清香型大曲酯化酶活力的研究

唐取來(lái)，李晶晶，郭學(xué)武，肖冬光*

（1.教育部工業(yè)發(fā)酵微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室天津300457，2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

清香型大曲酯化酶活力的研究

唐取來(lái)1,2，李晶晶1,2，郭學(xué)武1,2，肖冬光1,2*

（1.教育部工業(yè)發(fā)酵微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室天津300457，2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

研究了乳酸質(zhì)量濃度和pH對(duì)清香型大曲酯化酶活力的影響，結(jié)果表明，乳酸質(zhì)量濃度對(duì)大曲酯化酶活力有很大影響，當(dāng)乳酸質(zhì)量濃度較低時(shí)，大曲中的酯化酶表現(xiàn)為合成作用，分別在低于8 g/L和16 g/L時(shí)催化乳酸乙酯和乙酸乙酯的合成；當(dāng)乳酸質(zhì)量濃度較高時(shí)，酯化酶表現(xiàn)為水解作用，將酯分解為相應(yīng)酸和醇；pH對(duì)大曲酯化酶酯分解活力影響顯著，在pH值為2.0時(shí)，酯的分解主要為化學(xué)分解，在pH值為3.0～6.0時(shí)，化學(xué)分解和酯化酶分解都起作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在pH值為4.0時(shí)大曲酯化酶催化乙酸乙酯合成的活力最強(qiáng)，100 h時(shí)乙酸乙酯質(zhì)量濃度達(dá)188.8 mg/L；pH值為5.0時(shí)催化乳酸乙酯合成的活力最強(qiáng)，100 h時(shí)乳酸乙酯質(zhì)量濃度達(dá)182.6 mg/L。

清香型大曲；酯化酶；合成；分解

清香型白酒的歷史源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，它的主體香氣是乙酸乙酯和乳酸乙酯[1]。其特點(diǎn)是清香純正、自然協(xié)調(diào)、醇甜柔和、后味爽凈[2]。白酒中酯類的形成大體有三條途徑：一是微生物代謝副產(chǎn)物，二是酒醅中酸和醇在化學(xué)或大曲酯化酶作用下合成，三是白酒蒸餾和貯藏過(guò)程中通過(guò)化學(xué)反應(yīng)形成。王濤等[3-4]認(rèn)為酒中乙酸乙酯是產(chǎn)酯酵母胞內(nèi)酶的代謝產(chǎn)物，酯化以前中期為主；李河等[5]認(rèn)為乳酸乙酯一是配醅帶入，二是酒醅中大量乳酸而形成。酸和醇通過(guò)化學(xué)反應(yīng)生成酯是一個(gè)緩慢的過(guò)程，達(dá)到平衡往往需要很長(zhǎng)時(shí)間[6]。

大曲在釀造過(guò)程中為發(fā)酵、產(chǎn)香提供了微生物群系和風(fēng)味前驅(qū)物質(zhì)，而且也提供了豐富的生物催化劑酶。大曲中的酯化酶能使一個(gè)酸元和一個(gè)醇元結(jié)合、脫水而生成酯，大大加速了酯的形成速率，但是大曲酯化酶也能分解酯，生成相應(yīng)的酸和醇[7-9]。對(duì)酯化酶的研究始于20世紀(jì)80年代，多研究酯化酶在濃香型白酒中對(duì)己酸乙酯的合成作用[10]。對(duì)于清香型白酒，其主體香氣為乙酸乙酯和乳酸乙酯，研究清香型大曲的酯化酶活力，有利于了解大曲酯化酶對(duì)乙酸乙酯形成的補(bǔ)充作用及其在乳酸乙酯形成中的作用[11]。針對(duì)白酒發(fā)酵過(guò)程中乳酸含量較高的特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)研究了乳酸質(zhì)量濃度和pH對(duì)清香型大曲酯化酶活力的影響[12]。有利于了解發(fā)酵過(guò)程中乳酸對(duì)大曲酯化酶活力的影響，分析清香型白酒中乙酸乙酯和乳酸乙酯的合成機(jī)制，解決清香型白酒中乳酸乙酯含量過(guò)高的問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

