脂肪組織切片制備方法的改進

徐玉環(huán)，徐艷峰，劉 穎，黃 瀾，于 品，韓云林，李彥紅，趙文杰，鄧 巍，秦 川，朱 華

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，新發(fā)再發(fā)傳染病動物模型研究北京市重點實驗室，北京 100021)

脂肪組織切片制備方法的改進

徐玉環(huán)，徐艷峰，劉 穎，黃 瀾，于 品，韓云林，李彥紅，趙文杰，鄧 巍，秦 川，朱 華*

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，新發(fā)再發(fā)傳染病動物模型研究北京市重點實驗室，北京 100021)

目的 探討脂肪組織石蠟切片及冰凍切片方法的改進。方法 取脂肪組織迅速固定于10%中性福爾馬林中，設(shè)置不同的脫水程序制備石蠟切片，HE染色。免疫組化法觀察PPARγ和ITLN1的表達。取脂肪組織迅速固定于甲醛鈣或10%中性福爾馬林固定液中24 h以上，OCT包埋，置于-80℃冰箱至少30 min，設(shè)置冰凍切片機箱體溫度-20℃，樣品頭溫度-30℃，切片后HE染色。結(jié)果 用改進方法制備的脂肪組織石蠟切片，切面平整，無皺褶，無裂隙，脂肪細胞結(jié)構(gòu)完整，染色清晰，且對免疫組化結(jié)果無影響；冰凍切片的改進提高了切片質(zhì)量，結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)好，染色清晰。結(jié)論 改進的脂肪組織石蠟切片和冰凍切片均可成功應(yīng)用于不同實驗動物，為脂肪組織的研究提供了有力的支撐條件。

脂肪組織；石蠟切片；冰凍切片

脂肪組織包括白色脂肪組織(white adipose tissue，WAT)和棕色脂肪組織(brown adipose tissue, BAT)。白色脂肪組織和棕色脂肪組織在能量代謝中發(fā)揮著截然相反的作用。白色脂肪組織主要通過甘油三酯儲存能量，而棕色脂肪組織則通過產(chǎn)熱消耗能量。近年來科學(xué)家們越來越重視對脂肪組織的研究。脂肪組織結(jié)構(gòu)特殊，含有較多的油脂成分，無論是冰凍切片還是石蠟包埋制片都較其它組織困難。傳統(tǒng)的處理方法往往不能制備出完整的切片，影響對其組織結(jié)構(gòu)的觀察，對后續(xù)研究造成困難。為了解決這一問題，我們不斷摸索，對脂肪組織石蠟切片和冰凍切片進行了改進，提高了脂肪組織的制片質(zhì)量。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性金黃地鼠，4只，4月齡，體重85 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2012-0001]。SPF級雄性BALB/c小鼠，8周齡，4只，體重20～25 g，來源于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心[SCXK (軍) 2012-0004]。SPF級雄性SD大鼠，8周齡，4只，體重220～250 g，購自中國食品藥品檢定研究院[SCXK(京)2014-0013]。普通級雄性日本大耳白家兔，4月齡，2只，體重2.5～3.0 kg，購自北京富龍騰飛養(yǎng)殖中心[SCXK (京) 2013-0004]。普通級雄性Beagle犬，6月齡，1只，體重6.0 kg，購自北京日新科技有限公司[SCXK(京)2011-0007]。普通級雄性恒河猴，2歲齡，1只，體重3.0 kg，購自北京協(xié)爾鑫生物資源研究所有限責任公司[SCXK (京) 2015-0011]。動物在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所[SYXK(京)2010-0030]飼養(yǎng)及管理。金黃地鼠、BALB/c小鼠脫頸椎安樂死，其余動物戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后股動脈放血安樂死。按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 儀器及試劑

Leica ASP300S型真空組織脫水機；Leica EG1150H+C型智能石蠟包埋機，櫻花IVS-410型推拉式切片機；Leica Stainer XL型全自動染色機；Leica CV5030型全自動封片機；10%中性福爾馬林固定液、無水乙醇、二甲苯、蘇木素及伊紅Y染色液購自北京益利精細化學(xué)品有限公司；Anti-PPARγ antibody，SIGMA-ALDRICH, 貨號SAB4502262；Anti-ITLN1 antibody，ABCAM，貨號ab118232；兔超敏二步法免疫組化檢測試劑，中杉金橋，貨號PV-9001；正常羊血清工作液，中杉金橋，貨號ZLI-9056。

