乳桿菌酵母菌及混菌對發(fā)酵飼料品質的影響

亓秀曄，謝全喜，陳 振，于佳民，徐 輝，張俊艷，徐海燕，谷 巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東泰安271000）

乳桿菌酵母菌及混菌對發(fā)酵飼料品質的影響

亓秀曄，謝全喜，陳 振，于佳民，徐 輝，張俊艷，徐海燕，谷 巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東泰安271000）

該研究分別用乳桿菌和酵母菌單菌及混菌對哺乳母豬全價飼料進行固體發(fā)酵，通過測定發(fā)酵飼料pH值、活菌數、總酸含量和酸溶蛋白含量，篩選出適宜哺乳母豬全價料發(fā)酵的乳酸桿菌BLCC2-0015、BLCC2-0092和酵母菌BLCC4-0021、BLCC4-0042，并對篩選出的乳酸桿菌和酵母菌復配發(fā)酵進行了初步研究。結果表明，以BLCC2-0015+BLCC4-0021（3:2）復配組效果最優(yōu)，發(fā)酵24 h時，乳桿菌活菌數可達67.00×108CFU/g，粗蛋白含量高出對照組45.41%，酸溶蛋白含量高出對照組23.41%，總酸含量可達20.68 mg/g。

乳桿菌；酵母菌；發(fā)酵飼料；酸溶蛋白含量；總酸；厭氧發(fā)酵

近年來，利用微生物發(fā)酵技術來開發(fā)新型飼料資源越來越受到人們的重視。通過微生物發(fā)酵，可使飼料或者飼用原料中含有更多的活性益生菌菌體、各種消化酶及代謝產物、蛋白質分解產物及活性小肽、抑菌物質，同時使飼料中的抗營養(yǎng)因子含量降低，起到促進生長、維持動物健康的作用[1-2]。

常用的微生物發(fā)酵菌種主要是乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌和霉菌[3]。乳酸菌發(fā)酵飼料可以降低仔豬胃內的酸度，增加仔豬的采食量，從而提高其生產性能[4]，同時，能有效抑制有害細菌的生長和繁殖，控制仔豬的腹瀉，減少抗生素的使用，具有良好的生產和應用價值[5]；酵母菌富含蛋白質、氨基酸（粗蛋白質含量高達50%）及多種維生素，同時含有多種動物所需的消化酶（α-淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶等）和其他代謝產物[6-7]，在提高動物的免疫、生長和繁殖能力方面具有顯著功效，是天然綠色生物飼料添加劑，價格低廉并有很高的經濟價值，市場需求旺盛，具有很好的應用前景[8]；酸溶蛋白即分子質量較低的蛋白水解物，包括肽和游離氨基酸，使用酸溶蛋白含量指標評價發(fā)酵酶解粕類蛋白質品質，既可以反映其中抗原蛋白質和其他蛋白質抗營養(yǎng)因子被水解的程度，進而揭示該類抗營養(yǎng)因子活性被消除的程度，又可一定程度上反映肽含量的高低[9]，表明畜禽生長必需氨基酸含量增加，發(fā)酵飼料中氨基酸組成在向優(yōu)質化方向轉化[10]。

目前，國內外對微生物發(fā)酵飼料在畜禽飼養(yǎng)中的應用和理論研究較多。但國內外對發(fā)酵飼料的研究主要集中在發(fā)酵菌株類型、生理功能[11]、飼喂效果上[12-13]，對影響發(fā)酵飼料品質的發(fā)酵方式、生產工藝條件、發(fā)酵眾多代謝物質的活性成分分析等研究相對較少，對發(fā)酵飼料眾多代謝產物的有效成分缺乏較深入的研究[14-15]。本試驗旨在研究適宜哺乳母豬全價飼料發(fā)酵的乳桿菌和酵母菌的篩選和復配發(fā)酵方式對發(fā)酵飼料pH、活菌數、總酸含量、粗蛋白和酸溶蛋白含量的影響，為乳桿菌和酵母菌發(fā)酵全價飼料提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 發(fā)酵基料和菌株