清香型大曲：儲(chǔ)存3～6個(gè)月，某清香型白酒廠提供。乙酸、乳酸、乙醇（均為分析純）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 7890B氣相色譜儀、Agilent HP-INNOWAX氣相色譜柱（30 m×320 μm×0.25 μm）：Agilent有限公司；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)醫(yī)療設(shè)備廠有限公司；ES-3610K電磁爐：成都川西行料工貿(mào)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸質(zhì)量濃度對(duì)大曲酯化酶活力的影響

在體積分?jǐn)?shù)20%乙醇溶液中，添加1 g/L乙酸、5 g干曲，乳酸質(zhì)量濃度分別為4 g/L、6 g/L、8 g/L、12 g/L、16 g/L、20 g/L，30℃保溫酯化100 h。同時(shí)做不加曲的空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)，測(cè)定乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量。

1.3.2 pH對(duì)大曲酯化酶活力的影響

在體積分?jǐn)?shù)20%乙醇溶液中，添加2 g/L乙酸、3 g/L乳酸，再加5 g干曲，用NaOH或H2SO4分別調(diào)pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，于30℃靜置100 h，同時(shí)做不加曲的空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)，測(cè)定乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量。

1.3.3 pH對(duì)大曲酯化酶主要酯分解活力的影響

在體積分?jǐn)?shù)20%乙醇溶液中分別按體積量加入0.1%的乙酸乙酯、乳酸乙酯和乙酸異戊酯；分裝于250 mL三角瓶中，每瓶100 mL；分別加入pH為3.0、4.0、5.0的檸檬酸緩沖溶液10 mL，加5 g干曲，于30℃靜置100 h。同時(shí)做不加曲的空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)，測(cè)定不同酯的分解率。

1.3.4 分析方法

（1）風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

量取100 mL酯化液于500 mL蒸餾瓶中，加入100 mL蒸餾水，加熱蒸餾，接收蒸出液100 mL，采用載氣為高純氮?dú)猓M(jìn)樣口溫度200℃，檢測(cè)器溫度150℃，程序升溫（起始溫度50℃，保持8min，以5℃/min升至150℃，保持15min），分流比為10∶1，進(jìn)樣體積為1 μL的氣相色譜法檢測(cè)乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸異戊酯等風(fēng)味物質(zhì)的含量[13-14]；對(duì)照組在蒸餾之前加曲。

（2）酯分解率測(cè)定

量取100 mL混合液于500 mL蒸餾瓶中，加入100 mL蒸餾水，加熱蒸餾，接收蒸出液100 mL，采用1.3.4（1）中的氣相色譜法檢測(cè)各酯含量；對(duì)照組在蒸餾之前加曲，酶分解率計(jì)算公式如下。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸質(zhì)量濃度對(duì)大曲酯化酶活力的影響

酸類物質(zhì)是白酒中酯合成的前體，乳酸、乙酸是清香型白酒發(fā)酵中重要的兩種酸。傳統(tǒng)清香型白酒發(fā)酵過(guò)程中，酒醅中乙酸含量在1 mg/g左右，乳酸含量達(dá)20 mg/g左右[15]。添加不同質(zhì)量濃度乳酸對(duì)大曲酯化酶合成乙酸乙酯和乳酸乙酯的影響，結(jié)果如表1、表2所示。

表1 乳酸質(zhì)量濃度對(duì)大曲酯化酶合成乙酸乙酯的影響Table 1 Effect of lactic acid concentration on the synthesis of ethyl acetate byDaquesterifying enzymes

由表1可知，在對(duì)照組中，乙酸乙酯含量隨乳酸質(zhì)量濃度的增加而增加；而添加大曲后，乙酸乙酯含量隨乳酸質(zhì)量濃度的增加呈下降趨勢(shì)；差值逐漸減小并成為負(fù)數(shù)。說(shuō)明當(dāng)乳酸質(zhì)量濃度較低時(shí)，大曲中的酯化酶表現(xiàn)為合成作用，催化乙酸乙酯的合成；隨乳酸質(zhì)量濃度的增加，大曲酯化酶對(duì)乙酸乙酯合成作用減弱；至乳酸質(zhì)量濃度為16 g/L時(shí)，大曲酯化酶表現(xiàn)為水解作用?？赡苁沁^(guò)高的乳酸含量改變了酶的活性中心，使其更偏向于分解反應(yīng)，或乳酸與乙酸產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用等。

