哺乳動(dòng)物TRPM1密碼子使用偏性及其聚類分析

李麗莎+李祥龍

摘要：瞬時(shí)受體勢(shì)M亞基1（Transient receptor potential melastatin 1，TRPM1）是一種非選擇性離子通道，主要通透Ca2+等二價(jià)金屬陽(yáng)離子。利用CodonW軟件對(duì)15種哺乳動(dòng)物TRPM1基因序列進(jìn)行分析，比較了同義密碼子相對(duì)使用度形成的聚類和編碼區(qū)形成的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果表明，哺乳動(dòng)物TRPM1基因?qū)CC、CAC、ATC、CTG、AAC、CCC、CAG、TCC、GTG和TAC密碼子的使用存在偏好性，但終止密碼子的使用不存在種屬差異。密碼子偏愛(ài)指數(shù)、有效密碼子數(shù)、GC含量和密碼子第三位的GC含量均能影響哺乳動(dòng)物TRPM1基因所用密碼子。兩種聚類結(jié)果顯示，由編碼區(qū)形成的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)能更準(zhǔn)確反映物種間的親緣關(guān)系。

關(guān)鍵詞：哺乳動(dòng)物；TRPM1；密碼子偏好性；聚類分析

中圖分類號(hào)：O755 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）20-5378-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.054

Abstract： Transient receptor potential melastatin-1 is a kind of nonselective cation channels，mainly through a divalent metal cations such as Ca2+. CodonW software was applied to analyze sequences of TRPM1 gene in 15 kinds of mammals，comparing clustering of relative synonymous codon usage and phylogenetic tree of coding region. The result showed that GCC，CAC，ATC，CTG，AAC，CCC，CAG，TCC，GTG and TAC were found to have the use of codon usage bias，but there is no difference between species in the use of termination codon. Codon bias index，effective number of codon，GC-content and G+C content of the third codon position can affect the codon usage of TRPM1 gene in mammals. The two kinds of clustering results show that phylogenetic tree of coding region more accurately reflect the genetic relationship between the species.

Key words： mammal； TRPM1； codon bias； cluster analysis

mRNA作為蛋白質(zhì)合成的模板，是通過(guò)三聯(lián)密碼來(lái)實(shí)現(xiàn)與蛋白質(zhì)的聯(lián)系。三聯(lián)密碼子的個(gè)數(shù)為64，其中編碼20種氨基酸的密碼子有61個(gè)，每種編碼蛋白質(zhì)的氨基酸至少被1種密碼子編碼，每種氨基酸最多可被6種密碼子編碼，如亮氨酸（TTA、TTG、CTT、CTC、CTA和CTG）和精氨酸（AGA、AGG、CGT、CGC、CGA和CGG）。編碼同一氨基酸的密碼子稱為同義密碼子。從mRNA到蛋白質(zhì)的過(guò)程中，同義密碼子的使用概率并不一致[1，2]，某一物種或某一基因會(huì)有使用一種或幾種特定的同義密碼子的傾向，這些密碼子即為最優(yōu)密碼子，該種使用傾向即為密碼子偏性[3]。對(duì)于密碼子偏性的影響因素的報(bào)道有很多，如基因的表達(dá)水平[4，5]、翻譯起始效應(yīng)[6，7]、堿基的組分[8]、某些二核苷酸出現(xiàn)的頻率[9，10]、GC含量[11，12]、基因長(zhǎng)度[13]、tRNA的豐度[14，15]、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)[16]、蛋白質(zhì)疏水水平[17]及密碼子-反密碼子間的結(jié)合能力[18]等都會(huì)在一定程度上影響密碼子的使用。