玉米豆粕型配合飼料：山東泰安普瑞納飼料有限公司。

6株乳桿菌菌株（BLCC2-0001、BLCC2-0015、BLCC2-0038、BLCC2-0092、BLCC2-0111、BLCC2-0114；4株酵母菌菌株（BLCC4-0048、BLCC4-0021、BLCC4-0044、BLCC4-0042）：由山東寶來利來生物工程股份有限公司研究院保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏8g/L，酵母膏4g/L，硫酸鎂0.5 g/L，硫酸錳0.3 g/L，檸檬酸銨2 g/L，乙酸鈉5g/L，吐溫-801mL/L，pH值6.0，121℃滅菌20min。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏0.5g/L，磷酸二氫鉀2.0g/L，pH自然，121℃滅菌20min。

1.1.3 化學試劑

葡萄糖：山東祥瑞藥業(yè)有限公司；蛋白胨：北京奧博星生物技術有限責任公司；牛肉膏、酵母膏：天津市英博生化試劑有限公司；硫酸鎂、硫酸錳：濟南匯豐達化工有限公司；檸檬酸銨：上海撫生實業(yè)有限公司；乙酸鈉：青島捷世康生物科技有限公司；吐溫-80、氫氧化鈉：天津凱通化學試劑有限公司；磷酸二氫鉀：天津市致遠化學試劑有限公司；氯化鈉：天津博迪化工股份有限公司；LBS瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基：青島海博生物技術有限公司。所用實驗試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；THZ-C恒溫振蕩器：揚州培英實驗儀器有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；KDN-103F自動定氮儀、HYP-1008八孔消化爐：上海纖檢儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酵母菌和乳桿菌發(fā)酵液的制備

將4℃條件下保存的酵母斜面活化，轉接到裝有50 mL YEPD培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃搖床振蕩培養(yǎng)16 h備用；將4℃條件下保存的乳桿菌斜面活化，轉接到裝有100 mL MRS培養(yǎng)基的鹽水瓶中，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h備用。

1.3.2 試驗設計

（1）乳桿菌的篩選

稱取一定量的基料按料水比1∶0.4（g∶mL），以裝袋量為100 g/袋裝袋，每個樣品設3個平行，分別按照2%接種量接入培養(yǎng)好的乳桿菌發(fā)酵液，以不接種任何菌株的空白料為對照，壓實后于37℃培養(yǎng)箱進行生料厭氧發(fā)酵，分別于發(fā)酵24 h、48 h和72 h取樣，測定pH值、活菌數和總酸含量。

（2）酵母菌的篩選

稱取一定量的基料于500 mL三角瓶中，料水比為1∶0.4（g∶mL），裝量50 g/瓶，按2%接種量分別接入培養(yǎng)好的酵母菌種子液，每個樣品設3個平行，以不接種任何菌株的空白料為對照，置于30℃培養(yǎng)箱進行需氧發(fā)酵，分別于發(fā)酵24 h、48 h和72 h取樣，測定活菌數和粗蛋白含量。

（3）混菌發(fā)酵

將上述篩選得到的乳桿菌和酵母菌進行混菌發(fā)酵，發(fā)酵方式為厭氧發(fā)酵，料水比為1∶0.4（g∶mL），以裝袋量為100 g/袋裝袋，接種量2%，乳桿菌:酵母菌（3∶2），生料發(fā)酵，30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。以不接種任何菌株的空白料為對照，分別于發(fā)酵24 h、48 h和72 h取樣，測定pH值、活菌數、總酸、粗蛋白和酸溶蛋白含量。

1.3.3 測定方法

pH測定：取10 g樣品加入90 mL滅菌后的生理鹽水中，攪拌均勻后直接測定。

乳桿菌和酵母菌活菌數的測定：準確稱取發(fā)酵飼料10.0 g，用生理鹽水10倍遞增稀釋，取適當稀釋度的樣品分別至LBS培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基中，分別于37℃和30℃培養(yǎng)48 h，根據菌落數計算樣品中乳桿菌和酵母菌數量，結果用CFU/g表示。