表2 乳酸質(zhì)量濃度對(duì)大曲酯化酶合成乳酸乙酯的影響Table 2 Effect of lactic acid concentration on the synthesis of ethyl lactate byDaquesterifying enzymes

由表2可知，對(duì)照組中，隨乳酸質(zhì)量濃度的增加，乳酸乙酯含量呈增加趨勢(shì)；添加大曲后，乳酸乙酯含量上升速度明顯較對(duì)照組緩慢；差值由正值變?yōu)樨?fù)值。說(shuō)明當(dāng)乳酸質(zhì)量濃度較低時(shí)，大曲中的酯化酶表現(xiàn)為合成作用，催化乳酸乙酯的合成；隨乳酸質(zhì)量濃度的增加，酯化酶對(duì)乳酸乙酯合成活力在下降；至乳酸質(zhì)量濃度為8 g/L時(shí)，大曲酯化酶表現(xiàn)為水解作用。

在對(duì)照組中，酯類的合成為單純的化學(xué)作用，乳酸質(zhì)量濃度的增加不僅使乳酸乙酯含量增加，還能促進(jìn)乙酸乙酯的合成；添加大曲后，在體積分?jǐn)?shù)20%乙醇溶液中，微生物被抑制，基本不發(fā)揮作用；酯的合成是化學(xué)合成和酯化酶催化共同作用的結(jié)果。差值可以反映大曲中的酯化酶在酯的合成中起到的作用。隨乳酸質(zhì)量濃度的增加，差值逐漸由正值變?yōu)樨?fù)值，說(shuō)明大曲中的酯化酶在酯合成中的作用在變化，由合成作用變?yōu)樗庾饔谩７治鲈蚩赡苁沁^(guò)高的酸濃度使酯化酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，增強(qiáng)了其分解活力；還可能是大曲作為pH的緩沖劑，影響了酸強(qiáng)度，減弱了酯的合成。

2.2 pH對(duì)大曲酯化酶活力的影響

酶的活性受環(huán)境pH影響極為顯著，只有在一定pH值范圍內(nèi)，酶才表現(xiàn)出活性。pH對(duì)大曲酯化酶合成乙酸乙酯及乳酸乙酯的影響，結(jié)果如表3、表4所示。

表3 pH對(duì)大曲酯化酶合成乙酸乙酯的影響Table 3 Effect of pH on the synthesis of ethyl acetate byDaqu esterifying enzymes

由表3可知，在對(duì)照組中，隨pH增大，乙酸乙酯合成量下降，pH 2.0～3.0時(shí)乙酸乙酯合成量下降顯著，pH＞3.0時(shí)，合成量都很低。添加大曲后，隨pH增大，乙酸乙酯含量出現(xiàn)反復(fù)升降，在pH為2.0時(shí)出現(xiàn)最大值，6.0時(shí)有最小值。pH值為2.0時(shí)，差值為負(fù)數(shù)，說(shuō)明大曲酯化酶起分解作用，酯的合成以化學(xué)合成為主；pH＞3.0，差值均為正值，說(shuō)明pH＞3.0時(shí)，大曲中的酯化酶能促進(jìn)乙酸乙酯的合成，酯的合成以大曲酯化酶催化為主；pH＞4.0，酯化酶對(duì)乙酸乙酯的合成能力下降。綜上分析，大曲中酯化酶合成乙酸乙酯的最適pH值在4.0左右。

表4 pH對(duì)大曲酯化酶合成乳酸乙酯的影響Table 4 Effect of pH on the synthesis of ethyl lactate byDaqu esterifying enzymes

由表4可知，在對(duì)照組中，隨pH增大，乳酸乙酯合成量下降，pH 2.0～3.0乳酸乙酯合成量下降顯著，pH＞3.0時(shí)，合成量都很低。添加大曲后，隨pH增大，乳酸乙酯含量呈先下降后上升再下降趨勢(shì)，在pH值為2.0時(shí)出現(xiàn)最大值，3.0時(shí)有最小值。pH值為2.0時(shí)，差值為負(fù)數(shù)，說(shuō)明大曲酯化酶起分解作用，酯的合成以化學(xué)合成為主；pH＞3.0，大曲中的酯化酶能促進(jìn)乳酸乙酯的合成，酯的合成以大曲酯化酶催化為主；pH＞5.0時(shí)，大曲酯化酶對(duì)乳酸乙酯合成能力下降。綜上分析，大曲酯化酶合成乳酸乙酯最適pH值為5.0左右。

