期開始進(jìn)行統(tǒng)一掛牌，選取葉片生長(zhǎng)發(fā)育過程的5個(gè)時(shí)期作為研究對(duì)象，為了便于研究，將衰老子葉和葉片的5個(gè)發(fā)育時(shí)期分為以下5個(gè)階段，不衰老期（non-senesent，NS）、衰老初始期（initial-senescent，IS，葉片衰老面積大于10%）、衰老早期（early-senescent，ES，葉片衰老面積小于30%）、衰老晚期（late-senescent，LS，葉片衰老面積大于 50%）和完全衰老期（completely-senescent，CS，葉片衰老面積大于90%），在葉綠素測(cè)定和基因表達(dá)分析中，以NS作為對(duì)照組。

1.3 DNA和RNA的提取

采用改良的CTAB方法[20]提取樣品DNA，-20℃保存?zhèn)溆茫捎迷噭┖校ㄌ旄萍加邢薰荆ū本┑腞NAprep Pure Plant Kit(DP441)）提取全RNA，方法完全參照說明書進(jìn)行，-80℃保存?zhèn)溆?。cDNA反轉(zhuǎn)錄選用 PrimeScript First-Strand cDNA Synthesis Super Mix（TaKaRa，Japan）試劑盒進(jìn)行。

1.4 GhNAC7的克隆及生物信息學(xué)分析

通過對(duì)實(shí)驗(yàn)室自建的棉花衰老葉片cDNA文庫(kù)測(cè)序，獲得1個(gè)含有NAM結(jié)構(gòu)域的NAC轉(zhuǎn)錄因子的EST（未公布），與雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii）D 基因組（http://cgp.genomics.org.cn/page/species/ download.jsp）比對(duì)，并設(shè)計(jì)引物（表1），以陸地棉葉片cDNA為模板，利用基于PCR的改良染色體步移法[21]擴(kuò)增啟動(dòng)子，擴(kuò)增程序?yàn)?4℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)檢測(cè)、純化后，與克隆載體pMD18-T（TaKaRa，Japan）連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，然后挑取單克隆進(jìn)行測(cè)序。DNA測(cè)序和引物合成均由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

使用 Oligo 6.71設(shè)計(jì)引物（表 1）。使用 Gene Structure Display Server(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析GhNAC7結(jié)構(gòu)[22]，利用NCBI在線工具ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）查找GhNAC7的ORF。利用在線工具GenScan（http://genes. mit.edu/GENSCAN.html）進(jìn)行氨基酸序列翻譯。通過在線工具 Compute pI/Mw（http://web.expasy.org/ compute_pi/）預(yù)測(cè)其蛋白分子量和等電點(diǎn)。使用在線工具 PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html/）對(duì)其啟動(dòng)子進(jìn)行分析。利用美國(guó)擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（TAIR，http://www. arabidopsis.org/）進(jìn)行BLAST分析。氨基酸序列比對(duì)利用GeneDoc軟件，進(jìn)化樹的構(gòu)建利用MEGA 6.06軟件，采用ClustalW法進(jìn)行比對(duì)，并使用Neighborjoining方法構(gòu)建進(jìn)化樹。

表1 本研究中的引物Table 1 The primer sequences in this study

1.5 熒光定量PCR

以Ghactin為內(nèi)參基因，并設(shè)計(jì)引物（表1）。以反轉(zhuǎn)錄 cDNA為模板，利用 ABI 7500系統(tǒng)（Applied Biosystems，美國(guó)），選用 UltraSYBR Mixture（With ROX）（康為，北京）試劑盒進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)，反應(yīng)體系和步驟按照SYBR GreenⅠ的說明書進(jìn)行，GhNAC7相對(duì)表達(dá)量利用 2-ΔΔCt方法計(jì)算。

1.6 葉綠素濃度測(cè)定

葉綠素的測(cè)定參照LICHTENTHALER[23]的方法，將樣品浸泡于80%丙酮中，置于4℃，黑暗處理48 h。取出后輕搖3 min，分別在波長(zhǎng)為663和645 nm測(cè)定吸光度。根據(jù)以下公式計(jì)算濃度：

