枯草芽孢桿菌PNG27生產(chǎn)凝乳酶的發(fā)酵工藝優(yōu)化及分離純化研究

陳蕊，別小妹，呂鳳霞，趙海珍，張充，陸兆新

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇 南京，210095)

枯草芽孢桿菌PNG27生產(chǎn)凝乳酶的發(fā)酵工藝優(yōu)化及分離純化研究

陳蕊，別小妹，呂鳳霞，趙海珍，張充，陸兆新*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇 南京，210095)

通過單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)、Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，使最終發(fā)酵液凝乳酶活力達(dá)到222.34 ± 4.99 U/mL。采用乙醇分級(jí)沉淀、DEAE-纖維素離子交換柱層析和Sephadex G-100分子篩等分離手段對(duì)枯草芽孢桿菌PNG27凝乳酶進(jìn)行分離純化，得到電泳純的凝乳酶。結(jié)果表明，酶的比活力達(dá)到794.30 U/mg，純化倍數(shù)為8.29倍，最終回收率為4.25%，SDS-PAGE電泳分析凝乳酶分子質(zhì)量約為42 kDa。

枯草芽孢桿菌；凝乳酶；發(fā)酵優(yōu)化；分離純化

干酪生產(chǎn)所用的凝乳酶主要是從未斷奶的小牛第四胃中提取的活性皺胃酶，隨著干酪市場的發(fā)展，凝乳酶的需求量大增，單純依靠屠宰大量小牛獲取凝乳酶顯然與現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展需求不相符[1-3]。因此，研究開發(fā)不同來源的凝乳酶替代小牛凝乳酶已成為當(dāng)前干酪工業(yè)發(fā)展的重點(diǎn)[4]。目前，國際市場上的凝乳酶主要有動(dòng)物源凝乳酶、植物源凝乳酶以及微生物源凝乳酶[5]。動(dòng)物源凝乳酶的凝乳活力與蛋白水解能力的比值高，但是動(dòng)物生長較慢且價(jià)格較高，不適應(yīng)當(dāng)今發(fā)展的需要；植物源凝乳酶凝乳能力強(qiáng)，脂肪損失少，但其制成的干酪有一定的苦味且生產(chǎn)受時(shí)間、地域等條件制約[6-8]；而微生物源凝乳酶憑借其凝乳活力高、產(chǎn)量大、生長期短、成本低、制備簡單、易于控制等優(yōu)點(diǎn)成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[9]。

自1968年ARIMA[10]發(fā)現(xiàn)真菌微小毛霉(Mucorpusillus)可產(chǎn)生高活力的凝乳酶后，國外研究者對(duì)真菌來源凝乳酶進(jìn)行了大量研究，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)毛霉屬、曲霉屬等真菌可產(chǎn)凝乳酶。目前已發(fā)現(xiàn)有100余種微生物可生產(chǎn)一定活力的凝乳酶，主要是真菌、放線菌、細(xì)菌等。相對(duì)于真菌的固態(tài)發(fā)酵，細(xì)菌深層發(fā)酵產(chǎn)酶擁有更高的材料利用率且更易于控制[11]，目前細(xì)菌凝乳酶的研究報(bào)道主要包括枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[12]、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)[13]、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)[14]和地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)[15]等等。

枯草芽孢桿菌是一種非常重要的產(chǎn)酶菌，主要原因在于它能夠產(chǎn)生和分泌大量的胞外酶，也是目前國內(nèi)外報(bào)道較多的產(chǎn)凝乳酶的細(xì)菌[6]?？莶菅挎邨U菌所產(chǎn)凝乳酶熱穩(wěn)定性好且對(duì)牦牛乳具有更高的凝乳活性，所以運(yùn)用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)凝乳酶的相關(guān)研究對(duì)牦牛乳工業(yè)具有比較深遠(yuǎn)的意義[12]。

