柯薩奇病毒A16型感染性模型的建立及其相關免疫學指標和應用的評價

張 鋒，高 孟，高麗美，羅永能

(浙江省醫(yī)學科學院病毒病研究所，杭州 310013)

柯薩奇病毒A16型感染性模型的建立及其相關免疫學指標和應用的評價

張 鋒，高 孟，高麗美，羅永能*

(浙江省醫(yī)學科學院病毒病研究所，杭州 310013)

目的 建立簡便和可靠的對柯薩奇病毒A16型(coxsackievirus A16, CVA16)敏感的小型嚙齒類實驗動物模型。方法 選取不同日齡長爪沙鼠，腹腔接種CVA16后連續(xù)觀察14 d，篩選出對病毒敏感的最適接種日齡段；然后比較接種劑量與效應關系，測定其50%致死劑量(LD50)；并測定感染3 d后其血液和主要組織器官中CVA16病毒滴度；最后用CVA16滅活疫苗在1日齡和11日齡免疫2針沙鼠后，在14日齡時用LD50劑量病毒攻毒，觀察并記錄沙鼠體重、癥狀及死亡率，2周后眼球采血，應用微量中和試驗和ELISA分別檢測中和抗體效價和總抗體水平。結果 長爪沙鼠感染CVA16后出現(xiàn)活動減少、后肢無力、麻痹癱瘓、死亡等臨床癥狀，不同日齡沙鼠對CVA16感染的易感能力和感染后發(fā)病程度不同，7日齡和14日齡沙鼠易感，28日齡沙鼠不易感染，最敏感和最合適接種日齡為14日齡，其LD50為1×104.5 CCID50，感染3 d后其血液和主要組織器官中均可檢測到高滴度的CVA16病毒，免疫兩針滅活疫苗的14日齡沙鼠用LD50劑量攻毒，存活率87.5%，疫苗免疫誘導沙鼠產生的CVA16中和抗體幾何平均值(GMT)為28.14，抗體陽性率為87.5%。 結論 長爪沙鼠對CVA16敏感并且病毒能在其體內進行有效的復制和繁殖，可作為CVA16致病機制研究、疫苗研發(fā)及藥物評價的可靠小動物模型。

柯薩奇病毒A16型；長爪沙鼠；動物模型

柯薩奇病毒A16型(coxsackievirus A16, CVA16)屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，是引起手足口病(hand foot and mouth disease，HFMD)的主要病原體之一[1]。手足口病是一種全球性的傳染病，世界各地均有不同程度的流行。尤其在亞太地區(qū)，近年來疫情呈不斷上升的趨勢[2]。由于手足口病另一主要致病原腸道病毒71型(enterovirus 71, EV71)自2008年后在大陸及亞太地區(qū)多次大規(guī)模暴發(fā)流行已在易感人群中建立了一定程度的免疫屏障，近幾年CVA16等其它腸道病毒感染引發(fā)的病例已呈大幅上升趨勢，國內少數(shù)省份已有暴發(fā)流行并報告死亡病例[3]。國內外監(jiān)測數(shù)據(jù)也表明CVA16引起的HFMD有逐年增加趨勢，每隔一定時間就出現(xiàn)一次高峰[3]。

手足口病至今尚無高效、特異的藥物，對癥和支持治療是主要的措施。研發(fā)疫苗對全面有效地預防控制手足口病的暴發(fā)流行有重大意義，最近我國已完成EV71滅活疫苗的臨床試驗[4]并批準上市。相關實驗動物模型的建立和使用是上述疫苗研制過程中至關重要的環(huán)節(jié)之一，目前國內外研究CVA16主要是使用小于7日齡的小鼠乳鼠，我們先前的實驗和他人報道均發(fā)現(xiàn)超過7日齡的小鼠乳鼠就不能感染[5,6]。然而這種小鼠乳鼠模型由于免疫系統(tǒng)發(fā)育尚未成熟等原因，在實際使用上有很大限制。因此，我們借鑒Yao等[7]建立腸道病毒71型感染長爪沙鼠模型的成功經(jīng)驗，使用CVA16 YY157株感染清潔級長爪沙鼠，以期建立比小鼠乳鼠模型更加簡便和可依賴的對CVA16敏感的小型嚙齒類動物模型，用于CVA16的發(fā)病機制、疫苗研發(fā)和抗CVA16藥物評價。