1.7 亞細(xì)胞定位

參照SHAH等[4]方法進(jìn)行GhNAC7亞細(xì)胞定位，用 XbaⅠ和 SacⅠ分別對(duì)測(cè)序正確的 GhNAC7和pBI121載體進(jìn)行雙酶切，并使用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建 35S::GhNAC7-GFP融合表達(dá)載體，同時(shí)以35S::GFP載體為空白對(duì)照。通過凍融法將載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞，利用卡那霉素和PCR進(jìn)行陽(yáng)性菌液篩選，篩選出的陽(yáng)性菌在LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)搖至OD600值為0.6，然后侵染洋蔥表皮30 min，無(wú)菌濾紙吸凈表面菌液于暗處在 1/2MS培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，培養(yǎng)溫度設(shè)置為25℃。

1.8 GhNAC7啟動(dòng)子的特異性分析

按照1.7方法同時(shí)構(gòu)建pGhNAC7-GUS融合表達(dá)載體。將構(gòu)建好的融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)入擬南芥，鑒定轉(zhuǎn)基因擬南芥，取葉片、莖、花和根，分別置于 GUS染色液中，37℃培養(yǎng)箱中溫育過夜。將浸染過的樣品轉(zhuǎn)入70%酒精中脫色2—3次，至陰性對(duì)照材料呈白色，然后置于體式鏡下觀察拍照。

1.9 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化

使用EcoRⅠ和SalⅠ分別對(duì)測(cè)序正確的GhNAC7和pBI101雙元載體進(jìn)行酶切，用T4連接酶連接過夜，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，挑取單克隆，測(cè)序后提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性菌落。將以上2種轉(zhuǎn)化后的含有正確質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥，步驟如下：（1）將農(nóng)桿菌接種到LB培養(yǎng)基（50 μg·mL-1卡那霉素、50 μg·mL-1鏈霉素和25 μg·mL-1利福平）中，25℃，175 r/min震蕩過夜。（2）擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600=1.3，500 r/min離心15 min，并收集菌體。（3）將收集的菌體重懸于滲透液（5%蔗糖、121℃滅菌15 min，加重濃度0.02%的SilwettL-77），以滲透液為參照，調(diào)節(jié)OD600至0.8—1.0。（4）將擬南芥的花在重懸液中浸染30—50 s，浸染后的擬南芥置于暗處培養(yǎng)24 h。然后在長(zhǎng)日照下培養(yǎng)，直至收種子。

轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選參照張文香等[24]方法。

2 結(jié)果

2.1 GhNAC7及其啟動(dòng)子的生物信息學(xué)分析

根據(jù)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建立的棉花衰老葉片 cDNA文庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)測(cè)序獲得1 064 bp序列（GenBank：JX155857.1），并依序?qū)⑵涿麨?GhNAC7。使用 Gene Structure Display Server對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，其包含3個(gè)外顯子，2個(gè)內(nèi)含子，其ORF為834 bp（圖1）。其啟動(dòng)子包含一系列的順式作用元件（圖 2）。其中，激素響應(yīng)元件包括ABA響應(yīng)元件ABRE、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件CGTCA和TGACG。脅迫響應(yīng)元件包括熱脅迫元件HSE、低溫脅迫響應(yīng)元件LTR和干旱脅迫誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)MBS。與衰老相關(guān)的G-box元件，涉及晝夜節(jié)律控制的調(diào)控元件circadian以及響應(yīng)光照的順式作用元件Gap-box、I-box和Sp1等。這些激素、脅迫和衰老相關(guān)的順式作用元件預(yù)示著GhNAC7參與棉花逆境響應(yīng)和衰老過程，并發(fā)揮重要作用。

圖1 GhNAC7結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1 Schematic representation of the genomic DNA structure of GhNAC7