本研究利用枯草芽孢桿菌PNG27發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶，通過單因素試驗(yàn)、PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)、Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化；并對(duì)發(fā)酵液采用乙醇分級(jí)沉淀，DEAE-纖維素離子交換層析和Sephadex G-100分子篩層析得到電泳純的凝乳酶，為后續(xù)的實(shí)踐應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

菌種： 枯草芽孢桿菌PNG27，本實(shí)驗(yàn)室保存。

培養(yǎng)基： 營養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基；BPY培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基:麩皮40.0 g，蔗糖40.0 g，NaCl 10.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH=7.0。

1．2 儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱、全溫?fù)u瓶柜、高速冷凍離心機(jī)、DF-1集熱式磁力加熱攪拌器、HL-2恒流泵、DBS-100電腦全自動(dòng)部分收集器、UV-2450型紫外分光光度計(jì)、數(shù)顯恒溫水浴鍋、熒光酶標(biāo)儀。

1．3 實(shí)驗(yàn)方法

1．3．1 菌種活化及種子液制備

從保藏的枯草芽孢桿菌PNG27中挑取部分接到NA斜面，于37 ℃培養(yǎng)24 h，然后將BPY培養(yǎng)基作為種子培養(yǎng)基，從活化后的菌株斜面上轉(zhuǎn)移菌株至BPY培養(yǎng)基中(接種量為2環(huán))，37 ℃，180 r/min條件下培養(yǎng)11 h作為種子液。

1．3．2 培養(yǎng)基優(yōu)化

1.3.2.1 單因素試驗(yàn)

按1.3.1 方法制備種子液，產(chǎn)凝乳酶的培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)改變各參數(shù)的變量。在單因素試驗(yàn)中，麩皮含量為1%、2%、3%、4%、5%；選取最適麩皮含量后以20 g/L的葡萄糖、蔗糖、小麥粉、玉米粉和乳糖作為復(fù)合碳源添加，考察復(fù)合碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響，選取最適復(fù)合碳源，研究碳源濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響；確定碳源后以10 g/L的NaCl、CaCl2、MgCl2、KCl、ZnCl2作為金屬離子添加，考察金屬離子對(duì)產(chǎn)酶的影響，選取最適金屬離子研究其濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響。

確定最佳麩皮含量、復(fù)合碳源和金屬離子后，試驗(yàn)同樣采用單因素優(yōu)化的方法對(duì)枯草芽孢桿菌PNG27液體發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶的培養(yǎng)條件包括接種量、裝液量、初始pH、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化研究。分別以1%、2%、3%、4%、5%、6%的接種量接種；100 mL 三角瓶中的裝液量依次采用10、20、30、40、50 mL；培養(yǎng)基初始pH 依次采用5、6、7、8、9；培養(yǎng)溫度依次采用27、30、33、37、40 ℃；發(fā)酵時(shí)間依次采用12、24、36、48、60 h，搖床培養(yǎng)后分別測定凝乳酶活力，每個(gè)試驗(yàn)均為平行試驗(yàn)取平均值。

1.3.2.2 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)1.3.2.1中對(duì)碳氮源、金屬離子及發(fā)酵條件的篩選，枯草芽孢桿菌PNG27的發(fā)酵培養(yǎng)基的影響因素為麩皮、蔗糖、NaCl的添加量，發(fā)酵條件為接種量、初始pH、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和裝液量。試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析和模型建立都采用軟件Design-Expert(Version8.0.5，Stat-Ease Inc)，每組試驗(yàn)3次重復(fù)，結(jié)果取平均值。

1.3.2.3 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果中篩選出對(duì)凝乳活性影響顯著的因素，結(jié)合因素的效應(yīng)大小和試驗(yàn)中的實(shí)際情況，選擇中心點(diǎn)和各水平的步長，各水平及代碼。借助試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析軟件Design-Expert(version8.0.5，Stat-Ease Inc.)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1．3．3 分離純化