2.3 pH對(duì)大曲酯化酶主要酯分解活力的影響

在含乙酸乙酯、乙酸異戊酯和乳酸乙酯的乙醇溶液中，加入pH值為3.0、4.0、5.0的檸檬酸緩沖溶液、大曲，不同時(shí)間條件下蒸酒測(cè)各種酯含量的變化。研究不同pH緩沖溶液中大曲酯化酶對(duì)各酯分解隨時(shí)間的變化情況，結(jié)果見(jiàn)圖1～圖3。

2.3.1 pH值對(duì)大曲酯化酶分解乙酸乙酯的影響

圖1 不同pH緩沖溶液中乙酸乙酯的分解率Fig.1 Decomposition rate of ethyl acetate in different pH buffer solution

由圖1可知，在對(duì)照組中，pH變化對(duì)乙酸乙酯的分解有一定影響，三種pH條件下，乙酸乙酯分解趨勢(shì)基本一致。添加大曲之后，在pH為3.0的緩沖體系中，乙酸乙酯分解趨勢(shì)與對(duì)照實(shí)驗(yàn)相似，說(shuō)明pH為3.0時(shí)，大曲酯化酶分解活力不高，對(duì)乙酸乙酯的分解不起作用，乙酸乙酯的分解以化學(xué)分解為主；pH為4.0和5.0時(shí)，乙酸乙酯分解速率加快，酯化酶表現(xiàn)出較強(qiáng)的分解活力，乙酸乙酯的分解以大曲酯化酶分解為主。說(shuō)明在較低pH條件下，大曲酯化酶對(duì)乙酸乙酯分解活力低，有利于其維持在一個(gè)較高的濃度，pH變大，大曲酯化酶對(duì)乙酸乙酯分解活力加強(qiáng)。

2.3.2 pH值對(duì)大曲酯化酶分解乙酸異戊酯的影響

由圖2可知，對(duì)于乙酸異戊酯，其分解較為迅速，在第10天時(shí)，pH=3.0對(duì)照、pH=3.0實(shí)驗(yàn)、pH=4.0對(duì)照、pH=4.0實(shí)驗(yàn)、pH=5.0對(duì)照、pH=5.0實(shí)驗(yàn)組分解率分別為57.96%、82.56%、60.98%、91.97%、66.34%、94.96%，隨pH增大，乙酸異戊酯分解速率加快。添加大曲后，三種pH條件下，分解速率都大于對(duì)照組，說(shuō)明化學(xué)分解和大曲酯化酶對(duì)乙酸異戊酯的分解都起作用。在三種pH條件下，大曲酯化酶對(duì)乙酸異戊酯分解活力都較強(qiáng)。酯的合成和分解是可逆反應(yīng)，在實(shí)驗(yàn)體系中，乙酸和異戊醇的含量都很低，故分解速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于合成速率，表現(xiàn)為酯含量下降。

圖2 不同pH緩沖溶液中乙酸異戊酯分解率Fig.2 Decomposition rate of isoamyl acetate in different pH buffer solution

2.2.3 pH值對(duì)大曲酯化酶分解乳酸乙酯的影響

圖3 不同pH緩沖溶液中乳酸乙酯的分解率Fig.3 Decomposition rate of ethyl lactate in different pH buffer solution

由圖3可知，對(duì)于乳酸乙酯的分解，在第10天時(shí)pH= 3.0對(duì)照、pH=3.0實(shí)驗(yàn)、pH=4.0對(duì)照、pH=4.0實(shí)驗(yàn)、pH=5.0對(duì)照、pH=5.0實(shí)驗(yàn)組分解率分別為26.32%、9.89%、8.07%、8.15%、2.36%、10.30%。對(duì)照組中，pH越小，乳酸乙酯的分解越快；添加大曲后，乳酸乙酯分解速率基本相同。在pH為3.0的緩沖體系中，添加大曲后乳酸乙酯分解率減小，說(shuō)明大曲酯化酶起到合成作用，抑制乳酸乙酯的分解，全部為化學(xué)分解；在pH為4.0的緩沖體系中，添加大曲對(duì)分解速率基本無(wú)影響，說(shuō)明大曲酯化酶基本不起作用，化學(xué)分解作用為主；在pH為5.0的緩沖體系中，添加大曲后乳酸乙酯分解率顯著增加，說(shuō)明兩種分解都起作用，大曲酯化酶分解作用為主。

