雷帕霉素對高糖誘導的大鼠腎系膜細胞增殖、凋亡和細胞周期的影響

陳 潔 陳興強 符薇薇

(三亞市人民醫(yī)院腎內(nèi)科，三亞572000)

雷帕霉素對高糖誘導的大鼠腎系膜細胞增殖、凋亡和細胞周期的影響

陳 潔 陳興強 符薇薇

(三亞市人民醫(yī)院腎內(nèi)科，三亞572000)

目的：評價雷帕霉素對高糖誘導的腎系膜細胞增殖、凋亡和細胞周期的影響，探討其在糖尿病腎病防治中的意義。方法：體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細胞株HBZY-1分為：正常對照組、高糖組、高糖加不同濃度的雷帕霉素組，應(yīng)用CCK-8法觀察細胞增殖的變化；流式細胞術(shù)檢測各組細胞的細胞周期和凋亡情況；Real-time PCR法檢測各組細胞中血管緊張素Ⅱ(ANGⅡ)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達水平。結(jié)果：高糖誘導下HBZY-1的增殖水平明顯上升，凋亡水平下降，ANGⅡ，TGF-β1和VEGF的表達水平上升，而雷帕霉素具有明顯抑制作用，且有劑量依賴性，并下調(diào)ANGⅡ，TGF-β1和VEGF的表達；對于細胞周期，高糖組的S期細胞明顯高于正常組(P<0.05)；雷帕霉素干預后，S期細胞比例減少(P<0.05)。結(jié)論：雷帕霉素能夠抑制高糖狀態(tài)下HBZY-1的增殖，促進其凋亡及導致G1/S期阻滯，同時下調(diào)ANGⅡ，TGF-β1和VEGF的表達。

雷帕霉素；高糖；腎系膜細胞；增殖；凋亡；細胞周期

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是1型糖尿病和2型糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，是導致終末期腎病的主要的病因之一[1]。DN的臨床表現(xiàn)為蛋白尿增多和腎臟功能的逐漸下降，直至發(fā)展成為腎衰竭。關(guān)于DN的病因尚未完全明確，目前認為是在遺傳背景下多因素共同參與的，如高血糖、高血壓和腎臟的血流動力學異常等因素。長期的高糖環(huán)境可導致糖化末端產(chǎn)物的聚積、慢性炎癥反應(yīng)和促纖維化細胞因子如血管緊張素II(AngiotensinⅡ，ANGⅡ)，轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transfor ming growth factor beta1，TGF-β1)和血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)的分泌增多[2]。DN的病理學表現(xiàn)為腎小球系膜細胞增殖、細胞因子大量分泌、細胞外的基質(zhì)堆積和腎小球的硬化[3]。但是現(xiàn)階段對DN仍缺乏有效的治療方法，主要從控制發(fā)病因素如控制血糖、控制血壓，對于發(fā)展到終末期的DN甚至需要腎臟移植。因此針對DN的發(fā)病機制，尋求新的積極有效的治療措施迫在眉睫。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是PI3K/Akt通路下游的重要效應(yīng)靶蛋白，對細胞生長、增殖和分化具有關(guān)鍵的調(diào)控作用[4]。雷帕霉素(Rapamycin)為mTOR的抑制劑，是吸水性鏈霉菌的代謝產(chǎn)物，在1975年首次被發(fā)現(xiàn)。后來被廣泛用于抑制器官移植的排異反應(yīng)和抗腫瘤治療[5,6]。本文通過觀察雷帕霉素對高糖誘導的腎系膜細胞的增殖、凋亡、細胞周期及腎系膜細胞分泌的細胞因子的影響，探討雷帕霉素對治療糖尿病腎病的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠系膜細胞HBZY-1購自酶聯(lián)(上海)生物試劑科技有限公司；不完全Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium(DMEM)和胎牛血清購自美國Gibco公司；Trizol試劑購自美國Invitrogene公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國Promega公司；實驗用藥物mTOR抑制劑雷帕霉素為美國Sigma公司產(chǎn)品；Real-time PCR試劑(SYBR Green Master Mix)、CCK-8 Cell Counting Kit均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；細胞凋亡檢測試劑盒Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit購自美國BD Biosciences 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細胞株HBZY-1培養(yǎng) HBZY-1常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM中，呈貼壁生長，培養(yǎng)條件 37℃，5%CO2。在培養(yǎng)液中加入以下不同的處理因素將細胞分為4組：正常對照組(NG)：5.6 mmol/L的葡萄糖；高糖組(HG)：20 mmol/L的葡萄糖；高糖+雷帕霉素組1(HG+R1)：20 mmol/L的葡萄糖和50 nmol/L的雷帕霉素；和高糖+雷帕霉素組2(HG+R2)：20 mmol/L的葡萄糖和100 nmol/L的雷帕霉素。