1.3.3.1 乙醇分級(jí)沉淀

1 000 mL枯草芽孢桿菌凝乳酶的發(fā)酵液經(jīng)8 000 r/min 離心10 min，離心溫度4 ℃，收集上清液。將上清液置于磁力攪拌器中攪拌，冰浴條件下，緩慢加入預(yù)先冷卻的乙醇，使其體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%，8 000 r/ min 離心10 min，離心溫度4 ℃，收集上清液。冰浴條件下繼續(xù)向上清液中緩慢加入預(yù)先冷卻的乙醇，使其飽和度達(dá)到70%，4 ℃靜置過夜。8 000 r/ min 離心15 min，離心溫度4 ℃，棄上清液，沉淀溶于0.05 mol/L的磷酸鈉緩沖液中即得粗酶液。

1.3.3.2 DEAE-纖維素離子交換層析

取1 mL 粗酶液，采用高鹽離子濃度梯度分離純化蛋白，DEAE-纖維素離子交換層析柱預(yù)先用0.05 mol/L，pH值為6.8的磷酸鈉緩沖液平衡，以含有不同NaCl濃度(0、0.1、0.3、0.5 mol/L)的0.05 mol/L，pH值為6.8的磷酸鈉緩沖液進(jìn)行梯度洗脫(0.5 mL/min)，收集合并吸收峰，超濾濃縮后測定酶活力。

1.3.3.3 Sephadex G-100分子篩層析

Sephadex G-100裝柱后先用0.05 mol/L，pH值為6.8的磷酸鈉緩沖液平衡，取1 mL DEAE-纖維素離子交換柱收集的酶液上柱，用0.05 mol/L，pH值為6.8的磷酸鈉緩沖液洗脫(0.5 mL/min)，檢測波長280 nm，收集合并洗脫峰，超濾濃縮后測定酶活力。

1．3．4 SDS-PAGE 電泳

取30 μL樣品與10 μL上樣緩沖液混合，沸水浴5 min，5 000 r/ min 離心5 min，取20 μL上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳(分離膠濃度12%，濃縮膠為3%)。電泳結(jié)束后凝膠用考馬斯亮藍(lán)R-250染色，脫色液脫色。

1．3．5 蛋白含量測定

蛋白含量測定采用考馬斯亮藍(lán)法[16]。1 mL樣品加入5 mL蛋白試劑(100 mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50 mL 95%乙醇中，再加100 mL85%磷酸，用雙蒸水補(bǔ)至1 000 mL)，充分振蕩混勻，2 min后于595 nm處測定光吸收值。以1 mL重蒸水作為空白對(duì)照。

1．3．6 蛋白水解活力測定

蛋白水解活力測定采用Twinning法[17]，制作異硫氰酸熒光素標(biāo)記的蛋白樣品，20 μL標(biāo)記蛋白中加入20 μL pH 6.0的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液和10 μL酶液，37 ℃，180 r/min反應(yīng)1 h后加入120 μL預(yù)冷的5%TCA，室溫靜置1 h后離心取上清，利用熒光酶標(biāo)儀在激發(fā)波長490 nm、發(fā)射波長525 nm條件下測定熒光強(qiáng)度。把37 ℃，1 h水解1 μg熒光標(biāo)記蛋白所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位。

1．3．7 凝乳酶活力檢測

凝乳酶活性測定采用ARIMA[10]方法。具體如下：用0.01 mol/ L CaC12溶液配制10% 的脫脂乳液。該溶液配制后在室溫靜置40 min后使用。取5 mL 10%脫脂乳液于試管中，35 ℃保溫10 min，加入1 mL適當(dāng)稀釋的酶液(酶液35℃保溫10 min)，立刻搖勻，開始計(jì)時(shí)，傾斜試管并旋轉(zhuǎn)，記錄從開始到試管壁出現(xiàn)絮狀物的時(shí)間(s)，把40 min凝結(jié)1 mL 10%脫脂乳液的酶量定義為1個(gè)索氏單位(Soxhlet unit)。酶活力及酶活力回收率計(jì)算公式如下：

(1)

(2)

式中:t為凝乳時(shí)間，s；n為稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2．1 單因素試驗(yàn)