瞬時(shí)受體勢(shì)（Transient receptor potential）基因首先于果蠅突變體的光感受器中發(fā)現(xiàn)[19]，已被成功克隆[20]。Trp基因編碼一種通透Ca2+的陽(yáng)離子通道，并將該陽(yáng)離子通道命名為瞬時(shí)受體點(diǎn)位（TRP）[21]。TRP存在于多種哺乳動(dòng)物組織中，參與基因轉(zhuǎn)錄、肌肉收縮、遞質(zhì)釋放以及細(xì)胞增殖、分化、凋亡和死亡等生理功能[22]。根據(jù)編碼氨基酸序列的不同，TRP基因超家族可分為：TRPA、TRPC、TRPN、TRPM、TRPML、TRPP和TRPV 7個(gè)家族，還包含多個(gè)亞型[4，5]。其中TRPM家族僅在哺乳動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，該家族含有8種亞基：TRPM1～TRPM8，這些亞基能在體內(nèi)形成同聚體或異聚體通道。該家族共有結(jié)構(gòu)：較長(zhǎng)的N末端及C末端，且一些亞基的C末端存在完整的酶結(jié)構(gòu)域，這也構(gòu)成了該家族最大的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)[23]。瞬時(shí)受體勢(shì)M亞基1（Transient receptor potential melastatin 1，TRPM1）屬于一種非選擇性離子通道，主要通透Ca2+等二價(jià)金屬陽(yáng)離子[24，25]，是最先被發(fā)現(xiàn)的TRPM家族成員[26]。研究表明，該基因的表達(dá)與黑色素瘤的惡性程度呈負(fù)相關(guān)，在機(jī)體中可能行使腫瘤抑制因子的作用[27]，而且在新生黑色素表皮中，該基因的表達(dá)與黑色素含量也相關(guān)，對(duì)正常黑色素細(xì)胞的著色有重要影響，已被認(rèn)定是潛在的色素變異基因，和純白色表型顯著相關(guān)[28]。

關(guān)于密碼子偏性的研究大多集中在確定其影響因素上，鮮有對(duì)一些重要功能基因及物種進(jìn)化關(guān)系的分析報(bào)道[29]。本研究以TRPM1基因作為研究對(duì)象，分析并比較了不同哺乳動(dòng)物密碼子使用偏性和影響因素，再通過(guò)兩種方法構(gòu)建該基因的建物種進(jìn)化關(guān)系，以期為TRPM1基因分類、結(jié)構(gòu)和功能的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 序列數(shù)據(jù)來(lái)源

15種物種TRPM1基因完整編碼區(qū)核苷酸序列均來(lái)自于NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2 密碼子偏性分析指標(biāo)

利用CodonW軟件分析TRPM1基因的同義密碼子相對(duì)使用度（Relative synonymous codon usage，RSCU）、密碼子偏愛(ài)指數(shù)（CBI）、有效密碼子數(shù)（ENS）、GC含量（GC）和密碼子第三位的GC含量。

1.3 聚類分析

通過(guò)Clustal W 2.1軟件比對(duì)15種哺乳動(dòng)物TRPM1基因編碼區(qū)核苷酸序列，利用MEGA6.0軟件中的最大似然法對(duì)TRPM1基因編碼區(qū)構(gòu)建聚類樹(shù)狀圖，該樹(shù)的可靠性由1 000次重復(fù)的自舉檢驗(yàn)法來(lái)檢驗(yàn)。

通過(guò)SPSS19.0軟件對(duì)哺乳動(dòng)物TRPM1基因密碼子使用偏性的歐式平方距離系數(shù)進(jìn)行聚類分析，除去色氨酸（TGG）、甲硫氨酸（ATG）及3個(gè)終止密碼子（TAA、TAG、TGA），剩余的59個(gè)密碼子相對(duì)使用度被認(rèn)為是一個(gè)變量，計(jì)算同義密碼子相對(duì)使用度的歐式平方距離，該值可用于評(píng)定各物種基因間的距離。2個(gè)基因間密碼子使用偏性的歐式平方距離系數(shù)公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 不同物種CBI、ENc、GC和CG3s值分析

由表1可知，所有物種的CBI值均較小，接近0，表明不同哺乳動(dòng)物對(duì)TRPM1基因的所有密碼子幾乎全部隨機(jī)使用；家兔和雙峰駝的ENc值較小，分別為48.03和49.91，其他物種的ENc值都大于50，但均表明各物種TRPM1基因各密碼子在編碼氨基酸時(shí)出現(xiàn)的頻率較為一致，密碼子偏性較弱；由GC含量及其GC3s值可知，東非狒狒、黑猩猩、蒙古野馬、人和家貓對(duì)A或T存在偏好性，褐家鼠、小家鼠、家牛、野牛、雙峰駝、單峰駝、家兔、山羊和綿羊?qū)或C存在偏好性，只有野豬的G+C和A+T使用不存在偏性，但GC3s值高于0.5，表明密碼子第三位對(duì)G或C存在一定程度的偏好性。