2.2 GhNAC7蛋白結(jié)構(gòu)及進(jìn)化樹分析

由 GenScan在線預(yù)測(cè)編碼氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)GhNAC7共編碼277個(gè)氨基酸，進(jìn)一步分析，可知其蛋白分子質(zhì)量約為31.35 kD，等電點(diǎn)為9.22，結(jié)構(gòu)域分析表明GhNAC7含有一個(gè)NAM結(jié)構(gòu)域，屬于NAM亞家族。使用GhNAC7全長(zhǎng)CDS在TAIR中進(jìn)行比對(duì)，選取得分較高的NAC家族基因（圖3-A），利用MEGA 6.06軟件并結(jié)合GeneDoc軟件，對(duì)GhNAC7構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，GhNAC7與ANAC041、ANAC083同源性最高（圖3-A）。對(duì)三者氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，其保守結(jié)構(gòu)域A、B、C、D、E 5個(gè)部分如圖所示（圖3-B）。結(jié)果表明，3種蛋白N末端表現(xiàn)出高度的相似性，然而其 C末端表現(xiàn)出明顯的差異。其中，GhNAC7與ANAC083同源性最高，其結(jié)構(gòu)域位置均為17—58 aa（圖3-B），預(yù)示GhNAC7蛋白在植物生長(zhǎng)過程中與ANAC083發(fā)揮著相似或相近的生物學(xué)功能。

圖2 GhNAC7啟動(dòng)子分析示意圖Fig. 2 Schematic representation of GhNAC7 promoter

圖3 GhNAC7的聚類分析和氨基酸序列比對(duì)Fig. 3 Cluster analysis of GhNAC7 and Sequence alignment of amino acids

2.3 GhNAC7蛋白的亞細(xì)胞定位

將構(gòu)建的 35S::GhNAC7-GFP融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到洋蔥表皮細(xì)胞，暗處培養(yǎng)12 h后，利用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察綠色熒光在細(xì)胞中的分布（圖 4），只在細(xì)胞核中觀察到綠色熒光，說明GhNAC7被定位在細(xì)胞核中；然而，作為對(duì)照組，綠色熒光則分布在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。這也說明了GhNAC7啟動(dòng)子具有轉(zhuǎn)錄激活活性，進(jìn)一步說明GhNAC7只作用于細(xì)胞核，屬于核蛋白。

2.4 GhNAC7在陸地棉中的表達(dá)模式分析

通過研究 GhNAC7在不同組織中的表達(dá)情況（圖5-A），發(fā)現(xiàn)GhNAC7在不同組織中表達(dá)情況與先前報(bào)道的 GhNAC家族基因表達(dá)相似[25]。GhNAC7在纖維中幾乎不表達(dá)，在根、莖、花藥中少量表達(dá)，在真葉、子葉、衰老葉片和花中表達(dá)量較高，尤其在子葉和衰老葉片中表達(dá)較明顯。為了進(jìn)一步闡明 GhNAC7在子葉和衰老葉片中的表達(dá)情況，分別取正常衰老的真葉和子葉對(duì) GhNAC7的表達(dá)量進(jìn)行分析（圖 5-B、5-C），結(jié)果表明，在2種組織中GhNAC7隨著衰老程度的加深，其表達(dá)量增加。在子葉和真葉完全衰老時(shí)，其表達(dá)量達(dá)到最大，尤其是在完全衰老的真葉中，其表達(dá)量約是不衰老的 50倍之多，說明該基因在葉片衰老過程中有重要作用。

圖4 GhNAC7蛋白亞細(xì)胞中定位分析Fig. 4 Subcellular localizations of GhNAC7 protein in onion epidermis cells