2．1．1 麩皮質(zhì)量濃度

如圖1所示，隨著麩皮質(zhì)量濃度的增加，凝乳酶活力增加，當(dāng)濃度達(dá)到40 g/L時(shí)，凝乳酶的活力達(dá)到最高值，之后隨著麩皮濃度的增加凝乳酶活力降低。麩皮含有15%左右的蛋白質(zhì)以及硫胺素、核黃素、尼克酸等微生物生長必須的生長素，本身的C/N比適宜，適于枯草芽孢桿菌發(fā)酵，而且價(jià)格低廉，所以選擇麩皮作為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基成分。

圖1 麩皮質(zhì)量濃度對(duì)凝乳酶活力的影響Fig.1 Effect of wheat bran concentration on MCE activity

2．1．2 復(fù)合碳源確定

如圖2所示，葡萄糖、蔗糖作為復(fù)合碳源時(shí)所得酶活力都比對(duì)照組高，且蔗糖作為復(fù)合碳源時(shí)，菌株產(chǎn)凝乳酶活力最高，說明其更易于被枯草芽孢桿菌PNG27利用，為其發(fā)酵過程提供能量，故選擇蔗糖作為培養(yǎng)基的復(fù)合碳源。隨后對(duì)蔗糖添加量進(jìn)行研究，將培養(yǎng)基中蔗糖添加量調(diào)整為10、20、30、40、50 g/L，如圖3所示，隨著蔗糖添加量的增加，凝乳酶活力也在增加，當(dāng)蔗糖濃度達(dá)到40 g/ L 時(shí)，凝乳酶活力達(dá)到最大值61.66 ± 1.5 U/ml，隨后隨著蔗糖添加量的增加凝乳酶活力降低，說明蔗糖添加量為40 g/L時(shí)更利于枯草芽孢桿菌PNG27產(chǎn)酶。

圖2 不同復(fù)合碳源對(duì)產(chǎn)凝乳酶活力的影響Fig.2 Effect of different carbon sources on MCE activity

圖3 蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)凝乳酶活力的影響Fig.3 Effect of sugar contents on MCE activity

2．1．3 金屬離子確定

如圖4所示，CaCl2、KCl和NaCl作為金屬離子添加時(shí)相對(duì)于對(duì)照組酶活力顯著提高，當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)酶活力達(dá)到100.73 ± 4.29 U/mL，高于CaCl2、KCl，所以選擇NaCl作為培養(yǎng)基的金屬離子。隨后對(duì)NaCl添加量進(jìn)行研究，將培養(yǎng)基中NaCl添加量調(diào)整為0、10、20、30、40 g/L，如圖5所示，當(dāng)NaCl 添加量為10 g/L時(shí)，凝乳酶活力達(dá)到最大值，隨著NaCl添加量的增加，凝乳酶活力逐漸降低。

圖4 不同金屬離子對(duì)凝乳酶活力的影響Fig.4 Effect of different metal ions on MCE activity

圖5 NaCl添加量對(duì)凝乳酶活力的影響Fig.5 Effect of NaCl content on MCE activity

2．1．4 發(fā)酵條件優(yōu)化

如圖6所示，酶活力隨著接種量、pH、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，酶活力分別在接種量4%、初始pH 7、發(fā)酵溫度33 ℃、發(fā)酵時(shí)間48 h時(shí)達(dá)到最大值，而裝液量為100 mL/L時(shí)，酶

活力最高?？莶菅挎邨U菌是好氧細(xì)菌，低的裝液量可以使得液體培養(yǎng)基中溶解更多氧，滿足菌體生長以及代謝的需要，使得凝乳酶的產(chǎn)量增加。

2．2 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用N=12的PB設(shè)計(jì)安排，對(duì)培養(yǎng)基組分：麩皮、蔗糖、NaCl添加量和發(fā)酵條件：接種量、發(fā)酵溫度、裝液量、pH和發(fā)酵時(shí)間共8個(gè)因素進(jìn)行研究，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)確定各因素的水平。各因素及其代碼、編碼水平如表1所示，響應(yīng)值為凝乳酶活力。PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果和顯著性檢驗(yàn)如表1和表2所示。

