再生障礙性貧血患者B細胞及其介導的體液免疫狀況研究

沈英英 武利強 王 博 鄧 姝 林圣云

·論 著·

再生障礙性貧血患者B細胞及其介導的體液免疫狀況研究

沈英英 武利強 王 博 鄧 姝 林圣云

目的 觀察再生障礙性貧血（AA）患者B細胞及其介導的體液免疫狀況。方法AA患者65例，其中非重型再生障礙性貧血（NSAA）35例，重型再生障礙性貧血（SAA）30例，同期正常體檢者25名（正常組）。速率散射比濁法檢測AA組與正常組免疫球蛋白（IgG、IgA及IgM）含量，比較免疫球蛋白表達情況。流式法檢測AA組與正常組CD20+、CD19+CD38+、CD5+CD19+比例。結(jié)果（1）AA組和正常組患者各免疫球蛋白濃度差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；SAA患者IgA、IgM、IgG濃度低于NSAA患者（1.46g/L比1.97g/L，P＜0.05；1.47g/L比1.50g/L，P＜0.05；10.80g/L比11.05g/L，P＜0.05）；（2）AA組B淋巴細胞亞群中CD20+比例明顯低于正常組（9.00%比12.12%，P＜0.05）；CD19+CD38+、CD19+CD5+比例明顯高于正常組（6.23%比3.80%，P＜0.05；2.43%比1.90%，P＜0.05）；SAA和NSAA患者CD20+比例差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），SAA患者CD19+CD38+、CD19+CD5+比例明顯高于NSAA患者（6.80%比4.40%，P＜0.05；7.35%比1.80%，P＜0.05）；（3）AA患者強化免疫抑制治療（IST）無效患者CD19+CD38+、CD19+CD5+比例均高于治療有效患者（12.30%比4.53%，P＜0.05；7.70%比1.93%，P＜0.05）。結(jié)論AA患者存在B淋巴細胞介導的體液免疫紊亂，B淋巴細胞功能紊亂的AA患者對IST療效差。

再生障礙性貧血；免疫球蛋白；B淋巴細胞亞群

再生障礙性貧血（aplastic anemia，AA）是一類免疫介導的造血功能衰竭綜合征。目前認為AA主要病機是T細胞功能亢進引起的免疫異常[1-2]。因此，通常采用抗胸腺細胞免疫球蛋白（ATG）/抗淋巴細胞免疫球蛋白（ALG）聯(lián)合環(huán)胞霉素A（CSA）治療。這種強化免疫抑制治療（immunosuppressive therapy，IST）雖然獲得較高的療效[3-5]，但除外早期死亡病例，10%～30%的SAA患者對上述治療無效或ATG+CSA治療后復發(fā)，對于這部分對IST應答較差的AA患者，目前沒有統(tǒng)一并且有效的治療方法。骨髓移植雖然療效顯著，但也僅有30%的AA患者可以找到相合的同胞供體，若再涉及到身體狀況等其他因素，許多患者不能得到適合的骨髓移植治療。針對部分再障患者療效較差的治療現(xiàn)狀，我們推測B淋巴細胞及其介導的異常體液免疫在部分AA的發(fā)病機制中可能存在（尤其是在對IST無效的患者中），我們從B淋巴細胞介導的體液免疫的角度來探究其在AA中的作用和機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2014年4月—2014年10月在浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院血液科住院的AA患者65例，男34例，女31例，年齡16～70歲，平均（40.46± 15.85），重型再生障礙性貧血（severe aplastic anemia，SAA）30例，非重型再生障礙性貧血（non severe aplastic anemia，NSAA）35例，IST治療有效44例，IST治療無效21例。正常組25名，為同期本院健康體檢者，男13名，女12名，年齡25～55歲，平均（42.0±11.30）歲。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

1.2 試 劑 CD3、CD5、CD19、CD20及CD38等各種熒光標記單克隆抗體為美國Beckman Coulter公司產(chǎn)品（試劑批號分別為A07749、A08932、A04929、A054659、A07778）。

1.3 方 法

1.3.1 標本采集 AA患者治療前及治療后3個月各取外周靜脈血2mL置于干燥管內(nèi)，室溫自然凝固30min，3000r/min離心20min分離血清，分裝后置于-80℃冰箱凍存。正常組取2mL外周靜脈血置于干燥管內(nèi)，用同樣方法分離和凍存血清。

1.3.2 檢測方法 速率散射比濁法測定血清免疫球蛋白。流式法檢測B淋巴細胞亞群。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0軟件，分類資料采用卡方檢驗，各組數(shù)據(jù)以均值±標準差（±s）表示。偏態(tài)分布資料采用中位數(shù)與四分位數(shù)[M（P25，P75）]表示，用非參數(shù)統(tǒng)計方法Mann-whitney U進行秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 AA組患者與正常組免疫球蛋白濃度比較 AA組和正常組的各免疫球蛋白濃度差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；NSAA組免疫球蛋白濃度（IgA、IgM、IgG）高于SAA組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1～2。

