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    Illumina高通量測(cè)序技術(shù)分析中周羌稞養(yǎng)生酒窖泥細(xì)菌多樣性

    2017-02-16 07:08:34覃榮周王琪林任朝琴戴先芝曾權(quán)高
    中國(guó)釀造 2017年1期
    關(guān)鍵詞:濃香型高通量芽孢

    覃榮周,王琪林,2,任朝琴,3,戴先芝,3,劉 通,曾權(quán)高

    (1.阿壩師范學(xué)院藏羌醫(yī)藥研究所,四川阿壩藏族羌族自治州623001;2.成都體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)與健康研究所,四川成都610041;3.阿壩師范學(xué)院化學(xué)化工與生命科學(xué)系,四川阿壩藏族羌族自治州623001;4.四川省阿壩州中周酒業(yè)有限公司,四川阿壩藏族羌族自治州624000)

    Illumina高通量測(cè)序技術(shù)分析中周羌稞養(yǎng)生酒窖泥細(xì)菌多樣性

    覃榮周1,王琪林1,2,任朝琴1,3,戴先芝1,3,劉 通1,曾權(quán)高4

    (1.阿壩師范學(xué)院藏羌醫(yī)藥研究所,四川阿壩藏族羌族自治州623001;2.成都體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)與健康研究所,四川成都610041;3.阿壩師范學(xué)院化學(xué)化工與生命科學(xué)系,四川阿壩藏族羌族自治州623001;4.四川省阿壩州中周酒業(yè)有限公司,四川阿壩藏族羌族自治州624000)

    以不同窖齡(5年、10年、20年和30年)的中周羌稞養(yǎng)生酒窖泥為研究對(duì)象,利用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)窖泥細(xì)菌16S rRNA V4~V5區(qū)進(jìn)行測(cè)序,分析其細(xì)菌多樣性。結(jié)果表明,窖泥中細(xì)菌多樣性(Shannon指數(shù))和豐富度(Chao指數(shù))隨著窖齡的增加而顯著提高(P<0.05)。不同窖齡窖泥的細(xì)菌群落組成存在差異,鹽扁菌科(Haloplasmataceae)、乳酸桿菌科(Lactobacillaceae),瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae)和梭菌屬(Clostridium)為不同窖齡窖泥的共有細(xì)菌;類芽孢桿菌屬(Paemibacillus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、消化球菌科(Peptococcaceae)、喜鹽芽孢桿菌屬(Haloballus)和鏈球菌屬(Streptococcus)只出現(xiàn)在30年窖齡窖泥中;PCA結(jié)果分析表明,相同窖齡窖泥中的細(xì)菌具有更高的相似性,說明窖齡是影響窖泥細(xì)菌群落組成的重要因素之一。

    中周羌稞養(yǎng)生酒;濃香型;窖泥;細(xì)菌多樣性;Illumina高通量測(cè)序技術(shù)

    白酒是我國(guó)特有的一種由糧食發(fā)酵而來的蒸餾酒,其中以濃香型白酒的產(chǎn)量最多,占白酒總量的70%左右[1-2]。中周羌稞養(yǎng)生酒是四川阿壩地區(qū)著名的濃香型白酒之一,生產(chǎn)過程中以中高溫大曲配合窖泥發(fā)酵,由于其原料為青稞而呈現(xiàn)出其特有的風(fēng)味,并深受當(dāng)?shù)厝嗣竦南矏踇3]。窖泥經(jīng)過不同時(shí)間的演化具有其獨(dú)特的微生物特性[4],因此,對(duì)中周羌稞養(yǎng)生酒不同窖齡的窖泥進(jìn)行微生物多樣性的研究有助于揭示窖泥的演變過程。

    傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法只能對(duì)窖泥中少數(shù)的微生物進(jìn)行鑒定,研究表明,窖泥中不易培養(yǎng)或者不能培養(yǎng)的微生物(如厭氧或者兼性厭氧微生物)在濃香型白酒生產(chǎn)中也發(fā)揮了重要的作用[5-6]。目前,變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)是微生物多樣性研究中最常用的方法之一,它能夠?qū)Νh(huán)境中不能培養(yǎng)的微生物進(jìn)行鑒定,但是此技術(shù)并不能用于定量,且通量小,只能鑒定環(huán)境中的少部分微生物[7-8]。Illumina高通量測(cè)序技術(shù)是近年來興起的分析微生物多樣性的技術(shù),具有一定的優(yōu)越性,可準(zhǔn)確的對(duì)環(huán)境中的微生物進(jìn)行定量,且具有較高的通量,能夠較為全面的揭示環(huán)境中微生物的特性[9-10]。因此,本研究利用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)窖齡為5年、10年、20年和30年的中周羌稞養(yǎng)生酒窖泥進(jìn)行細(xì)菌的多樣性分析,以期揭示不同窖齡中周羌稞養(yǎng)生酒窖泥微生物的多樣性,為優(yōu)質(zhì)濃香型白酒的生長(zhǎng)提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 窖泥樣品

    本試驗(yàn)中的窖泥均為阿壩中周羌稞養(yǎng)生酒優(yōu)質(zhì)窖泥,采自四川省阿壩州中周酒業(yè)有限公司,窖齡分別為5年、10年、20年和30年。每個(gè)窖齡的窖泥分別采自5口窖池,分別編號(hào)為5年(1、2)、10年(3、4)、20年(5、6)、30年(7、8)。取樣方法為從每個(gè)窖齡窖池的上層、中層和底部分別取樣,混合均勻后于-20℃保藏待用[11]。

    1.1.2 主要試劑

    土壤DNA提取試劑盒、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)純化試劑盒、DNA Marker D2000:北京天根生化科技有限公司;無水乙醇(分析純):鄭州中天實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;瓊脂糖(分析純):北京沃比森科技有限公司。細(xì)菌16S rRNA V4~V5區(qū)引物515F和907R 149:北京諾禾致源生物信息科技有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    TGL-16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī):上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司;PL203型電子分析天平:唐山藍(lán)箭電子衡器有限公司;DZKW-S-8恒溫水浴鍋:北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司;DYY-10C型電泳儀:北京市六一儀器廠;illumina Miseq PE250高通量測(cè)序儀:上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 窖泥細(xì)菌DNA提取及PCR擴(kuò)增

    根據(jù)鄧杰等[12]的報(bào)道采利用DNA提取試劑盒(MIBIO UltraClean Soil DNA Isolation Kit)對(duì)不同窖齡的窖泥細(xì)菌DNA進(jìn)行提取。以不同窖齡窖泥細(xì)菌總DNA為模板,引物采用細(xì)菌16S rRNA V4~V5區(qū)引物515F(5′-148-GTGCCA GCMGCCGCGG-3′)和907R 149(5′-CCGTCAAATTCMT TTRAGTTT-3′)[13]進(jìn)行TouchDownPCR擴(kuò)增,TouchDown PCR反應(yīng)條件參考TIAN W等[14]的方法。

    1.3.2 PCR產(chǎn)物純化

    利用PCR純化試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化,之后利用2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè),并在紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察條帶,利用分光光度計(jì)檢測(cè)DNA擴(kuò)增產(chǎn)物在波長(zhǎng)230 nm、260 nm和280 nm處的吸光度值,并計(jì)算OD260nm/OD280nm和OD260nm/OD230nm,確定擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度和純度,滿足純度要求后用于后續(xù)試驗(yàn)。

    1.3.3 Illumina高通量測(cè)序

    利用Illumina高通量測(cè)序儀對(duì)窖泥細(xì)菌DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析,為了確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及普遍性,需對(duì)獲得的原始序列進(jìn)行適當(dāng)?shù)暮Y選,去掉低質(zhì)量的序列,進(jìn)而獲得滿足后續(xù)分析要求的高質(zhì)量序列。通過與核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)(ribosomal database project,RDP)已知序列的比對(duì),修剪適配器和核糖體標(biāo)簽來減少測(cè)序錯(cuò)誤率[15]。利用Mothur軟件識(shí)別和消除嵌合體來改善序列質(zhì)量。