總酸含量的測定：參照國標GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》中的酸堿滴定法測定。

粗蛋白含量：參照國標GB/T 6432—1994《飼料中粗蛋白測定方法》測定。

酸溶蛋白含量：參照QB/T 2653—2004《大豆肽粉》中酸溶蛋白質含量的測定。準確稱取樣品2.00 g，加入15%三氯乙酸溶液25 mL，混合均勻，靜置30 min。將溶液定量轉移，在4 000 r/min條件下離心10 min后，取全部上清液，以下按照上述粗蛋白的測定方法。結果為占粗蛋白的百分含量。

2 結果與分析

2.1 乳桿菌發(fā)酵對飼料品質的影響

乳桿菌發(fā)酵對飼料品質的影響見表1。由表1可知，發(fā)酵24 h時除菌株BLCC2-0038發(fā)酵pH較高外，其余均在5以下，均顯著低于對照組（P＜0.05），其中以菌株BLCC2-0015最低；48 h和72 h時，各pH值均有所下降，以菌株BLCC2-0015和菌株BLCC2-0092較低，菌株BLCC2-0015在發(fā)酵48 h時pH值達到最低，僅為4.12。各菌株發(fā)酵活菌數均在109CFU/g水平，各取樣時間點時均以菌株BLCC2-0015和菌株BLCC2-0092活菌數較高，其中菌株BLCC2-0092發(fā)酵48 h活菌數達到81×108CFU/g。各菌株發(fā)酵料總酸含量均逐漸升高，以菌株BLCC2-0015和菌株BLCC2-0092的總酸含量一直處于較高水平，均顯著高于其他組（P＜0.05）。其中以菌株BLCC2-0015發(fā)酵72 h時最高，為24.84 mg/g。

綜合考慮，選擇適宜哺乳母豬全價料發(fā)酵的乳桿菌為菌株BLCC2-0015和菌株BLCC2-0092。

表1 乳桿菌發(fā)酵對飼料品質的影響Table 1 Effect ofLactobacilluson fermented feed quality

2.2 酵母菌發(fā)酵對飼料品質的影響

表2 酵母菌發(fā)酵對飼料品質的影響Table 2 Effect of yeast on fermented feed quality

酵母菌發(fā)酵對飼料品質的影響見表2。由表2可知，菌株BLCC4-0048在發(fā)酵24 h、48 h和72 h時活菌數均在108CFU/g水平，其余菌株均在109CFU/g水平。24 h以菌株BLCC4-0021發(fā)酵活菌數最高，其次是菌株BLCC4-0042；48 h和72 h時均以菌株BLCC4-0021發(fā)酵活菌數最高，72 h時為53.50×108CFU/g；其次是菌株BLCC4-0042，兩者間差異不顯著（P＞0.05）。由粗蛋白含量來看，各菌株間差異均不顯著（P＞0.05），其中以菌株BLCC4-0021和菌株BLCC4-0042發(fā)酵時稍高。

綜合考慮，選擇適宜作為發(fā)酵哺乳母豬全價飼料的酵母菌為BLCC4-0021和BLCC4-0042。

2.3 混菌發(fā)酵對飼料品質的影響

利用篩選得到的乳桿菌BLCC2-0015、BLCC2-0092和酵母菌BLCC4-0021、BLCC4-0042混菌發(fā)酵哺乳母豬全價飼料，發(fā)酵方式為厭氧發(fā)酵（乳桿菌/酵母菌為3∶2，接種量2%），發(fā)酵溫度為32℃。以不接種任何菌株的空白料為對照，考察混菌發(fā)酵對飼料品質的影響，結果見表3。