表1 AA組患者和正常組免疫球蛋白濃度比較[（g/L），M（P25，P75）]

表2 NSAA組和SAA組患者免疫球蛋白濃度比較[（g/L），M（P25，P75）]

2.2 AA組患者和正常組B淋巴細胞亞群比較 AA組患者B淋巴細胞亞群中CD20+比例明顯低于正常組（P＜0.05）；CD19+CD38+、CD19+CD5+比例明顯高于正常組（P＜0.05），見表3。SAA組和NSAA組間CD20+比例差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），CD19+ CD38+、CD19+CD5+比例SAA組明顯高于NSAA組（P＜0.05），見表4。AA患者IST治療無效組患者CD19+CD38+、CD19+CD5+比例均高于有效組患者（P＜0.05），見表5。

3 討論

免疫紊亂引起造血抑制是AA的重要發(fā)病機制之一。人體內(nèi)T淋巴細胞介導的細胞免疫和B淋巴細胞介導的體液免疫相互聯(lián)系，相互依存。研究[6]表明，AA患者骨髓中B細胞通過協(xié)同刺激因子影響調(diào)節(jié)性T細胞（CD4+CD25highFoxp3+Treg）導致T細胞異常活化，進而使骨髓造血功能衰竭。也有研究從AA患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)針對自身抗原的特異性抗體以及血清中IgG片段[7]。研究者在AA患者體內(nèi)檢出了針對自身抗原的特異性抗體，認為自身特定抗原在引起T細胞克隆性增殖以及細胞免疫功能異常的同時，也能夠引起B(yǎng)淋巴細胞介導的體液免疫紊亂。

表3 AA組患者和正常組B細胞亞群比較[%，M（P25，P75）]

表4 NSAA組和SAA組患者B細胞亞群計數(shù)比較[%，M（P25，P75）]

表5 IST治療有效組和IST治療無效組B細胞亞群計數(shù)比較[%，M（P25，P75）]

免疫球蛋白由正常漿細胞產(chǎn)生，能夠識別并特異性結(jié)合抗原，參與人體的體液免疫，具有激活補體以及抗菌抗病毒作用。AA患者免疫球蛋白的表達情況目前尚無明確的定論，大多數(shù)學者認為AA患者I-gA、IgG、IgM濃度比健康人群偏低，治療后患者血象恢復時復查該水平可見表達較前升高[8]。也有研究認為免疫球蛋白濃度在AA患者和健康人之間無差異[9]。近期一項研究[10]檢測全血細胞減少癥患者骨髓單個核細胞膜抗體類型發(fā)現(xiàn)復發(fā)患者以IgG為主，并認為產(chǎn)生IgG是激活記憶B細胞的主要生物學功能，IgG的升高與疾病難治及復發(fā)有關。本研究發(fā)現(xiàn)，AA組外周血免疫球蛋白較正常組雖有下降，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。SAA患者的免疫球蛋白（IgM、IgG）濃度明顯低于NSAA組（P＜0.05），可能與AA存在骨髓及造血微環(huán)境的缺陷，不能有效支持B細胞正常分化和增殖有關，也可能與Th細胞功能異常，不能有效激活B細胞，引起免疫球蛋白的產(chǎn)生功能障礙；而免疫球蛋白的下降使得機體抗感染能力降低，增加了感染風險，這可能在一定程度上影響到疾病的預后。

CD5+CD19+B淋巴細胞是B淋巴細胞的一個分支，CD5分子是一個高分子糖蛋白，目前已有多項研究發(fā)現(xiàn)在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、重癥肌無力等疾病中存在CD5+B細胞升高[11-12]。CD5+CD19+B細胞可識別多種細菌表面抗原，包括細菌表面的多糖、脂多糖（LPS），尤以碳水化合物反應最強，是機體抵抗外來病原微生物感染的第一道防線[13]。它同時具有抗原提呈，產(chǎn)生自身抗體和促炎細胞因子的功能。CD19分子存在于B淋巴祖細胞分化以及成熟的全過程，是B淋巴細胞的限制性抗原。其能夠調(diào)節(jié)B淋巴細胞的活化及增殖，以及參與B淋巴細胞信號的傳導，代表了B淋巴細胞活化與增殖水平。骨髓單個核細胞中CD19+細胞增加可能提示存在體液免疫紊亂[14]。CD38+為B淋巴細胞膜表面激活標志，與B淋巴細胞的發(fā)育成熟有關。通過與T細胞受體及B細胞受體的結(jié)合，CD38參與T淋巴細胞的共刺激,其表達陽性可以作為B淋巴細胞活化的標志。本研究發(fā)現(xiàn)正常人B淋巴細胞亞群基本上不表達或低表達，說明在生理狀態(tài)下，B淋巴細胞處于靜止狀態(tài)，基本上無B淋巴細胞的激活。本研究顯示，AA患者的CD20+B淋巴細胞數(shù)量明顯低于正常組（P＜0.05），提示大部分患者的B淋巴細胞功能低下，這也與Sevilla等[15]研究相似，他們發(fā)現(xiàn)AA患者B細胞表達明顯減低，但在移植后完全恢復。結(jié)果還顯示AA組患者CD19+CD38+B淋巴細胞、CD19+CD5+B淋巴細胞數(shù)量明顯高于正常組，SAA組患者CD19+CD38+B淋巴細胞、CD19+CD5+B淋巴細胞數(shù)量明顯高于NSAA組患者（P＜0.05）。CD19+CD5+B淋巴細胞數(shù)量的升高可能與Th2或者感染因素對CD5+CD19+B淋巴細胞的激活有關[13]，可以解釋SAA容易受到細菌侵襲；CD5+ CD19+B淋巴細胞的數(shù)量增高可能提示AA患者受到了某些抗原的刺激，通過抗原提呈，產(chǎn)生自身抗體和促炎細胞因子，參與SAA的發(fā)病。CD19+CD38+B淋巴細胞也是活化的B淋巴細胞，對白細胞各亞型作用明顯，因此認為它可能與AA的發(fā)病存在關聯(lián)。根據(jù)AA患者對IST應答率，CD5+CD19+B淋巴細胞、CD19+CD38+B淋巴細胞升高者，IST治療效果均減低，提示B淋巴細胞功能紊亂患者對常規(guī)IST治療效果較差。