1 材料和方法

1.1 細胞和病毒

Vero細胞來源于美國標準生物品收藏中心(american type culture collection，ATCC)；CVA16病毒YY157株由本研究所保存[8-10]。用Vero細胞培養(yǎng)繁殖CVA16 YY157株，并用微量細胞病變法測定病毒的感染性滴度。病毒上清反復凍融3次后，低溫離心(5000 r/min,離心力3900 g,20 min)取上清，0.2 μm濾膜過濾后，-80℃冰箱中保存。

1.2 實驗動物

清潔級Z:ZCLA長爪沙鼠，由浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心[SCXK(浙)2014-0001]提供，1日齡，8只，體重3～3.5 g；7日齡，16只，體重6～7 g；14日齡，68只，體重10～11 g；21日齡，16只，體重15～17 g；28日齡，16只，體重20～22 g，動物的飼養(yǎng)和實驗在浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心進行[SYXK(浙)2011-0166]。并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物實驗

選取7、14、21和28日齡清潔級長爪沙鼠(各日齡8只)，各組腹腔內分接種病毒量1×105細胞培養(yǎng)半數(shù)感染量(CCID50)/只，每日觀察并記錄沙鼠的臨床癥狀和存活/死亡情況，連續(xù)觀察14 d，篩選出對CVA16病毒最敏感和最合適的沙鼠日齡段。取適齡的沙鼠48只，隨機分成6組(每組8只)，各組腹腔內分別接種CVA16(1×102、1×103、1×104和1×105CCID50/只)和對照MEM液，每日觀察并記錄沙鼠的癥狀和存活/死亡情況，連續(xù)觀察14 d，最后用Reed-Muench法計算出CVA16對沙鼠的LD50劑量, 并以此為基數(shù)確定后續(xù)實驗所需接種的適宜劑量。

1.3.2 臨床癥狀判定標準

根據(jù)臨床表現(xiàn)劃分5個等級：0.正常；1.毛發(fā)豎起、體重下降和行動不便；2.后肢無力；3.單肢麻痹；4.雙肢麻痹；5.死亡。

1.3.3 感染沙鼠的血液和主要組織器官中CVA16病毒滴度測定

選擇14日齡長爪沙鼠3只，腹腔內注射接種LD50劑量(即1×104.5 CCID50)的CVA16，感染3 d后分別取血液、后肢肌肉、心臟、肝臟、肺、腦和腸道等7個組織，稱重(除血液外)后加入10倍(體積重量比)的PBS，超聲至勻漿后離心，取各上清液用MEM培養(yǎng)液作10倍梯度稀釋至10-1～10-8，分別接種于Vero細胞長滿單層96孔板中，置5%CO2培養(yǎng)箱中35℃培養(yǎng)7 d后，用顯微鏡觀察CPE產生與否，用Reed-Muench法計算血液和上述各組織提取上清液的CVA16滴度。

1.3.4 CVA16滅活疫苗制備

病毒收獲液經(jīng)離心澄清，按1∶4000的比例加入福爾馬林，37℃滅活3 d；超濾濃縮后，采用Sephacryl S-400 HR凝膠過濾層析和Source 30Q離子交換層析2步層析法純化CVA16，進行各項檢定及分析合格后，再除菌過濾，2～8℃保存，用時加入鋁佐劑，稀釋成蛋白含量10 μg/100 μL的劑量。

1.3.5 CVA16滅活疫苗對長爪沙鼠的免疫保護

新生1日齡的沙鼠腹腔內接種CVA16滅活疫苗(蛋白含量10 μg/100 μL只)，10 d后加強免疫一次。等沙鼠14日齡時，用LD50病毒劑量進行攻毒實驗，觀察并記錄沙鼠體重、癥狀及死亡率，2周后眼球采血，用ELISA檢測血清中抗CVA16特異性抗體水平和體外微量中和試驗檢測其抗血清中和CVA16的能力，評價CAV16滅活疫苗的免疫原性。

1.3.6 體外微量中和試驗檢測中和抗體滴度

將沙鼠摘眼球采血，血清采用經(jīng)典體外微量中和試驗檢測中和抗體效價。將免疫血清自1∶8開始進行2倍系列稀釋后，分別與100 CCID50 CVA16等體積混合，接種于Vero細胞長滿單層96孔板中，置5%CO2培養(yǎng)箱中35℃培養(yǎng)7 d后，用顯微鏡觀察CPE，以能抑制50%細胞病變的最高稀釋度的倒數(shù)作為中和抗體效價，每次試驗均設細胞、病毒對照，檢測結果以中和效價≥1∶8判為CVA16中和抗體陽性。