圖6 接種量(a)、裝液量(b)、初始pH(c)、溫度(d)、時(shí)間(e)對(duì)凝乳酶活力的影響Fig.6 Effect of inoculums size(a), liquid volume(b), initial pH(c), temperature(d), time(e) on MCE activity

試驗(yàn)號(hào)因素響應(yīng)值A(chǔ)(麩皮)/(g·L-1)B(蔗糖)/(g·L-1)C(NaCl)/(g·L-1)D(接種量)/%E(溫度)/℃F(裝液量)/(mL·L-1)G(pH)H(時(shí)間)/h酶活力/(U·mL-1)11(40)1(35)1(12)-1(3)-1(33)-1(100)1(8)-1(36)136.572-1(30)-1(45)-1(8)1(5)-11(200)1-152.223-1111-1-1-1(6)1(60)58.2441-1-1-11(37)-11181.385-11-111-11154.026-1-1-1-1-1-1-1-168.3171-111-111170.56811-1111-1-171.82911-1-1-11-1155.43101-1111-1-1-1108.8811-111-1111-153.5512-1-11-111-1113.29

利用Design-Expert對(duì)其結(jié)果進(jìn)行方差分析(如表2所示)，對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵液凝乳酶活力測定結(jié)果顯示麩皮(P=0.000 2)、蔗糖(P=0.0403)、NaCl(P=0.0105)、發(fā)酵溫度(P=0.010 2)、裝液量(P=0.003)、pH(P=0.005 6)、發(fā)酵時(shí)間(P=0.000 6)，它們在α=0.05的概率水平上差異顯著，其他因子在此水平上不顯著。其中麩皮、裝液量、發(fā)酵時(shí)間、pH對(duì)其凝乳活力的影響都是極顯著的，考慮到枯草芽孢桿菌是好氧菌，后期用發(fā)酵罐可以忽略裝液量這一影響因素，pH的可變動(dòng)性小，且發(fā)酵過程中會(huì)不斷變化，最終選擇麩皮濃度、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

表2 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)回歸模型及其顯著性檢驗(yàn)

注： *該因子效應(yīng)顯著(P<0.05)； **該因子效應(yīng)極顯著(P<0.01)。

2．3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果和Box-Behnken的試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，做3因素3水平的響應(yīng)面分析，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3所示。利用Design-Expert軟件對(duì)表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得二次多項(xiàng)式方程：Y=211.60+34.98A+12.22B-11.47C-26.61BC-41.03A2-43.22B2-35.90C2。從上述結(jié)果來看，本試驗(yàn)所選用的模型對(duì)凝乳酶活力具有高度的顯著性(P<0.000 1)，失擬項(xiàng)反映的是實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型不相符的情況,P=0.769 8>0.1，失擬不顯著，因此模型選擇正確。其預(yù)測值(R2=0.956 4)和試驗(yàn)值(R2=0.976 9)之間有高度的相關(guān)性。麩皮與時(shí)間和溫度之間的交互作用不顯著，時(shí)間與溫度的交互作用顯著(P<0.000 1)。

對(duì)于模型方程，采用Design-Expert軟件進(jìn)行分析，得出曲面的極值點(diǎn)，對(duì)應(yīng)的發(fā)酵條件為麩皮42.22 g/ L、發(fā)酵時(shí)間41.0 h、發(fā)酵溫度33.12 ℃，此時(shí)發(fā)酵液酶活力達(dá)到222.30 U/mL，為了檢測響應(yīng)面的可靠，采用上述的條件進(jìn)行了3次重復(fù)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得出酶活力為222.34 ± 4.99 U/mL，與預(yù)測值都十分相近，說明模型方程與實(shí)際情況擬合較好。

表3 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及凝乳酶活力值

表4 Box-Behnken顯著性檢驗(yàn)