    1.3.4 生物信息學(xué)分析

    利用微生物生態(tài)學(xué)的定量分析(quantitative insights into microbial ecology,QIIME)平臺(tái)對(duì)窖泥細(xì)菌DNA序列進(jìn)行高級(jí)生物信息分析,每個(gè)樣品剩余的高質(zhì)量序列用于劃分操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)。在97%相似度的OTUs進(jìn)行同源性比對(duì)的基礎(chǔ)上,評(píng)估窖泥樣品細(xì)菌的豐富度(Chao指數(shù))和多樣性(Shannon指數(shù))[16]。此外,主成分分析(principal component analysis,PCA)用來反映不同窖泥樣本之間細(xì)菌組成的差異。

    1.3.5 數(shù)據(jù)分析

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,并利用SPSS17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,選擇Tukey's檢驗(yàn),當(dāng)P<0.05時(shí)可視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表示差異顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 窖泥樣品DNA擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量檢驗(yàn)

    圖1 窖泥樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of PCR amplification products of pit mud samples

    表1 窖泥樣品PCR產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果Table 1 Detection results of PCR amplification products of pit mud samples

    由圖1可知,窖泥樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰單一,不存在拖帶或者引物二聚體,條帶大小在500 bp左右,符合16S rRNA V4~V5區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物要求。同時(shí)由表1可知,8個(gè)窖泥樣品DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的OD260nm/OD280nm值都在1.8~2.0之間,OD230nm/OD260nm值都>2.0,說明PCR產(chǎn)物的濃度和純度都較高,可以滿足Illumina高通量測(cè)序分析的要求。

    2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)的合理性分析

    為了進(jìn)一步分析測(cè)序數(shù)據(jù)的合理性,對(duì)窖泥樣品進(jìn)行稀疏曲線分析,以樣本中隨機(jī)抽取測(cè)序序列數(shù)為橫坐標(biāo),OTU數(shù)為縱坐標(biāo),繪制出稀疏曲線,結(jié)果如圖2所示,圖中稀疏度是一定測(cè)序數(shù)量中所測(cè)出的OTU數(shù)量的多少,是通過高通量測(cè)16s RNA相關(guān)序列,比對(duì)序列的同源性,由軟件分析得到。由圖2可知,隨著測(cè)序數(shù)量增加,各窖泥樣品的稀疏曲線先經(jīng)過陡坡期,然后趨于平坦,說明繼續(xù)增加測(cè)序的數(shù)量對(duì)產(chǎn)生的OTU數(shù)量的影響較少,樣品的測(cè)序條數(shù)能夠滿足試驗(yàn)的后續(xù)要求,可以用于進(jìn)一步的樣品細(xì)菌多樣性分析。

    圖2 窖泥樣品的稀疏曲線分析Fig.2 Rarefaction curves analysis of pit mud samples

    2.3 不同窖齡窖泥中細(xì)菌豐富度和多樣性分析

    表2 不同窖齡窖泥樣品細(xì)菌多樣性和豐富度比較Table 2 Comparison of bacterial diversity and abundance of pit mud with different cellar ages

    由表2可知,8個(gè)樣品共有548 313條序列,進(jìn)行抽平(subsample)后,計(jì)算alpha多樣性和beta多樣性,經(jīng)過深度抽平處理后,每個(gè)樣品最后的序列為19 353條,此序列的數(shù)量能夠覆蓋整個(gè)樣品序列的98%以上,這說明得到的樣品序列質(zhì)量較高,能夠用于窖泥中細(xì)菌多樣性的研究。在97%相似度水平下,所有窖泥樣品序列總共被歸類為7 925個(gè)OTUs。其中5年、10年、20年和30年窖泥中細(xì)菌的OTUs分別為254±5.41、321±13.11、452±13.23和558±17.59,隨著窖泥窖齡的增加,樣品中OTUs的數(shù)量顯著增加(P<0.05)。

    通過對(duì)不同窖齡窖泥樣品細(xì)菌多樣性(Shannon指數(shù))和豐富度(Chao指數(shù))分析可知,所有窖泥樣本中細(xì)菌的多樣性和豐富度都較高,這說明窖泥中的細(xì)菌群落特征較為復(fù)雜。此外,Shannon指數(shù)和Chao指數(shù)都隨著窖泥窖齡的增加而顯著增加(P<0.05)。

    2.4 不同窖齡窖泥中細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)分析

    利用Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)窖泥細(xì)菌DNA PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析,通過數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)得到窖泥細(xì)菌的種類,并進(jìn)一步計(jì)算各種細(xì)菌所占細(xì)菌總數(shù)的比例(即相對(duì)含量),結(jié)果如圖3所示。