1.2.2 CCK-8細胞增殖實驗 將4組不同處理的HBZY-1細胞以1 000個/孔細胞數(shù)接種于96孔板中，每組設(shè)5個復孔。分別在培養(yǎng)1、2、3、4和5 d后，按照CCK-8試劑盒說明書推薦的步驟檢測細胞增殖情況，用全自動酶標讀數(shù)儀檢測OD值，波長為450 nm。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 將四組不同處理的HBZY-1細胞以1×106個/孔細胞數(shù)接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后用PBS洗滌兩次，1×Binding Buffer 重懸細胞。分別加入50 μl 以異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標記的膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)和50 μl碘化丙啶(PI)，輕柔混勻，室溫避光染色15 min后用流式細胞儀進行細胞凋亡的檢測。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞生長周期 將HBZY-1饑餓24 h后，分別以3×105個/孔細胞數(shù)接種于6孔板中，用上述4種處理方式培養(yǎng)72 h后再用胰酶消化細胞，PBS洗滌2次，75%乙醇固定，PBS再次洗滌，加入1% Triton X-100 1 ml作用10 min，0.01% RNA酶1 ml處理10 min，最后以0.25%碘化丙啶(PI)染色20 min后用流式細胞儀進行細胞周期的分析。

1.2.5 Real-time PCR法檢測mRNA水平 用Trizol收取上述4組不同處理的HBZY-1細胞，用氯仿抽提法得細胞RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，應(yīng)用羅氏熒光定量PCR儀Lightcycler 480采用兩步法進行定量檢測實驗，使用2-ΔΔCt法對結(jié)果進行相對定量分析。所用引物見表1。

2 結(jié)果

2.1 雷帕霉素對高糖誘導的腎系膜細胞增殖的影響 各組5個時間點所測OD450數(shù)據(jù)列于表2。整體地看，4個組間，5個時點間，以及分組與時間的交互作用，均有顯著性意義(P<0.05)，兩因素重復測量方差分析，提示均存在組間時點間差異，且各組OD450隨時間的變化趨勢不同。進行兩兩組間及兩兩時點間的比較，并結(jié)合主要數(shù)據(jù)來看：與正常組比較，高糖組在3 d后細胞的增殖水平明顯上升(P<0.05)；而當在高糖培養(yǎng)的細胞中同時應(yīng)用雷帕霉素后，相對于高糖組細胞的增殖能力受到抑制，且為劑量依賴性(P<0.05)，說明了雷帕霉素可顯著抑制高糖刺激的細胞的增殖。詳見表2。

表1 引物序列

Tab.1 Primer sequence

2.2 雷帕霉素對高糖誘導的腎系膜細胞凋亡水平的影響 各組早期凋亡率及總凋亡率檢測資料列于表3中。經(jīng)整體比較(單因素方差分析)：早期凋亡率及總凋亡率，4個組間整體差異均顯著(P<0.05)。再進行兩兩組間比較，并結(jié)合主要結(jié)果來看：高糖處理組細胞的凋亡水平明顯低于正常組(P<0.05)；而當用雷帕霉素處理后高糖組細胞的凋亡水平相對于高糖培養(yǎng)的細胞顯著升高，且為劑量依賴性(P<0.05)，提示了雷帕霉素能夠促進高糖誘導的腎系膜細胞的凋亡作用。詳見表3。

2.3 雷帕霉素對高糖誘導的腎系膜細胞細胞周期的影響 經(jīng)流式細胞術(shù)檢測的細胞生長周期資料列于表3中。4個組整體比較，S-phase(%)數(shù)據(jù)差異有顯著性意義(P<0.05)。再進行兩兩組間比較，并結(jié)合主要數(shù)據(jù)來看：高糖組細胞的S期比例明顯高于正常組(P<0.001)，當用雷帕霉素干預后，與單純高糖培養(yǎng)的細胞比較，干預組的S期細胞比例減少，并呈現(xiàn)劑量依賴的關(guān)系(P<0.001)，表明雷帕霉素能夠一定程度促進細胞G1/S期的阻滯。詳見表4。