圖5 GhNAC7的表達(dá)分析Fig. 5 Expression analysis of GhNAC7 gene in cotton

2.5 GhNAC7啟動(dòng)子特異性分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證GhNAC7的組織特異性，通過構(gòu)建pGhNAC7::GUS融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥，并對(duì)轉(zhuǎn)基因株系各部分組織進(jìn)行GUS染色。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片和根中均檢測(cè)到GUS活性（圖6-B和圖6-C），其中，莖生綠葉和根中GUS活性比較微弱，然而在衰老葉片中，其GUS活性最強(qiáng)。而在莖和幼葉、花和種皮中沒有檢測(cè)到GUS活性（圖6-A）。

2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥過表達(dá)分析

為研究GhNAC7在植物生長(zhǎng)過程中可能的生物學(xué)功能，構(gòu)建GhNAC7植物過表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化擬南芥進(jìn)行表型分析。2個(gè)載體各篩選出5株轉(zhuǎn)基因株系，進(jìn)行鑒定（圖7）。與野生型植株相比，pBI101載體的過表達(dá)株系葉片出現(xiàn)衰老現(xiàn)象（圖8-A—圖8-C），且觀察發(fā)現(xiàn)，衰老首先在蓮座葉出現(xiàn)，隨后出現(xiàn)在莖生葉中。而pBI121載體的過表達(dá)株系也同樣出現(xiàn)了葉片衰老（圖8-D—圖8-F）。說明GhNAC7可以促進(jìn)擬南芥葉片衰老。

2.7 ABA對(duì)GhNAC7的調(diào)控分析

通過對(duì)噴施200 μmol·L-1ABA 6 h后的棉花幼苗子葉進(jìn)行熒光定量PCR分析（圖9），在ABA處理下GhNAC7表達(dá)量顯著高調(diào)，且在處理后48 h達(dá)到最大值。結(jié)果表明，ABA調(diào)控GhNAC7，從而調(diào)節(jié)棉花葉片的衰老。

圖6 轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS組織染色Fig. 6 GUS analysis of pGhNAC7::GUS in transgenic Arabidopsis

圖7 轉(zhuǎn)基因擬南芥DNA檢測(cè)Fig. 7 DNA identification of transgenic Arabidopsis

3 討論

NAC家族轉(zhuǎn)錄因子是植物中主要的調(diào)節(jié)因子，其功能在擬南芥、水稻等植物中被廣泛的研究，它在調(diào)節(jié)脅迫應(yīng)答和植物生長(zhǎng)過程中發(fā)揮著重要的作用[26]。但是在棉花中，尤其是陸地棉相關(guān)的 NAC家族轉(zhuǎn)錄因子研究卻很少，而調(diào)節(jié)衰老相關(guān)的 NAC基因更是鮮有報(bào)道。

本文從陸地棉中成功克隆獲得一個(gè)全新的 NAC家族轉(zhuǎn)錄因子GhNAC7，生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其擁有一個(gè)NAM結(jié)構(gòu)域，這也是NAM亞家族轉(zhuǎn)錄因子的特有典型結(jié)構(gòu)。序列比對(duì)顯示其N端高度保守，C端保守性較低，擁有多個(gè)重復(fù)出現(xiàn)的氨基酸序列。

熒光定量結(jié)果顯示，GhNAC7組織特異性表達(dá)其與棉花生長(zhǎng)發(fā)育有著密切的關(guān)系，其表達(dá)量在衰老的真葉中最高。且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，GhNAC7表達(dá)量隨著棉花真葉和子葉衰老程度的加深而逐漸增加，這充分表明在棉花葉片衰老過程中GhNAC7扮演著某種重要的作用。ZHAO等[27]研究表明，GhNAC12在早衰和衰老的子葉中，其表達(dá)量逐漸增加，最終導(dǎo)致棉花早衰。本研究中，GhNAC7主要在衰老的真葉中表達(dá)，說明GhNAC7主要參與調(diào)控了棉花真葉衰老的過程。ODA-YAMAMIZO等[28]證實(shí)，與野生型擬南芥相比，ANAC046轉(zhuǎn)基因擬南芥明顯出現(xiàn)了早衰的表型，說明ANAC046是擬南芥葉片衰老的正向調(diào)節(jié)因子。為了進(jìn)一步探究GhNAC7相關(guān)的生物學(xué)功能，在擬南芥模式植物中對(duì)其進(jìn)行了過表達(dá)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于野生型擬南芥，轉(zhuǎn)基因擬南芥表型發(fā)生了較大的改變，其中轉(zhuǎn)基因擬南芥表現(xiàn)出明顯的衰老現(xiàn)象，推測(cè)可能是GhNAC7的過表達(dá)導(dǎo)致了轉(zhuǎn)基因擬南芥表型的變化。這也說明GhNAC7在調(diào)節(jié)葉片衰老的過程中可能扮演著正向調(diào)節(jié)因子的作用，因此，認(rèn)為GhNAC7是調(diào)控葉片衰老的基因之一。但是，對(duì)于調(diào)節(jié)葉片衰老的具體機(jī)制還不得而知，需要進(jìn)一步加以研究。