2.2 不同物種RSCU值分析

由表2可知，15種物種均對(duì)GCC、CAC、ATC、CTG、AAC、CCC、CAG、TCC、GTG和TAC這10種密碼子的使用存在偏性，大部分物種對(duì)TGC、GAC、GGC、GGA、AAG、CTC、AGA、AGG、CGG、AGC、ACC和ACA這12種密碼子的使用存在偏性。在這些具有偏好性的密碼子中，幾乎全為G或C結(jié)尾的密碼子。對(duì)于終止密碼偏好性的研究，發(fā)現(xiàn)使用TAG終止密碼子的物種為東非狒狒、黑猩猩、人、山羊和綿羊，只有小家鼠使用TGA終止密碼子，其余物種的終止密碼子為TAA。推測(cè)終止密碼子的使用不存在種屬偏性。

2.3 密碼子使用偏性的影響因素分析

由表3可知，CBI與GC、GC3s均呈顯著正相關(guān)，與ENc呈顯著負(fù)相關(guān)；ENc與GC、GC3s呈顯著負(fù)相關(guān)；GC和GC3s呈顯著正相關(guān)，且GC含量是影響哺乳動(dòng)物TRPM1基因密碼子偏性的主要因素。Aromo和Gravy與其他密碼子偏性指標(biāo)的相關(guān)性均不明顯。結(jié)果表明，密碼子偏愛(ài)指數(shù)、有效密碼子數(shù)、GC含量和密碼子第三位的GC含量均能對(duì)哺乳動(dòng)物TRPM1基因所用密碼子的偏性有影響，而芳香族氨基酸的含量和蛋白疏水水平對(duì)該基因所用密碼子的偏性影響不大。

2.4 聚類分析結(jié)果

2.4.1 基于編碼區(qū)的聚類分析 本研究所用的15種動(dòng)物按照動(dòng)物學(xué)分類可分為6個(gè)不同的目，分別是偶蹄目、奇蹄目、食肉目、靈長(zhǎng)目、兔形目和嚙齒目。由圖1可知，家牛、野牛、山羊、綿羊、野豬、雙峰駝和單峰駝之間的距離較近，且這些動(dòng)物均屬于偶蹄目；東非狒狒、黑猩猩和人之間的距離較近，且其均屬于靈長(zhǎng)目；褐家鼠和小家鼠聚成一簇，屬于嚙齒目。蒙古野馬（奇蹄目）和家貓（食肉目）聚成一簇。結(jié)果表明，這2個(gè)物種TRPM1基因之間的同源性較高，推測(cè)某些功能較為一致。由樹(shù)中分支位置的數(shù)值可知，最低置信度為87，因此基于TRPM1基因編碼區(qū)形成的聚類樹(shù)狀圖能夠真實(shí)反映不同物種TRPM1基因的親緣關(guān)系。

2.4.2 基于密碼子使用偏性的聚類分析 由圖2可知，基于TRPM1基因的RSCU值聚類樹(shù)狀圖共形成兩大類，其中雙峰駝和單峰駝距離較近，家牛、山羊、野牛和綿羊之間的距離較近，褐家鼠和小家鼠距離較近，蒙古野馬、野豬和家貓之間的距離較近。但發(fā)現(xiàn)家兔和雙峰駝、單峰駝的距離近于其他的偶蹄目，且蒙古野馬、野豬和家貓聚成一小類，這與動(dòng)物學(xué)分類不符，并且由密碼子使用偏性構(gòu)建的聚類無(wú)置信度的檢測(cè)，因此推測(cè)基于TRPM1基因RSCU值形成的聚類樹(shù)狀圖并不能真實(shí)反映不同物種TRPM1基因的親緣關(guān)系。

3 討論

本研究分析了不同哺乳動(dòng)物TRPM1基因密碼子的使用特征，基于同義密碼子相對(duì)使用度得到的哺乳動(dòng)物TRPM1基因均對(duì)GCC、CAC、ATC、CTG、AAC、CCC、CAG、TCC、GTG和TAC密碼子的使用存在偏好性，而這些密碼子的第三位都以C或G結(jié)尾，這可能與Crick在1996年提出的“擺動(dòng)假說(shuō)”（Wobble hypothesis）里闡述的規(guī)律相關(guān)，即核糖體提供的環(huán)境使氨基酸專一的密碼子的前兩個(gè)堿基與相應(yīng)tRNA上反密碼子的第2、3堿基互補(bǔ)配對(duì)，但密碼子的第3個(gè)堿基（3′端）與反密碼子5′端堿基的配對(duì)專一性相對(duì)較差，從而使第三位堿基呈現(xiàn)“擺動(dòng)”現(xiàn)象。由于反密碼子第一位堿基常為修飾過(guò)的堿基，很少會(huì)使用U，更少會(huì)使用A，這樣就造成被識(shí)別的密碼子的第三位使用G或C的頻率較高[29]。