2.4 雷帕霉素對高糖誘導的細胞因子影響 已知ANGⅡ、TGF-β1和VEGF在DM中是高表達的，因此我們通過Real-time PCR檢測雷帕霉素對于細胞因子的表達水平的影響。結(jié)果列于表4中。整體比較發(fā)現(xiàn)：3個細胞因子，在4個組間的差異均具有顯著性意義(P<0.05，單因素方差分析)。兩兩比較并結(jié)合主要數(shù)據(jù)來看：與正常組比較，高糖組能夠明顯促進ANGⅡ(P<0.001)、TGF-β1(P<0.01)和VEGF mRNA(P<0.001)的表達水平。而當用雷帕霉素處理后，ANGⅡ、TGF-β1和VEGF mRNA的表達水平明顯下降(P<0.001)。該結(jié)果提示了雷帕霉素可以抑制高糖誘導的腎系膜細胞分泌ANGⅡ、TGF-β1和VEGF。詳見表5。

表2 各組OD450數(shù)據(jù)的比較

Tab.2 Comparison of OD450 data in each group

表3 各組凋亡率數(shù)據(jù)的比較

Tab.3 Comparison of apoptosis rate data in each group

表4 各組S-phase數(shù)據(jù)的比較

Tab.4 Comparison of S-phase data in each group

GroupS?phase(%)NG6189±27HG6348±60HG+R16192±24HG+R26175±27HolisticanalysisF，P28547，0000HGvsNGLSD?t，P7344，0000HG+R1vsNGLSD?t，P0134，0894HG+R2vsNGLSD?t，P0671，0510HG+R1vsHGLSD?t，P7210，0000HG+R2vsHGLSD?t，P8015，0000HG+R2vsHG+R1LSD?t，P0805，0430

表5 3種細胞因子表達資料及組間比較

Tab.5 Expression data of three cytokines and comparison between groups

GroupANGⅡTGF?β1VEGFNG6100±019100±025100±022HG6222±045196±039216±030HG+R16082±036082±037091±030HG+R26065±011071±010067±019HolisticanalysisF，P32377，000021298，000040471，0000HGvsNGLSD?t，P6887，00005489，00007879，0000HG+R1vsNGLSD?t，P1017，03211027，03170572，0574HG+R2vsNGLSD?t，P7903，00006515，00008451，0000HG+R1vsHGLSD?t，P1974，00621655，01142197，0040HG+R2vsHGLSD?t，P8861，00007143，000010076，0000HG+R2vsHC+R1LSD?t，P0958，03500628，05371625，0120

3 討論

近三分之一的糖尿病病人患有糖尿病腎病，流行病學調(diào)查顯示全球約有3.5億人患有糖尿病，而其中約1億患者患有糖尿病腎病，而30%的患者將會進展為腎衰竭[9]。糖尿病腎病主要特征為細胞外基質(zhì)蛋白在腎小球細胞間隙累積，腎小球擴張，基底膜增厚，腎小管間質(zhì)纖維化，是終末期腎衰竭的主要原因[10,11]。關(guān)于糖尿病腎病具體的發(fā)病機制尚不清楚，但是高血糖被認為是促進腎臟病變的動力因素。持續(xù)的高血糖能夠促進很多與糖尿病腎病發(fā)病相關(guān)的細胞因子的表達如ANGⅡ，TGF-β1和VEGF等[12-14]，其中ANGⅡ能夠誘導氧化應(yīng)激反應(yīng)，腎小球的高過濾，內(nèi)皮細胞的損傷，血栓形成和炎癥等過程；而高表達的TGF-β1可以促進細胞外基質(zhì)成分的累積，凋亡和近端小管的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，并且研究發(fā)現(xiàn)低表達的TGF-β1可以改善糖尿病腎病，減少腎小球濾過率。細胞因子VEGF多次被報道參與內(nèi)皮細胞的血管生成、遷移和增殖等過程，在糖尿病腎病的發(fā)病過程中，VEGF可以增加血管的滲透性[12,15]。此外，高表達的VEGF可以改變胞外的傳導信號，促進細胞外基質(zhì)的合成，刺激腎臟發(fā)生肥大。因此，目前迫切需要針對高糖因素在糖尿病腎病發(fā)生過程中的作用，尋找有效的治療糖尿病腎病的方法。