圖8 轉(zhuǎn)基因擬南芥過表達(dá)分析Fig.8 Overexpression of GhNAC7 gene in Arabidopsis

圖9 ABA處理下GhNAC7在棉花幼苗中的表達(dá)Fig. 9 Expression profile of GhNAC7 gene in ABA treatment in cotton seedlings

進(jìn)化樹分析表明，GhNAC7與ANAC083具有很高的一致性。這也暗示著GhNAC7在植物生長(zhǎng)過程中與其發(fā)揮著相似的生物學(xué)作用。研究表明，ABA是葉片衰老中的正調(diào)節(jié)因子，可以促進(jìn)葉片衰老[29]。SHAH等[30]研究也表明，對(duì)棉花幼苗施加外源脫落酸和乙烯，NAC家族基因?qū)BA響應(yīng)最為明顯。此外，ABA應(yīng)答基因 VND-INTERACTING2（VNI2，ANAC083）可以通過整合 ABA介導(dǎo)的非生物脅迫信號(hào)來調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，如COR（受冷脅迫調(diào)節(jié)）和RD（受失水調(diào)節(jié)），進(jìn)而調(diào)節(jié)葉片衰老[31]。本文啟動(dòng)子分析顯示其包含了ABA響應(yīng)元件ABRE，熒光定量試驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)對(duì)棉花幼苗施加ABA 6 h后其表達(dá)量明顯上調(diào)，說明在棉花中ABA可以通過調(diào)控GhNAC7的表達(dá)，調(diào)節(jié)棉花葉片衰老。研究表明，NAC家族基因在脅迫誘導(dǎo)衰老中發(fā)揮著正調(diào)節(jié)因子的作用[32-33]。綜上所述，本文得到了一個(gè)棉花葉片的正調(diào)控因子，為進(jìn)一步分析該基因在葉片衰老過程中的作用機(jī)制打下基礎(chǔ)；同時(shí)，利用棉花葉片衰老特異啟動(dòng)子和 RNAi載體，可以降低該基因在葉片衰老過程中的表達(dá)量，有望獲得抑制棉花葉片衰老的新種質(zhì)，為該基因的生產(chǎn)應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

獲得GhNAC7全長(zhǎng)cDNA，該基因?qū)儆贜AM轉(zhuǎn)錄因子亞家族，其全長(zhǎng)為1 064 bp，ORF為834 bp，編碼277個(gè)氨基酸，其蛋白為核蛋白。GhNAC7啟動(dòng)子核心元件包含一系列與衰老、激素、脅迫相關(guān)的順式作用元件。GhNAC7的表達(dá)具有較高的組織特異性，在衰老的真葉中表達(dá)量最高，其啟動(dòng)子特異性在衰老的真葉中也最強(qiáng)。在擬南芥中過表達(dá)該基因，轉(zhuǎn)基因植株比野生型表現(xiàn)出明顯的衰老癥狀。GhNAC7可促進(jìn)棉花葉片衰老，并受ABA的調(diào)控。

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（責(zé)任編輯 李莉）

Molecular Cloning and Functional Analysis of GhNAC7 in Upland Cotton (Gossypium hirsutum L.)