    圖3 不同窖齡窖泥中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Analysis of bacterial community structure in pit mud with different cellar ages

    8個(gè)樣品中的細(xì)菌共包含7個(gè)門,分別為厚壁菌門(Firmicutes)、互養(yǎng)菌門(Synergistaceae)、綠彎菌門(Chloroflexi)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)和黏膠球形菌門(Lentisphaerae),其中厚壁菌門,互養(yǎng)菌門和綠彎菌門為優(yōu)勢(shì)菌門,占細(xì)菌總數(shù)的90.22%。此外,其他相對(duì)含量小于0.01%的所有屬的總和用“Others”表示。隨著窖齡的增加,窖泥中“Others”的比例也隨之增加,這也表明了窖泥中細(xì)菌的多樣性隨著窖齡的增加而增加。

    由圖3可知,具有相同窖齡的窖泥中細(xì)菌構(gòu)成較為相似,不同窖齡窖泥之間的群落構(gòu)成存在一定的差異。5年窖齡的窖泥中優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌為:梭菌屬(Clostridium)(26.32± 1.92)%、鹽扁菌科(Haloplasmataceae)(16.72±1.72)%、乳酸桿菌科(Lactobacillaceae)(10.31±0.82)%、互養(yǎng)菌科(Synergistaceae)(9.31±0.32)%和瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae)(9.02±0.18)%;10年窖齡的窖泥中優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌為:梭菌屬(Clostridium)(20.15±1.36)%、鹽扁菌科(Haloplasmataceae)(12.35±0.92)%、乳酸桿菌科(Lactobacillaceae)(10.07±1.12)%、瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae)(7.22± 1.21)%、互養(yǎng)菌科(Synergistaceae)(7.12±0.81)%、假單胞菌科(Pseudomonadaceae)(7.12±0.48)%和類芽孢桿菌屬(Paemibacillus)(6.56±0.37)%;20年窖齡的窖泥中優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌為:梭菌屬(Clostridium)(20.43±1.09)%、鹽扁菌科(Haloplasmataceae)(13.47±0.76)%、瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae)(8.88±0.81)%、喜熱菌屬(Caloramator)(7.66± 0.83)%、乳酸桿菌科(Lactobacillaceae)(7.12±0.63)%、類芽孢桿菌屬(Paemibacillus)(6.92±0.84)%、假單胞菌科(Pseudomonadaceae,5.81±0.64%)、互養(yǎng)菌科(Synergistaceae)(5.32±0.83)%和芽孢桿菌(Bacillus)(1.01±0.03)%;30年窖齡的窖泥中優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌為:梭菌屬(Clostridium)(14.98± 0.84)%、鹽扁菌科(Haloplasmataceae)(9.35±0.73)%、乳酸桿菌科(Lactobacillaceae)(6.05±0.73)%、類芽孢桿菌屬(Paemibacillus)(5.99±0.44)%、喜熱菌屬(Caloramator)(5.91± 0.76)%、假單胞菌科(Pseudomonadaceae)(5.63±0.36)%、瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae)(3.16±0.21)%、互養(yǎng)菌科(Synergistaceae)(2.89±0.23)%、喜鹽芽孢桿菌屬(Haloballus)(2.44±0.16)%、鏈球菌屬(Streptococcus)(2.11±0.16)%和消化球菌科(Peptococcaceae)(2.01±0.17)%??梢婋S著窖齡的增加,窖泥中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)也發(fā)生了變化。而通過不同窖齡窖泥優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的比較可知厚壁菌門中的鹽扁菌科、乳酸桿菌,瘤胃球菌屬和梭菌屬為不同窖齡窖泥的共有細(xì)菌,而類芽孢桿、芽孢桿菌屬、消化球菌科、喜鹽芽孢桿菌屬和鏈球菌屬等可能在高窖齡(30年)中周羌稞養(yǎng)生酒的發(fā)酵中發(fā)揮重要的作用。

    2.5 PCA分析

    圖4 不同窖齡窖泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)PCA分析Fig.4 PCA analysis of bacterial community structure in pit mud with different cellar ages