研究表明，低復(fù)雜度的真核生物（如酵母）和無(wú)脊柱動(dòng)物主要使用終止密碼子TAA；真核生物，尤其是脊椎動(dòng)物主要使用TGA，而TAG的使用幾率很低[30]。但本研究分析得到不同哺乳動(dòng)物TRPM1基因的終止密碼子的使用不存在偏好性，這可能是由終止密碼子使用根據(jù)物種及基因的不同而存在差異造成的。

本研究利用不同哺乳動(dòng)物同種基因，使結(jié)果基本不受基因長(zhǎng)度和蛋白結(jié)構(gòu)的影響，對(duì)不同哺乳動(dòng)物TRPM1基因密碼子使用偏性的影響因素進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)密碼子偏愛(ài)指數(shù)、有效密碼子數(shù)、GC含量和密碼子第三位的GC含量均可影響哺乳動(dòng)物TRPM1基因所用密碼子的偏性，而芳香族氨基酸的含量和蛋白疏水水平對(duì)該基因所用密碼子的偏性影響不大。在這些影響因素中，GC含量是影響哺乳動(dòng)物TRPM1基因密碼子偏性的主要因素，這與Knight等[31]、張之一等[29]、劉慶坡等[32]研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)大部分哺乳動(dòng)物偏向使用G或C堿基，東非狒狒、黑猩猩和人等哺乳動(dòng)物偏性使用A或T堿基，侯卓成等[33]認(rèn)為基因表達(dá)水平與GC含量、密碼子第三位的GC含量呈正比，但關(guān)于哺乳動(dòng)物TRPM1基因的表達(dá)水平還需要實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究分析和比較的哺乳動(dòng)物TRPM1基因兩種聚類方法，發(fā)現(xiàn)由同義密碼子相對(duì)使用度的聚類結(jié)果與傳統(tǒng)的動(dòng)物學(xué)分類上之間存在差異，而由該基因編碼區(qū)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果更符合動(dòng)物學(xué)分類。研究表明，基于密碼子偏好性的聚類并不能完全、真實(shí)地反映親緣關(guān)系[34]，這與劉漢梅等[35]、晁岳恩等[36]、郭秀麗等[37]的研究結(jié)果一致。此種現(xiàn)象可能是在進(jìn)化過(guò)程中，單基因可能存在較大的突變（自然選擇和隨機(jī)漂變等因素均能引起突變）導(dǎo)致其密碼子使用偏性發(fā)生較大的變化，造成與真實(shí)的分類地位不同。提示對(duì)于今后的物種分類不能只局限于堿基序列組成成分的分析，需結(jié)合多個(gè)水平綜合判斷物種間的遺傳關(guān)系，才能得出更為精確的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果。

4 結(jié)論

本研究對(duì)不同哺乳動(dòng)物TRPM1基因密碼子使用的偏好性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這些物種均對(duì)GCC、CAC、ATC、CTG、AAC、CCC、CAG、TCC、GTG和TAC密碼子的使用存在偏好性，且這些密碼子都以C或G結(jié)尾，而終止密碼子的使用不存在種屬差異。在本研究所用的物種中，東非狒狒、黑猩猩、蒙古野馬、人和家貓對(duì)A或T存在偏好性，褐家鼠、小家鼠、家牛、野牛、雙峰駝、單峰駝、家兔、山羊和綿羊?qū)或C存在偏好性，只有野豬的G+C和A+T使用不存在偏性。通過(guò)分析影響密碼子偏好性的因素中，發(fā)現(xiàn)密碼子偏愛(ài)指數(shù)、有效密碼子數(shù)、GC含量和密碼子第三位的GC含量均能影響哺乳動(dòng)物TRPM1基因所用密碼子，而芳香族氨基酸的含量和蛋白疏水水平對(duì)該基因所用密碼子的偏性影響不大。本研究利用2種不同方法分析該基因在進(jìn)化過(guò)程中的遠(yuǎn)近關(guān)系，發(fā)現(xiàn)基于編碼區(qū)形成的聚類圖更能準(zhǔn)確反映物種間的親緣關(guān)系。

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