3 結(jié)論

乳酸質(zhì)量濃度對(duì)大曲酯化酶活力有很大影響，當(dāng)乳酸質(zhì)量濃度較低時(shí)，大曲中的酯化酶表現(xiàn)為合成作用，分別在低于8 g/L和16 g/L時(shí)催化乳酸乙酯和乙酸乙酯的合成；當(dāng)乳酸質(zhì)量濃度較高時(shí)，大曲中的酯化酶表現(xiàn)為水解作用，將酯分解為相應(yīng)酸和醇。發(fā)酵過(guò)程中，乳酸質(zhì)量濃度逐漸增加。發(fā)酵前期，酯化酶對(duì)乙酸乙酯和乳酸乙酯有一定合成作用，當(dāng)乳酸質(zhì)量濃度過(guò)高時(shí)，酯化酶表現(xiàn)為抑制酯的合成，對(duì)降低乳酸乙酯含量有一定的積極意義。

pH對(duì)大曲酯化酶合成乙酸乙酯和乳酸乙酯顯著影響，pH較低（pH=2.0）時(shí)，酯的合成以化學(xué)合成為主，酯化酶起分解作用；pH在3.0～6.0范圍內(nèi)，酯的合成以大曲酯化酶催化為主。大曲酯化酶對(duì)乙酸乙酯和乳酸乙酯合成最適pH不同，pH值為4.0時(shí)，大曲酯化酶催化乙酸乙酯合成的活力最強(qiáng)；pH值為5.0時(shí)，大曲酯化酶催化乳酸乙酯合成的活力最強(qiáng)。

pH對(duì)大曲酯化酶酯分解活力影響顯著，在pH值為2.0時(shí)酯的分解主要為化學(xué)分解，pH在3.0～6.0時(shí)，化學(xué)分解和酯化酶分解都起作用。

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Esterifying enzymes activity of light-flavorDaqu

TANG Qulai1,2,LI Jingjing1,2,GUO Xuewu1,2,XIAO Dongguang1,2*(1.Key Lab of Industrial Fermentation Microbiology of Ministry of Education,Tianjin Key Lab of Industrial Microbiology,Tianjin 300457,China;2.College of Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China)

The effects of lactic acid concentration and pH on esterifying enzymes activity were discussed.The results showed that,the lactic acid concentration had great effect on esterifying enzymes activity ofDaqu.When the lactic acid concentration was low,the esterifying enzymes showed synthesis effect,catalysing ethyl lactate(lactic acid less than 8 g/L)and ethyl acetate(lactic acid less than 16 g/L)synthesis.When the lactic acid concentration was high,the esterifying enzymes showed hydrolysis effect,so the ester was decomposed into acid and alcohol.pH showed significant effect on esterifying enzymes decomposition activity ofDaqu,the decomposition of the ester was mainly chemical decomposition at pH 2.0,and chemical decomposition and esterifying enzymes decomposition both play a role at pH 3.0-6.0.The optimum pH for ethyl acetate synthesis by esterifying enzymes was 4.0,which produced 188.8 mg/L ethyl acetate at 100 h,and for the pH 5.0 buffer,it produced 182.6 mg/L ethyl lactate at 100 h.

light-flavorDaqu;esterifying enzymes;synthesis;hydrolysis

TS262.31

0254-5071（2017）01-0035-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.007

2016-06-30

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(3147172)；中國(guó)白酒3C計(jì)劃項(xiàng)目

唐取來(lái)(1991-)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)楝F(xiàn)代釀造技術(shù)。

*通訊作者：肖冬光(1956-)，男，教授，博士，研究方向?yàn)楝F(xiàn)代釀造技術(shù)。