1.3.7 ELISA檢測血清中CVA16特異性抗體水平

將沙鼠血清用1%BSA液稀釋100倍后加入包被CVA16抗原的反應孔，100 μL/孔，同時利用BSA和陰性血清設立空白對照和陰性對照，37℃孵育1 h后洗滌5次；將HRP標記的羊抗鼠IgG 進行1∶10000稀釋后加入反應孔，100 μL/孔，37℃孵育30 min后洗滌5次；每孔加入100 μL OPD顯色液，37℃避光反應15 min后加入50 μL 2 M硫酸終止反應，用酶標儀測定490 nm的吸光度值。以陰性對照孔的平均吸光度值的2.1倍為閾值判定陽性。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism5軟件分析處理數(shù)據(jù)，組間比較采用獨立樣本Bonferroni′s Multiple Comparison Test，P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CVA16病毒感染長爪沙鼠的敏感性試驗

長爪沙鼠感染CVA16后可出現(xiàn)活動減少、后肢無力、麻痹癱瘓、死亡等臨床癥狀(圖1)。不同日齡長爪沙鼠對CVA16 感染的敏感性不同并存在明顯差異。7日齡長爪沙鼠在攻毒后第3天出現(xiàn)癥狀，第8天全部死亡，存活率為0；14日齡長爪沙鼠在攻毒后第4天出現(xiàn)臨床癥狀，第9天全部死亡，存活率為0；21日齡長爪沙鼠也在攻毒后第4天出現(xiàn)癥狀，但臨床癥狀比7日齡和14日齡鼠輕，第7天有部分感染沙鼠死亡，第8天感染沙鼠癥狀開始減輕，存活率為62.5%；28日齡長爪沙鼠在攻毒后第4天出現(xiàn)輕微臨床癥狀(毛發(fā)豎起，輕微肌無力)，第9天起逐步恢復正常，存活率為100%(圖2)。7日齡和14日齡沙鼠對CVA16 感染的敏感性有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)，21日齡和28日齡沙鼠感染CVA16也會出現(xiàn)臨床癥狀或死亡，但差異不具有統(tǒng)計學意義(P> 0.05)。按照長爪沙鼠日齡、臨床評分和存活率，確定14日齡長爪沙鼠為CVA16病毒感染最合適的對象，并用于后續(xù)試驗。

注：(A)正常；(B)病變。圖1 14日齡長爪沙鼠感染CVA16出現(xiàn)后肢麻痹 Note.(A)normal.(B)paralysis.Fig.1 Hindlimb paralysis caused by CVA16 infection in 14-day-old Mongolian gerbils

注：組間比較，*P < 0.05。圖2 CVA16感染長爪沙鼠的敏感性試驗(n=8)Note. Compared with multiple groups，*P < 0.05.Fig.2 Sensitivity test of CVA16 infection in Mongolian gerbils

2.2 CVA16病毒感染長爪沙鼠的劑量與效應關系

14日齡長爪沙鼠注射不同劑量病毒，表現(xiàn)的癥狀與劑量成正相關性(P< 0.0001)。用1×105CCID50病毒量攻毒，第3天出現(xiàn)臨床癥狀，在注射第8～9天全部死亡，存活率為0。隨著病毒量減少，出現(xiàn)癥狀減輕，存活率提高，1×104CCID50病毒量，平均臨床評分2.54，存活率62.5%；1×103CCID50病毒量，平均臨床評分1.44，存活率75%；1×102CCID50病毒量，平均臨床評分0.88，存活率87.5%。1×105和1×104CCID50病毒量與對照MEM液組比較有明顯差異(P< 0.05)。最后用Reed-Muench法計算出CVA16對沙鼠的LD50劑量為1×104.5 CCID50病毒量，結果見圖3。

注：與對照組比較，*P < 0.05。 圖3 CVA16感染沙鼠的劑量與效應關系(n=8) Note.Compared with control group，*P < 0.05.Fig.3 Dose-dependent consequence of CVA16 infection in Mongolian gerbils

2.3 感染沙鼠的血液和主要組織器官中CVA16病毒的復制繁殖

根據(jù)對14日齡長爪沙鼠感染3 d后的血液和所選擇主要組織器官提取上清液中CVA16病毒滴度的測定結果(圖4)，CVA16病毒均有存在，在后肢肌肉和腦組織中滴度最高(達6×105CCID50)，表明CVA16確實感染了長爪沙鼠并在其體內進行了有效的復制和繁殖。

圖4 CAV16感染14日齡長爪沙鼠3 d后血液和主要組織中的病毒滴度Fig.4 Virus titers in various tissues of CVA16-infected Mongolian gerbils 3 days post-infection