機體免疫系統(tǒng)的調(diào)控機制廣泛而復雜，以T淋巴細胞為主的細胞免疫和B淋巴細胞為主的體液免疫相互聯(lián)系、相互影響。B細胞可以通過協(xié)同刺激分子以及調(diào)節(jié)性T淋巴細胞影響T細胞的活化增殖和凋亡，引起AA的發(fā)病。B淋巴細胞及其介導的體液免疫對AA的發(fā)病機制有著重要的作用和影響。CD5+CD19+B淋巴細胞、CD19+CD38+B淋巴細胞增高，導致自身抗體的產(chǎn)生是B細胞抑制造血的原因之一[16]，可以為針對B細胞功能紊亂的治療如丙種球蛋白和抗CD20單抗提供理論依據(jù)和參考。本研究因AA患者的血細胞較少，抗體的檢測僅進行了ELISA法，若通過Western-Blot法檢測，可能準確率更高。

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（收稿：2016-05-26 修回：2016-08-12）

B Lymphocytes and Humoral Immunity in Patients with Aplastic Anemia

SHEN Yingying,WU Liqiang, WANG Bo,DENG Shu,LIN Shengyun.Department of Hematology,Zhejiang Chinese Medical Hospital,Hangzhou (310006),China

Objective To investigate the changes and clinical significance of B-lymphocyte subsets and the humoral immunity in aplastic anemia（AA）patients.MethodsSixty-five AA patients were recuited in this study,of which 35 were non-severe AA（NSAA）patients and 30 were severe AA（SAA）patients.Twenty-five healthy subjects served as controls.Rate immune scatter turbidimetry was used to detect the concentration of immunoglobulin（IgA, IgM and IgG）in AA patients and controls.Flow cytometry assay was used to determine the expression of CD20+B lymphocytes,activated CD19+CD38+B lymphocytes,and B lymphocyte subset CD5+CD19+.ResultsNo significant difference in immunoglobulin concentrations was found between AA group and control group（P＞0.05）,while the concentrations of IgA,IgM,and IgG in SAA group were lower than those in NSAA group（1.46 g/L vs 1.97 g/L;1.47 g/L vs 1.50 g/L;10.80 g/L vs 11.05 g/L;all P＜0.05）.The expression of CD20+B lymphocytes in AA group was significantly lower than that of control group（9.00%vs 12.12%,P＜0.05）;the expression of CD19+CD38+,CD19+CD5+ B lymphocytes in AA group was significantly higher than that of control group（6.23%vs 3.80%;2.43% vs 1.90%;all P＜0.05）;no difference in CD20+B lymphocytes expression was noted between SAA group and NSAA group（P＞0.05）,but CD19+CD38+,CD19+CD5+B lymphocytes expression in SAA group were higher than those in NSAA group（6.80%vs 4.40%;7.35%vs 1.80%;P＜0.05）.AA patients who were responding to immunosuppressive therapy had a significantly lower expression of CD19+CD38+,and CD19+CD5+B lymphocytes than those of transfusion dependent patients（4.53%vs 12.30%;1.93%vs 7.70%;all P＜0.05）.ConclusionB lymphocytes me－diated humoral immune disorder exists in AA patients,and the patients with dysfunction B lymphocytes show poor therapeutic effect.

aplastic anemia;immunoglobulin;B lymphocyte subsets

國家中醫(yī)臨床研究基地業(yè)務建設科研專項（No.JDZX2015121）；浙江省公益性技術應用研究計劃（No.2014c33273）

浙江省中醫(yī)院血液科（杭州310006）

林圣云，Tel：18072946912；E-mail：syy19881029@163.com