表3 乳桿菌酵母菌混菌發(fā)酵對飼料品質的影響Table 3 Effects of multi-strains ofLactobacillusand yeast on fermented feed quality

由表3可知，R0015+J0021、R0015+J0042發(fā)酵各時間點的pH值均顯著低于R0092+J0021、R0092+J0042厭氧聯(lián)合發(fā)酵（P＜0.05）。各復配組在各時間點的乳桿菌活菌數均在109CFU/g水平，且R0015復配發(fā)酵時乳酸桿菌活菌數較高；24 h時R0015+J0021和R0015+J0042發(fā)酵活菌數顯著高于R0092+J0021和R0092+J0042復配發(fā)酵時（P＜0.05）。且隨發(fā)酵時間的延長，活菌數呈下降趨勢，發(fā)酵72 h時酵母菌活菌數低于接種量。R0015+J0021和R0015+J0042發(fā)酵組粗蛋白含量均高于R0092+J0021和R0092+J0042復配發(fā)酵組，其中24 h和48 h時差異顯著（P＜0.05）。酸溶蛋白含量和總酸含量結果一致，R0015+J0021和R0015+J0042復配發(fā)酵組均顯著高于R0092+J0021和R0092+J0042復配發(fā)酵組（P＜0.05）；R0015+J0021最高。

綜合考慮，選擇乳桿菌BLCC2-0015與酵母菌BLCC4-0021（3:2）聯(lián)合發(fā)酵哺乳母豬全價料效果最優(yōu)。發(fā)酵24h時，乳桿菌活菌數可達67.00×108CFU/g，粗蛋白含量高出對照組45.41%，酸溶蛋白含量高出對照組23.41%，總酸含量可達到20.68 mg/g。

3 結論

本試驗對菌種庫保存的性能優(yōu)良的乳酸桿菌和酵母菌發(fā)酵哺乳母豬全價料飼料，根據發(fā)酵后飼料pH值、活菌數、粗蛋白、酸溶蛋白和總酸等指標，篩選出適宜發(fā)酵的乳桿菌為BLCC2-0015和BLCC2-0092，適宜發(fā)酵的酵母菌為BLCC4-0021和BLCC4-0042?；炀l(fā)酵時，以BLCC2-0015+BLCC4-0021（3：2）復配組效果最優(yōu)，發(fā)酵24 h時，乳桿菌活菌數可達67.00×108CFU/g，粗蛋白含量高出對照組45.41%，酸溶蛋白含量高出對照組23.41%，總酸含量可達20.68 mg/g。

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Effect of Lactobacillus,yeast and multi-strains fermentation on fermented feed quality

QI Xiuye,XIE Quanxi,CHEN Zhen,YU Jiamin,XU Hui,ZHANG Junyan,XU Haiyan,GU Wei(Shandong BaoLai-LeeLai Bioengineering Co.,Ltd.,Taian 271000,China)

By the determination of pH,viable count,total acid content and acid-soluble protein content of fermented feed,the effect of single strain of Lactobacillusand yeast and multi-strains with solid-state fermentation on lactating sow complete feed was researched.Results showedLactobacillus BLCC2-0015,BLCC2-0092 and yeast BLCC4-0021,BLCC4-0042 were suitable for basic feed fermentation,and multi-strains fermentation conditions with screenedLactobacillusand yeast were preliminary studied.Results indicated that multi-strains BLCC2-0015 and BLCC4-0021(3:2)had the optimal effect,the viable count reached to 67.00×108CFU/g with fermentation time 24 h,the crude protein and acid-soluble protein increased 45.41%and 23.41%than the control group,respectively,and the total acid content was 20.68 mg/g.

Lactobacillus;yeast;fermented feed;acid-soluble protein contents;total acid;anaerobic fermentation

TQ920.6

0254-5071（2017）01-0075-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.015

2016-09-07

泰安市科技發(fā)展計劃(201540701)

亓秀曄（1987-），女，助理研究員，碩士，主要從事動物微生態(tài)制劑研發(fā)工作。