注： *該因子效應(yīng)顯著(P<0.05)； **該因子效應(yīng)極顯著(P<0.01)。

2．4 乙醇分級(jí)沉淀

采用乙醇分級(jí)沉淀對(duì)酶蛋白進(jìn)行初步純化，發(fā)酵液離心后取上清液，分為7組，每組進(jìn)行平行試驗(yàn)，在冰浴條件下緩慢加入預(yù)先冷卻的乙醇，使其體積分?jǐn)?shù)分別達(dá)到20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%，靜置一段時(shí)間，離心棄上清，沉淀溶于磷酸鈉緩沖液中，分別測酶活，計(jì)算凝乳酶活力，取平均值。

由圖7可知，凝乳酶的回收率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加呈現(xiàn)先增加后平穩(wěn)的趨勢，乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時(shí)，凝乳酶活力達(dá)到最大值，為134.82 U/mL。體積分?jǐn)?shù)50%之前沉淀中基本無凝乳酶活力。因此，采用乙醇分級(jí)沉淀對(duì)酶蛋白進(jìn)行初步純化。先用50%體積分?jǐn)?shù)的乙醇沉淀除去雜蛋白，再加預(yù)冷的乙醇使其體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%，離心收集沉淀，溶于磷酸鈉緩沖液中，即得到粗酶液。

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)凝乳酶活力的影響Fig.7 Effect of ethanol content on MCE activity

2．5 DEAE-纖維素離子交換柱層析

乙醇分級(jí)沉淀后得到的粗酶液經(jīng)DEAE-纖維素離子交換柱層析后共出現(xiàn)4個(gè)洗脫峰，如圖8所示，分別收集合并洗脫峰，測酶活，可知峰2為酶活力峰(即用含有0.1 mol/L NaCl的磷酸鈉緩沖液洗脫的峰)。

圖8 DEAE-纖維素分離凝乳酶Fig.8 Purification of MCE by DEAE-celluose column

2．6 Sephadex G-100分子篩層析

收集DEAE-纖維素離子交換柱的活力峰，超濾濃縮后經(jīng)Sephadex G-100分子篩層析柱后，洗脫液呈現(xiàn)出2個(gè)洗脫峰，如圖9所示。其中35～45管表現(xiàn)出凝乳酶活力，收集后超濾濃縮，即得到純酶。

圖9 Sephadex G-100分離凝乳酶Fig.9 Purification of MCE by Sephadex G-100 column

2．7 SDS-PAGE 電泳分析

粗酶液經(jīng)過2次柱層析純化，得到較純的枯草芽孢桿菌凝乳酶，對(duì)分離過程中的不同產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAFE電泳分析，結(jié)果見圖10。最后一步得到清晰條帶，根據(jù)電泳的分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，該酶樣品的分子質(zhì)量約42 kDa。與小牛凝乳酶和牛的胃蛋白酶的分子質(zhì)量(分別是35.65 kDa 和34.00 kDa)不同。

M-蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-發(fā)酵液；2-乙醇分級(jí)沉淀后的粗酶液； 3-經(jīng)DEAE-纖維素層析后的活力峰樣品；4-經(jīng)SephadexG-100層析后的純酶圖10 SDS-PAGE電泳圖Fig.10 SDS-PAGE

2．8 凝乳酶純化結(jié)果

分別測定分離過程不同產(chǎn)物的凝乳酶活力、蛋白水解活力與蛋白濃度，計(jì)算出總活力、比活力、C/P、回收率、純化倍數(shù)，結(jié)果如表5所示。粗酶液經(jīng)過2次層析后，酶的比活力明顯提高。由最初的95.76 U/mg到純化后的794.30 U/mg，提高了8倍，C/P基本不變，較高于小牛凝乳酶C/P，純化倍數(shù)為8.29。分子篩層析的收回率較低，僅為4.25%。