2.4 CVA16滅活疫苗對長爪沙鼠的免疫保護作用

免疫兩針CVA16滅活疫苗的14日齡沙鼠用LD50劑量攻毒，注射第5天有2只出 現(xiàn)臨床癥狀，一只癥狀較輕，另一只第7天死亡，存活率87.5%。疫苗免疫誘導沙鼠產生的CVA16中和抗體幾何平均滴度(GMT)為28.14，特異性抗體陽性率為87.5%，而且中和抗體效價高低與ELISA測定的總抗體OD值完全對應，呈現(xiàn)正相關性(表1)。上述結果表明CVA16滅活疫苗對長爪沙鼠有顯著的免疫保護效果。

表1 CVA16滅活疫苗對長爪沙鼠的免疫原性

注： GMT為28.14；中和抗體效價≥l：8判斷為抗體陽性；以陰性對照2.1倍為閾值判定陽性，cutoff值0.201。

Note. GMT to 28.14.Neutralizing antibody titer ≥1∶8 judged to be antibody positive. To 2.1 times the negative control positive determination, cutoff values for 0.201.

3 討論

柯薩奇病毒A16型是引起手足口病的主要病原體之一，近年來越來越多報道顯示CVA16除引起輕癥外，亦可導致心肌、心包、腦部和肺部等疾病，甚至引發(fā)致死性心肌炎、腦干腦炎和肺炎等致死性癥狀[1]，研發(fā)相應疫苗對全面有效地預防控制手足口病的暴發(fā)流行有重大意義。動物模型是疫苗臨床前研究階段評價保護效果等關鍵指標的重要工具，直接影響疫苗評價的準確性。目前常用的動物模型主要是小鼠乳鼠模型和猴體模型，小鼠乳鼠是相對敏感和常用的小動物感染模型，但由于其感染年齡過低，感染周期短，限制了其在疫苗免疫效果評價和藥物篩選中的應用；而最為接近人類的猴體動物模型的研究雖然已經(jīng)取得了一定的進展，但由于存在動物來源困難、飼養(yǎng)環(huán)境要求高、運輸條件苛刻、試驗費用高等客觀原因，極大地限制了該模型的應用和發(fā)展。因此，開發(fā)建立新的手足口病小動物模型具有實際意義[7]。

長爪沙鼠屬于嚙齒目、沙鼠屬動物,1935年由日本人開始馴化和實驗動物化，60年代開始作為實驗動物應用于醫(yī)學研究。其對流行性出血熱病毒、幽門螺旋桿菌、寄生蟲等多種病原體易感，相比于其他嚙齒類實驗動物，長爪沙鼠受感染可表現(xiàn)出與人類更相似的病理學特征和臨床癥狀，因此長爪沙鼠作為具有獨特生物學特性的“多功能”實驗動物，已廣泛用于疫苗研制和病原感染等生物醫(yī)學研究領域[11-13]。Yao等[7]用一株臨床分離的EV71病毒感染長爪沙鼠，發(fā)現(xiàn)7到28日齡沙鼠感染后展現(xiàn)后肢麻痹、行動遲緩、運動失調和昏睡倦怠等癥狀并最終致死,另伴有嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關病變，28至49日齡沙鼠對EV71敏感度逐漸降低，而49日齡以上沙鼠感染EV71后沒有表觀癥狀但多數(shù)產生相應的中和抗體。同時，他們對新生沙鼠腹腔內接種EV71滅活疫苗(20 mg/只)并在一周后加強免疫一次，再隔2周后即21日齡時，用致死劑量(100倍LD50)EV71病毒進行攻毒實驗，發(fā)現(xiàn)接種EV71滅活疫苗對長爪沙鼠具有完全的免疫保護效果[7]。

CVA16病毒YY157株臨床分離后未經(jīng)小鼠活體馴化傳代，前期工作中我們已測定了其基因組核酸全序列(GenBank序列號KC507895)、探索了其在Vero等[8，9]細胞中培養(yǎng)與增殖特性并確定了衣殼蛋白VP1～VP3的B淋巴細胞線性抗原表位[10]。我們將經(jīng)過體外細胞培養(yǎng)繁殖并收獲的CVA16 YY157株病毒通過腹腔注射感染長爪沙鼠，后者出現(xiàn)活動減少、后肢無力、麻痹癱瘓、死亡等臨床癥狀,對CAV16感染的敏感性與沙鼠日齡相關即鼠齡越小越敏感；在劑量與效應關系實驗結果顯示癥狀和死亡率與劑量成正相關性，其LD50量與小鼠乳鼠模型接近[5]。先前在成功建立EV71 H3-TY株感染小鼠乳鼠模型基礎上，我們也曾嘗試建立CAV16 YY157株感染小鼠乳鼠模型，發(fā)現(xiàn)5日齡以下乳鼠才能被有效感染并展示類似的表型癥狀和劑量與效應關系。在本實驗中感染CVA16使用的是7日齡以上長爪沙鼠，并通過腹腔注射途徑，不同于小鼠乳鼠模型的顱內注射，不會直接破壞神經(jīng)系統(tǒng)，更能客觀反映病毒感染特征，實驗結果也顯示應該比小鼠乳鼠模型具有更大實用價值。