1.3 實驗方法

1.3.1 金黃地鼠脂肪組織石蠟標本的制備

脫頸椎法處死金黃地鼠，取附睪脂肪，迅速固定于10%中性福爾馬林固定液中，固定液體積約為脂肪組織體積的50倍，并用紗布蓋住以防止脂肪組織漂浮。經(jīng)徹底固定后，常規(guī)取材(取材厚度為2～3 mm)，10%中性福爾馬林固定液再固定12 h以上。入真空組織脫水機進行脫水、透明、浸蠟。一般而言，不同種屬的實驗動物有其不同的脫水條件，同一種屬的實驗動物因個別臟器的不同性質(zhì)，其脫水條件也要改變。脂肪組織結(jié)構(gòu)特殊，脂肪細胞內(nèi)含有較多的脂肪滴，若按常規(guī)程序脫水，則脫水不完全，影響后續(xù)的制片。因此，本實驗中，我們將金黃地鼠脂肪組織進行單獨處理，對其脫水條件也進行了改進，改進前后的脫水條件如表1所示。

1.3.2 脂肪組織石蠟切片及HE染色

脫水后的脂肪組織，經(jīng)智能石蠟包埋機包埋制成蠟塊，推拉式切片機常規(guī)切片(切片厚度4 μm)，恒溫石蠟烤箱烤干后入全自動染色機染色，全自動封片機封片。

1.3.3 脂肪組織石蠟切片免疫組化染色

脂肪組織免疫組化染色方法參照文獻[1]，略有改變：(1)石蠟切片脫蠟至水；(2)微波修復(fù)；(3)3%雙氧水封閉15 min；(4)正常羊血清工作液封閉20 min；(5)滴加用抗體稀釋液稀釋的一抗(PPAR-γ稀釋度為1∶50；ITLN1稀釋度為1∶200)，冰箱4℃孵育過夜；(6)滴加二抗試劑1，室溫孵育10 min；(7)滴加二抗試劑2，室溫孵育10 min；(8)DAB顯色，鏡下觀察顯色程度；(9)蘇木素復(fù)染，鏡下觀察細胞核染色;(10)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

表1 改進前后脫水程序設(shè)定的比較

注：改進前程序為金黃地鼠其他臟器常規(guī)脫水程序；改進后程序為本實驗設(shè)定的脂肪組織脫水程序。

Note. The dehydration process of other organs before optimization.The optimized process of this experiment.

注：(A)改進前;(B)改進后。圖1 改進前后金黃地鼠脂肪組織石蠟切片HE染色比較(Bar=200 μm)Note.(A)Before optimization.(B)After optimization.Fig.1 Comparison of the hamster adipose tissue paraffin sections before and after optimization by Haematoxylin and Eosin staining

1.3.4 脂肪組織冰凍切片的制備

動物安樂死后，取脂肪組織迅速固定于甲醛鈣或10%中性福爾馬林固定液中，且固定液體積約為脂肪組織體積的50倍，并用紗布蓋住以防止脂肪組織漂浮。經(jīng)徹底固定且用衛(wèi)生紙吸水后，OCT包埋，凍于冰箱-80℃至少30 min。設(shè)置冰凍切片機箱體溫度為-20℃，樣品頭溫度為-30℃，切片厚度為10 μm。切片后不需要再固定即可入全自動染色機染色，若需要長期保存需根據(jù)實驗要求在丙酮或甲醛鈣中固定15 min，再放入冰箱-20℃保存。

2 結(jié)果

2.1 金黃地鼠脂肪組織在脫水程序改進前后HE染色比較

脂肪組織因其特殊的結(jié)構(gòu)，按常規(guī)程序脫水，包埋后進行切片，則切片困難且有空洞，展片時蠟片向四周擴散，染色后切片不完整。將脫水程序改進后，脂肪組織能與石蠟很好地融合在一起，切片時手感柔潤，且無空洞，展片時蠟片完整，染色后切片完整，結(jié)構(gòu)清晰。(見圖1)