ZHENG XueWei1,2, SHAH Syed Tariq2, FAN ShuLi2, WEI HengLing2, PANG ChaoYou2, LI HongBin1, YU ShuXun2
(1College of Life Science, Shihezi University, Shihezi 832000, Xinjiang;2Institute of Cotton Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory of Cotton Biology, Anyang 455000, Henan)

【Objective】The primary objectives of this experiment are to clone GhNAC7 gene, analyze its structure, detect its expression in different tissues of cotton and at different developmental leaf senescence stages. Furthermore, its function in cotton leaf senescence was further studied through transforming GhNAC7 gene into Arabidopsis. 【Method】Based on the cotton senescentleaves cDNA library, which was built by State Key Laboratory of Cotton Biology of Institute of Cotton Research of CAAS, this gene was cloned from upland cotton using an expressed sequence tag (EST) containing NAM domain after designing primer using Oligo 6.71. Gene Structure Display Sever was conducted to analyze its structure, PlantCARE was used on-line to study its promoter sequence, and GenScan was simultaneously performed to translate amino acid on-line. Meanwhile, NAC family genes with higher scores were chosen after aligning sequence from Arabidopsis in TAIR. Afterwards MEGA 6.06 was used to display evolutionary relationships of the gene and GeneDOC was conducted to perform sequence alignment of amino acids. Via constructing 35S::GhNAC7-GFP fusion expression vector with XbaⅠand SacⅠrestriction sites, subcellular localization of GhNAC7 was studied by transient expression analysis of onion epidermal cells. Expression profiles of GhNAC7 in various tissues, in response to 200 μmol·L-1ABA treatment and developmental leaf senescence stages were investigated through quantitative real-time PCR (qRT-PCR). Its promoter specificity was conducted by transforming into Arabidopsis thaliana after constructing pGhNAC7-GUS fusion expression vector. Simultaneously, using pBI101 and pBI121 with EcoRⅠand SalⅠrestriction sites were used to construct fusion expression vectors, and then over-expression analysis was performed by transforming GhNAC7 into Arabidopsis thaliana.【Result】In this study, a novel gene GhNAC7 was successfully cloned from upland cotton (Gossypium hirsutum L.). Its full-length was 1 064 bp with three exons and two introns. Results of bioinformatics analysis exhibited that its open reading frame (ORF) was 834 bp, which encoding 277 amino acids. The molecular weights of GhNAC7 encoding protein were 31.35 kD and isoelectric point was 9.22. Domain analysis of GhNAC7 showed that it belongs to the NAM subgroup of NAC family, moreover phylogenetic tree analysis showed that GhNAC7 has the closest genetic relationship with ANAC041 and ANAC083, and GhNAC7 displayed the same domain positions with ANAC083 at 17-58 aa. Its core promoter elements were also predicted, which contained a series of aging, hormone, stress-related cis-acting elements. Subcellular localization elucidated the protein of GhNAC7 encoding is a nucleoprotein. Tissue-specific analysis showed that this gene was significantly expressed in true leaves, cotyledons, flowers, anthers and senescent leaves, but displayed the highest expression in senescent leaves. And in promoter specificity analysis, it was also exhibited the strongest GUS activity in senescent leaf. Over-expression in transgenic Arabidopsis verified evident symptoms of aging compared to the wild type. Fluorescence quantitative PCR analysis showed that the gene expression was significantly up-regulated after 6 h of ABA treatment and displayed the highest at 48 h, so it was hypothesized that ABA could regulate GhNAC7 gene expression to mediate cotton leaf senescence.【Conclusion】It was concluded that GhNAC7 gene could promote cotton leaf senescence and be regulated by ABA.

upland cotton; NAM domain; leaf senescence; GhNAC7; over-expression

2016-08-12；接受日期：2016-10-14

國(guó)家棉花產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-18）

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