3 討論

本試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基的成分及發(fā)酵的條件進(jìn)行了優(yōu)化，應(yīng)用PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)諸多影響凝乳酶活力的因素進(jìn)行評(píng)價(jià)，篩選出重要的影響因子，快速有效。在PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)對(duì)主要影響因子進(jìn)行優(yōu)化與評(píng)價(jià)，獲得影響枯草芽孢桿菌PNG27產(chǎn)凝乳酶的擬合數(shù)學(xué)模型，其最優(yōu)的培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件為：麩皮42.22 g/L、蔗糖40 g/L、NaCl 10 g/L、初始pH7、接種量4 %、發(fā)酵時(shí)間41.0 h、發(fā)酵溫度33.12 ℃、裝液量100 mL，在此培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上，發(fā)酵液的酶活力與基礎(chǔ)麩皮培養(yǎng)基相比提高了5倍，最終酶活力為222.34±4.99 U/mL。不同菌株對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的利用情況不同，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)產(chǎn)凝乳酶菌株的培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化的研究中，利用葡萄糖、酪蛋白等簡單底物和麩皮、燕麥粉、大豆粉等復(fù)雜底物時(shí)，產(chǎn)酶量有所不同，復(fù)合底物常可誘導(dǎo)酶的大量分泌[18]，最適的培養(yǎng)基配方以及發(fā)酵條件因菌種不同而異。近幾年，芽孢桿菌產(chǎn)凝乳酶的相關(guān)研究較多，張衛(wèi)兵[19]等人以麩皮汁濃度16%，葡糖糖濃度7%等的最優(yōu)組合獲得134.72 U/mL的最高酶活，騰軍偉[9]利用麥芽糖即得到較高的酶活力。

表5 凝乳酶純化結(jié)果

通過乙醇分級(jí)沉淀、DEAE-纖維素離子交換層析、Sephadex G-100分子篩層析3步分離得到了電泳純的凝乳酶，比活力由95.76 U/mg提高到794.30 U/mg，提高了8倍，酶的純化倍數(shù)為8.29倍，最終回收率為4.25%。目前，國內(nèi)外研究中粗分蛋白最常用的是硫酸銨鹽析，但由于硫酸銨沉淀需要脫鹽，酶液被稀釋，增加了后序的濃縮過程的工作量，易造成酶的損失，故選用無水乙醇進(jìn)行粗分。最終得到分子質(zhì)量為42 kDa的純酶，與李洋[12]等人純化的枯草芽胞桿菌凝乳酶分子量接近，由于降解程度、修飾水平和肽鏈大小不同，不同微生物來源的凝乳酶分子質(zhì)量不盡相同。根霉凝乳酶[20]的分子質(zhì)量為35 kDa，微小毛霉[21]凝乳酶46 kDa。

本試驗(yàn)通過對(duì)培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件的優(yōu)化，將酶活力提高了8倍，并通過3步分離得到電泳純的凝乳酶，為后續(xù)研究其酶學(xué)性質(zhì)及在牦牛乳工業(yè)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

[1] 楊貞耐,張健.干酪質(zhì)量安全問題與控制技術(shù)[J]. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào), 2015, 33(6): 11-17.

[2] 高巖,王景會(huì),李玉秋,等.枯草芽孢桿菌凝乳酶的酶學(xué)性質(zhì)[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 34(4): 385-390.

[3] 普燕,張富春.干酪用牛凝乳酶替代品的研究進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵工業(yè), 2015, 41(5): 227-234.

[4] 孫寶國,曹雁平,李健,等.食品科學(xué)研究前沿動(dòng)態(tài)[J].食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào), 2014, 32(2): 1-11.

[5] DING Z Y, WANG W F, WANG B D, et al. Production and characterization of milk-clotting enzyme fromBacillusamyloliquefaciensJNU002 by submerged fermentation[J]. Eur Food Res Technol , 2012, 234: 415-421.

[6] 李學(xué)朋,梁琪,師希雄,等.產(chǎn)凝乳酶微生物的研究概況[J]. 中國釀造, 2014, 33(4): 13-18.

[7] WANG Y, CHENG Q, AHMED Z, et al. PuriWcation and partial characterization of milk-clotting enzyme extracted from glutinous rice wine mash liquor[J]. Korean J Chem Eng，2009, 26: 1 313-1 318.