2.2 改進后的脫水程序在其他動物脂肪組織石蠟切片中的應(yīng)用

脂肪組織主要由大量群集的脂肪細胞構(gòu)成，聚集成團的脂肪細胞由薄層疏松結(jié)締組織分割成小葉。經(jīng)過酒精及二甲苯的溶解成為空泡狀。本研究中，我們將改進后的程序應(yīng)用于小鼠，大鼠，兔，狗，猴及人脂肪組織中，制成的蠟塊能順利地切出完整的切片，經(jīng)染色后可見切面平整，層次清晰，無皺褶，無裂隙，脂肪細胞結(jié)構(gòu)完整，染色清晰。(見圖2)

2.3 經(jīng)改進后的脫水程序制備的石蠟切片在免疫組化中的應(yīng)用

經(jīng)改進后的脫水程序制備的石蠟切片對免疫組化染色未見明顯影響：細胞膜完整，細胞核清晰。免疫組化結(jié)果顯示：PPARγ和ITLN1在正常金黃地鼠脂肪組織中均有表達。PPARγ呈弱陽性表達，ITLN1呈陽性表達。(見圖3)

2.4 脂肪組織冰凍切片與石蠟切片HE染色的比較

脂肪組織幾乎不含水，在冰凍切片中難象其它組織一樣被凍硬。經(jīng)過不斷摸索，我們成功制備了脂肪組織的冰凍切片。從圖4B和圖4C中可以看到切片結(jié)構(gòu)完整，細胞間質(zhì)清晰，細胞膜略厚。與冰凍切片相比，石蠟切片(圖4A)染色顏色更鮮艷，脂肪空泡更為圓潤。從固定液選擇上看，甲醛鈣固定液處理的脂肪組織(圖4C)比10%中性福爾馬林處理的脂肪組織(圖4B)細胞形態(tài)更好一些，細胞膜更為清晰。

圖3 PPARγ和ITLN1在金黃地鼠脂肪組織石蠟切片中的表達(Bar=100 μm)Fig.3 The expressions of PPARγ and ITLN1 in hamster epididymal fat paraffin sections

注：(A)金黃地鼠脂肪組織蠟切片；(B)金黃地鼠脂肪組織冰凍切片；(C)BALB/c小鼠脂肪組織冰凍切片。圖4 脂肪組織冰凍切片與石蠟切片HE染色比較(Bar=50 μm)Note.(A)Paraffin sections of hamster adipose tissue.(B)Frozen sections of hamster adipose tissue.(C)Frozen sections of BALB/c mice adipose tissue.Fig.4 The comparison of frozen section and paraffin section by Haematoxylin and Eosin staining

3 討論

在相當長的一段時間內(nèi)，脂肪組織被單純的認為是能量儲備和調(diào)節(jié)的組織器官，直到1994年瘦素[2]的發(fā)現(xiàn)。隨著人們對脂肪組織在生命中的作用有了更深入的了解和全面的認識，脂肪生物學(xué)[3]誕生。日益增加的肥胖癥、糖尿病、動脈粥樣硬化及其他相關(guān)疾病，使脂肪組織備受關(guān)注，對其功能的認識也發(fā)生了根本的轉(zhuǎn)變。研究表明，脂肪細胞的分化對脂肪細胞的結(jié)構(gòu)和功能變化具有重大影響[4]。白色脂肪細胞的結(jié)構(gòu)和功能紊亂可引發(fā)肥胖、胰島素抵抗、炎癥，并與多種疾病如糖尿病、腫瘤、心腦血管疾病等的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[5-6]。而棕色脂肪組織不僅能御寒而且有助于改善葡糖糖的平衡，增強機體能量的消耗，從而阻止肥胖癥、糖尿病等疾病的發(fā)生[7]。