    圖4 為不同窖齡窖泥細(xì)菌群落結(jié)果的PCA分析圖,由圖4可知,8個(gè)窖泥樣品共分為了4個(gè)組,不同窖齡的4個(gè)窖泥樣品聚成一組,分別為A(1和2號(hào)樣品)、B(3和4號(hào)樣品)、C(5和6號(hào)樣品)和D(7和8號(hào)樣品),這顯示具有相同窖齡的窖泥中具有相似的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu),而不同窖齡的窖泥中細(xì)菌的群落結(jié)果則為分散和遠(yuǎn)離現(xiàn)象,說明群落之間有明顯的差異。表明窖泥中細(xì)菌群落的組成與窖泥的窖齡密切相關(guān)。

    3 結(jié)論

    利用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)能夠較為全面的分析中周羌稞養(yǎng)生酒不同窖齡窖泥中細(xì)菌的多樣性。窖泥中細(xì)菌的生物多樣性和豐富度隨著窖泥窖齡的增加而顯著增加。細(xì)菌的組成也發(fā)生了改變,其中鹽扁菌科、乳酸桿菌、瘤胃球菌屬和梭菌屬為4種窖齡窖泥的共有細(xì)菌,而類芽孢桿、芽孢桿菌屬、消化桿菌科、喜鹽芽孢桿菌屬和鏈球菌屬只出現(xiàn)在高窖齡中周羌稞養(yǎng)生酒窖泥中,PCA分析進(jìn)一步表明中周羌稞養(yǎng)生酒窖泥中細(xì)菌群落的組成與窖泥的窖齡密切相關(guān)。

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    Analysis of bacterial diversity in pit mud of Zhong-Zhou highland barley health liquor by Illumina high-throughput sequencing

    QIN Rongzhou1,WANG Qilin1,2,REN Chaoqin1,3,DAI Xianzhi1,3,LIU Tong1,ZENG Quangao4(1.Tibetan-Qiang's Medicine Research Institute,ABA Normal University,Aba Tibetan and Qiang Autonomous Prefecture 623001, China;2.Sports Medicine and Health Research Institute,Chengdu Sports University,Chengdu 610041,China;3.Department of Chemical Engineering and Life Science,ABA Normal University,Aba Tibetan and Qiang Autonomous Prefecture 623001,China; 4.Zhong-Zhou Highland Barley Wine Industry Co.,Ltd.,Aba Tibetan and Qiang Autonomous Prefecture 624000,China)

    Using pit mudfrom different cellars with the ages(5 years,10 years,20 years and 30 years)of Zhong-Zhou highland barley health liquor as the research objects,16S rRNA V4-V5 sequence of bacteria in the pit mud was detected by Illumina high-throughput sequencing,and the diversity of bacteria was analyzed.The results showed that the diversity(Shannon index)and abundance(Chao index)of bacteria in pit mud with increasing of cellar age were increased significantly(P<0.05).The bacterial community composition of pit mud with different cellar ages had difference.Haloplasmataceae,Lactobacillaceae,RuminococcceaeandClostridiumwere the common bacteria of pit mud with different cellar ages.Paemibacillus,Bacillus,Peptococcaceae,HaloballusandStreptococcusonly appeared in the pit mud with 30 years cellar age.PCA analysis indicated that the bacteria in the pit mud with the same cellar ages had a higher similarity,which showed that cellar age was one of the important factors that affected the bacterial community of pit mud.

    Zhong-Zhou highland barley health liquor;Luzhou-flavor;pit mud;bacterial diversity;Illumina high-throughput sequencing

    TS255

    0254-5071(2017)01-0138-04

    10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.029

    2016-07-05

    四川省哲學(xué)社會(huì)科學(xué)重點(diǎn)研究基地2014年度課題(QXJ1401);阿壩師范學(xué)院2014專項(xiàng)基金課題(JY14-02);四川省羌學(xué)學(xué)會(huì)藏羌地區(qū)醫(yī)藥研究所2015年度資助項(xiàng)目(LYH15-01)

    覃榮周(1977-),男,副教授,碩士,研究方向?yàn)槊褡鍌鹘y(tǒng)醫(yī)學(xué)與公共衛(wèi)生。

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