[8] PIERO ARL, PUGLISI I, PETRONR G. Characterization of the puri Wed actinidin as a plant coagulant of bovine milk[J]. Eur Food Res Technol, 2011, 233: 517-524.

[9] 騰軍偉, 楊貞耐. 解淀粉芽孢桿菌GSBa-1 產(chǎn)凝乳酶培養(yǎng)基組成的優(yōu)化[J]. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào), 2016, 34(4): 13-20.

[10] ARIMA K, SHINITER I, GAKUZO T. Milk-clotting enzymes from microorganism. part I: Screening test and identification of potent fungus [J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1967, 31(5): 540-545.

[11] DUTT K, MEGHWANSHI GK, GUPTA P, et al. Role of casein on induction and enhancement of production of a bacterial milk clotting protease from an indigenously isolated Bacillus subtilis[J]. Lett Appl Microbiol, 2008, 46: 513-518.

[12] YANG L, SHU L, DEJUAN Z, et al. Purification and characterization ofBacillussubtilismilk-clotting enzyme from Tibet Plateau and its potential use in yak dairy industry[J]. Eur Food Res Technol , 2012, 234: 733-741.

[13] 周俊清. 凝乳酶優(yōu)良菌株的選誘及酶活特性的研究[D]. 長沙:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2005.

[14] HE X L, REN F Z, GUO H Y, et al. Purification and properties of a milk-clotting enzyme produced byBacillusamyloliquefaciensD4[J]. Korean J Chem Eng, 2011, 28(1): 203-208.

[15] 宋曦,甘伯中,賀曉玲,等.天祝放牧牦牛生活環(huán)境土壤中一株產(chǎn)凝乳酶細(xì)菌的分離與鑒定[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(11): 158-162.

[16] BRADFORD M. A rapid and sensitive method for the quantitation of protein using the principle of ptotein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry, 1976, 72: 248-254.

[17] ELBENDARY M A,MOHARAM M E, ALI T H. Purification and characterization of milk clotting enzyme produced byBacillussphaericus[J]. Appl Sci Res, 2007, 3(8): 695-699.

[18] 孫倩,王喜平, 閆巧娟.微孢根霉產(chǎn)凝乳酶的發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 19(4): 137-143.

[19] 張衛(wèi)兵,宋曦, 賀曉玲.Bacilluslicheniformis產(chǎn)凝乳酶培養(yǎng)基的優(yōu)化[J]. 中國釀造, 2011, 2: 70-73.

[20] 潘道東,韓玲玲. 根霉凝乳酶的分離純化及其酶學(xué)特性研究[J]. 中國食品學(xué)報(bào), 2011, 11(2): 53-59.

[21] 李玉秋,王景會(huì),李鐵柱,等.重組微小毛霉凝乳酶的分離與純化[J]. 中國釀造, 2010(10): 19-22.

Fermentation optimization and purification of a milk-clotting enzyme produced byBacillussubtilisPNG27

CHEN Rui, BIE Xiao-mei, LYU Feng-xia, ZHAO Hai-zhen,ZHANG Chong, LU Zhao-xin*

(Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)

The medium components and fermentation condition were optimized with single factor test, Plackett-Burman experimental designs and Box-Behnken response surface methodology. Under optimized conditions, the highest enzyme activity reached (222.34 ± 4.99) U/mL．The purified milk-clotting enzyme (MCE) produced byBacillussubtilisPNG27 was obtained by fractional precipitation with ethanol, followed by the chromatography of the most active fraction on DEAE-celluose column and finally on Sephadex G-100. The results showed that the specific activity of the enzyme was 794.30 U/mg, purification fold was 8.29 times, and the final recovery rate was 4.25%. SDS-PAGE of the purified MCE gave a molecular weight of 42 kDa.

Bacillussubtilis; milk-clotting enzyme; fermentation optimization; purification

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201701019

碩士研究生(陸兆新教授為通訊作者,E-mail：fmb@njau.edu.cn)。

2016-07-18，改回日期：2016-08-29