脂肪組織主要由大量群集的脂肪細胞構(gòu)成，脂滴占據(jù)了整個脂肪細胞的大部分。細胞內(nèi)脂滴的多少是判定脂肪細胞分化程度的重要指標。脂肪細胞內(nèi)脂滴的染色方法主要有油紅O染色和尼羅紅熒光染色法[8]，這兩種方法都需要冰凍切片。脂肪細胞幾乎不含水，在冰凍切片中很難象其它組織一樣被凍硬。本研究中，我們除了將溫度調(diào)低，對脂肪組織本身也做了處理，提高了切片質(zhì)量。因此在制備脂肪組織的冰凍切片時，先用甲醛鈣或10%中性福爾馬林固定液固定脂肪組織。若研究脂滴，切片前需要將脂肪組織在甲醛鈣固定液中徹底固定，且先在-80℃冰箱中冷凍至少30 min，冰凍切片機機體溫度調(diào)到-20℃，樣品頭溫度調(diào)到-30℃，切片再用冷甲醛鈣固定15 min后放-20℃保存?zhèn)溆?；若不研究脂滴，僅需要在10%中性福爾馬林固定液即可，切片再用冷丙酮固定15 min后放-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

而觀察細胞的基本形態(tài)和抗體的表達，可借助于石蠟切片，雖然脂質(zhì)會脫去，但細胞的基本形態(tài)不變，且能很好的保存抗原。金黃地鼠(Golden Hamster)對食源性的脂肪、膽固醇攝入較為敏感，是一種較好的脂代謝研究模型[9]，又由于附睪處脂肪體積大且形態(tài)完整，因此本研究中我們選取金黃地鼠的附睪脂肪作為實驗的基本條件。脂肪組織中含有較多的油脂成分，按常規(guī)脫水程序處理，切出的片子空洞，破碎。本研究通過實驗，不斷摸索，利用真空組織脫水機成功制備了完整的脂肪組織石蠟切片。

過氧化物酶體增殖子激活受體γ( peroxisome proliferator activatedreceptor-γ, PPARγ)具有脂肪組織特異性，是白色與棕色脂肪細胞的產(chǎn)生和分化所必需的一種專性轉(zhuǎn)錄因子[10]。腸凝集素1 ( intelectin 1，ITLN1 )是網(wǎng)膜脂肪組織特異性表達的脂肪細胞因子[11]。因此本研究中，我們選取PPARγ和ITLN1兩個基因在金黃地鼠脂肪組織中的表達來驗證我們的脫水條件對免疫組化染色無影響。

制備脂肪組織石蠟切片需要注意以下幾點：(1)固定：固定一定要徹底，這是制備任何病理切片都至為關(guān)鍵的一步，脂肪組織含有較多的油脂，有機溶劑不易滲透。固定液體積為脂肪組織體積的50倍，且用紗布蓋住以防止脂肪組織漂浮于液體表面而固定不全。(2)取材：改進的方法對于取材厚度和組織部位沒有特別的要求，無論是白色脂肪還是棕色脂肪只要常規(guī)取材2～3 mm即可。取材大小也無特殊要求。(3)脫水：脂肪易被酒精、二甲苯溶解，本實驗中，我們只調(diào)整了梯度酒精的脫水程序，組織在無水乙醇和二甲苯中時間過長，組織硬脆，不易切片。

切片制片方法的選擇上需要注意的幾點：(1)免疫組化，若所檢測抗原不穩(wěn)定，只能做冰凍切片。若所檢測抗原穩(wěn)定，原則上來講，冰凍、石蠟切片均可，但用石蠟切片檢測的染色效果要比冰凍切片好一些。(2)研究目的，石蠟切片對組織細胞的定位準確。冰凍切片可能會因為冰晶的形成而破壞組織細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。(3)標本保存，石蠟切片可長期保存且細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)保持良好。冰凍切片適合對新鮮組織制片且可以相對避免石蠟自發(fā)熒光的干擾。

用改進的方法制備的脂肪組織石蠟切片，結(jié)構(gòu)完整，一致性好，且對免疫組化結(jié)果無影響；冰凍切片的改進提高了切片質(zhì)量，結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)好，為脂肪組織的研究提供了有力的支撐條件。

[1] 徐玉環(huán),徐艷峰,劉穎等.視網(wǎng)膜血管鋪片技術(shù)的改進[J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2015,25(5):51-53,50.

[2] Zhang Y , Proenca R, Maffei M ,etal. Positionalcloing of the mouse obese gene and it s human homologue [J]. Nature， 1994, 372(6505): 425-432.