雷帕霉素為mTOR的抑制劑，研究顯示，PI3K/Akt可磷酸化mTOR具有負性調(diào)控作用的結(jié)節(jié)性硬化復合物1/2(Tuberous sclerosis complex 1/2，TSC1/2)，TSC1/2的磷酸化失活促使mTOR激活?；罨膍TOR又可磷酸化激活核糖體蛋白激酶p70S6K，從而促進細胞的生長增殖。與此同時，p70S6K又可以促使HIF1-α與HIF1-β形成異源二聚體，進入細胞核，招募p300/CBP，啟動VEGF的合成，促進VEGF生成增多[4,16]。因此雷帕霉素可抑制上述過程，抑制細胞的生長和細胞增殖，抑制VEGF的合成。

本研究中發(fā)現(xiàn)高糖培養(yǎng)條件能夠明顯促進大鼠腎系膜細胞的增殖和細胞周期的進展，抑制細胞的凋亡過程，與先前的文獻報道一致，驗證了高糖環(huán)境在糖尿病腎病發(fā)病過程中的作用。而雷帕霉素能明顯抑制高糖對腎系膜細胞的增殖、凋亡和細胞周期的影響，說明雷帕霉素能夠有效的抑制高糖刺激的腎小球系膜細胞的增生，甚至肥大的發(fā)生，該過程有助于預防或改善糖尿病腎病的進展[17]。此外，雷帕霉素還能夠明顯下調(diào)高糖刺激的ANGⅡ，TGF-β1和VEGF細胞因子的表達，如上文所述，這三個細胞因子在糖尿病腎病的發(fā)生與發(fā)展過程中的炎癥反應(yīng)、細胞的增殖和凋亡過程中發(fā)揮了極其重要的作用。而雷帕霉素很明顯的下調(diào)了ANGⅡ，TGF-β1和VEGF的表達，這提示了雷帕霉素有可能是通過下調(diào)了高糖刺激的各種細胞因子的表達抑制腎系膜細胞的增殖，促進腎系膜細胞的凋亡過程，從而阻止高糖環(huán)境對腎小球系膜細胞的持續(xù)刺激。

本文總結(jié)，雷帕霉素可以明顯逆轉(zhuǎn)高糖對腎系膜細胞的影響，減緩高糖在糖尿病腎病發(fā)病過程中的作用，因此可以作為糖尿病腎病的一種治療方法。

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[收稿2016-06-20 修回2016-07-15]

(編輯 許四平)

Effect of rapamycin on proliferation，apoptosis and cell cycles of high glucose-cultured rat glomerular mesangial cell

CHENJie,CHENXing-Qiang,FUWei-Wei.

DepartmentofNephrology,SanyaPeople′sHospital,Sanya572000，China

Objective:To evaluate the effects of rapamycin on the proliferation,apoptosis and cell cycle of glomerular mesangial cells induced by high glucose,and to explore its significance in the prevention and treatment of diabetic nephropathy.Methods: The rat GMC HBZY-1 was divided into four groups:control group,high glucose group,the first group of high glucose plus rapamycin,the second group of high glucose plus rapamycin.CCK-8 assay was used to detect the proliferation of cells,flow cytometry was introduced to evaluate the apoptosis and cell cycle of HBZY-1,Real-time PCR was used to detect the mRNA of AngiotensinⅡ(ANGⅡ),transfor ming growth factor beta1(TGF-β1) and vascular endothelial growth factor (VEGF).Results: The proliferation level of HBZY-1 induced by high glucose was significantly increased,and the level of apoptosis decreased,and the expression level of ANGⅡ,TGF-β1 and VEGF was increased.Rapamycin significantly inhibited,and there was a dose dependent,and down regulated the expression of ANGⅡ,TGF-β1,and VEGF.For the cell cycle,the S phase cells in the high glucose group were significantly higher than those in the normal group (P<0.05),and the S phase cell proportion was decreased after rapamycin intervention (P<0.05).Conclusion: Rapamycin can inhibit the proliferation of HBZY-1 in high glucose,promote its apoptosis and lead to G1/S arrest,and down regulate the expression of ANGⅡ,TGF-β1 and VEGF.

Rapamycin;High glucose;Glomerular mesangial cell;Proliferation;Apoptosis;Cell cycle

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.009

陳 潔(1984年-)，男，主治醫(yī)師，主要從事腎內(nèi)科方面的研究，E-mail：ujmesz389@sina.com。

R587.2

A

1000-484X(2017)01-0047-05