[3] Chaldakov GN, St ankulov IS, Hrist ova M,etal. Adipobiology of disease: adipokines and adipokine-targeted pharmacology [J]. Curr Pharma Des, 2003, 9(12): 1023-1031

[4] Mueller E. Understanding the variegation of fat: novel regulators of adipocyte differentiation and fat tissue biology [J]. BiochimBiophysActa, 2014, 1842(3): 352-357.

[5] Wozniak SE, Gee LL, Wachtel MS,etal. Adipose tissue: the new endocrine organ [J]. Science, 2009, 54(9): 1847-1856.

[6] Bartelt A，Heeren J． Adipose tissue browning and metabolic health [J]. Nat Rev Endocrinol, 2014, 10(1): 24-36.

[7] Castillo-Quan JI. From white to brown fat through the PGC-1α-dependent myokineirisin: implications for diabetes and obesity [J]. Dis Model Mech,2012, 5(3): 293-295．

[8] Xing Y, Yan F，Liu Y，etal．Matrine inhibits 3T3-L1 preadipocyte differentiation associated with suppression of ERK1/2 phosphorylation[J]. Biochem Biophys Res Commun,2010, 396(3): 691-695.

[9] Wang PR，Giu Q，Ippolito M，etal. High fat fed hamster，a unique animal model for treatment of diabetic dyslipidemia with peroxisome proliferator activated receptor alpha selective agonists [J]. Eur J Pharmacol, 2001, 427(3): 285-293.

[10] EL-Jack AK, Hamm JK, Pilch PF,etal. Reconstitution of insulin-sensitive glucose transport in fibroblasts requires expression of both PPARγand C/EBPα[J]. J Biol Chem, 1999, 274(12): 7946-7951

[11] Yang RZ，Lee MJ，Hu H，etal． Identification of omentin as a novel depot specific adipokine in human adipose tissue: possible role in modulating insulin action [J]. Am J Physiol Endocrinol MeTab,2006，290 (6): E1253-E1261.

A modification of adipose tissue preparation

XU Yu-huan, XU Yan-feng, LIU Ying , HUANG Lan , YU Pin, HAN Yun-lin, LI Yan-hong, ZHAO Wen-jie, DENG Wei, QIN Chuan, ZHU Hua*

(Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of medical Sciences. Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine, Ministry of Health, Key Laboratory of Human Diseases Animal Model, State Administration of Traditional Chinese Medicine, Beijing Key Laboratory for Animal Models of Emerging and Reemerging Infectious Diseases, Beijing 100021, China)

Objective To improve the method of paraffin section and frozen section of adipose tissues. Methods The adipose tissues were collected and quickly placed in 10% neutral formaldehyde. Sections were prepared by setting different dehydration procedures. The slices were observed under microscope after Hematoxylin-Eosin staining. The expression of PPARγ and ITLN1 in adipose tissues was detected by immunohistochemistry. For frozen sectioning, the adipose tissues were collected and quickly placed in 10% neutral formaldehyde or Calcium formaldehyde, After embedded by OCT, put in -80℃ refrigerator for at least 30 minutes. Setting the temperature of frozen section cabinet to -20℃ and the temperature of sample to -30℃. Results Following the improved methods, the slices of adipose tissues were better than before. The structural integrity and consistency of adipose tissues were preserved well, the staining was distinct, and the improved methods had no effect on immunohistochemistry results. The improvement of the frozen sectioning had greatly improved the slice quality, the adipose tissues showed complete structure and good morphology. Conclusions The improved methods can be successfully applied to different experimental animals, which provide a powerful condition for the study of adipose tissues.

Adipose tissues; Paraffin sections; Frozen sections

國家自然科學(xué)基金面上項目(81371546)。

徐玉環(huán)(1980-)，女，主管技師。E-mail: yuhuanxu1109@163.com

朱華(1971-)，女，主任技師，研究方向：病理與病理生理學(xué)。E-mail: zhuh@cnilas.org

技術(shù)方法

R-332

A

1671-7856(2017) 01-0079-06

10.3969.j.issn.1671-7856.2017.01.016

2016-06-17