在疫苗研發(fā)中，疫苗免疫原性和保護效果評價是疫苗質量的關鍵指標。與小鼠乳鼠模型(通過免疫懷孕母鼠，對其所產新生乳鼠攻毒)相比,長爪沙鼠模型避免了前者通過母傳抗體間接評價疫苗模式帶來的相關問題，同時也降低了由于小鼠乳鼠日齡過小給實驗帶來的不確定性，更能真實反映疫苗免疫保護效果。本文前述的CVA16滅活疫苗對的長爪沙鼠免疫保護實驗中有2只在攻毒后第5天出現(xiàn)臨床癥狀，其中1只在攻毒后第7天死亡，導致存活或免疫保護率不是100%，很可能與免疫劑量低(10 mg/100 mL/只)和個體差異導致的中和抗體滴度不高有關。但CVA16感染長爪沙鼠引發(fā)的癥狀及其滅活疫苗的免疫保護作用均和EV71高度類似[7]。下一步我們將通過分子生物學方法檢測相關細胞因子水平等狀況。

總之，本實驗利用浙江省實驗動物中心馴養(yǎng)的Z:ZCLA長爪沙鼠建立了簡便和可靠的對CAV16敏感的又一小型動物模型，其進一步優(yōu)化、完善了CVA16的現(xiàn)有動物模型，可用于CVA16病毒致病機制、感染特點的研究和其相關疫苗及藥物效果的評價。

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Establishment of an animal model for coxsackievirus A16 infection related immunological evaluation

ZHANG Feng, GAO Meng, GAO Li-mei, LUO Yong-neng*

(Institute of Viral Diseases, Zhejiang Academy of Medical Sciences, Hangzhou 310013,China)

Objective To establish a simple and reliable experimental rodent model sensitive to coxsackievirus A16 (CVA16).Methods Mongolian gerbils with different age were selected and inoculated intraperitoneally with live CVA16, and the gerbils were observed daily until 14 days postinoculation to screen for the most optimal ages sensitive to the virus. The dose-dependent symptoms were evaluated and the 50% lethal dose (LD50) was determined. The virus titers were measured in blood and various tissues of CVA16-infected Mongolian gerbils 3 days post-infecton. Finally, the gerbils were immunized twice with inactivated CVA16 vaccine at day 1 and day 11, respectively, followed by challenge with the virus with a dose of LD50 at day 14. The gerbils were then observed for another 2 weeks to record their body weight, symptom and mortality rate. Their blood samples were collected from the eyes, and CVA16-specific neutralizing antibody titers and total antibody titers was checked by microneutralization test and ELISA, respectively. Results Various clinical symptoms, such as inactivity, hind limb weakness, paralysis and even death occurred in gerbils following CAV16 infection. 7-day-old and 14-day-old gerbils are susceptible to CVA16 infection whereas 28-day-old gerbils are resistant. The most sensitive and appropriate age is 14-day-old. The 50% lethal dose was determined to be 1×104.5 CCID50. High titers of the virus were confirmed in blood and various tissues of Mongolian gerbils contracted CAV16 3 days post-infecton. The survival rate is 87.5% for 14-day-old gerbils preimmunized with two doses of inactivated CVA16 vaccine and challenged with the virus. The geometric mean titers (GMTs) of neutralizing antibody was 28.14, and the seroprevalence was 87.5%. Conclusions Mongolian gerbils is sensitive to CVA16 and the virus reproduces actively in Vivo. Thus, it can be used as a reliable small animal model for studies of CVA16 pathogenesis, vaccine development and drug evaluation.

Coxsackievirus A16; Mongolian gerbils; Animal model

浙江省科技計劃項目(2014C37014,2016C37102)。

張鋒(1974-)，男，高級實驗師，研究方向：從事醫(yī)學病毒學研究。E-mail：13957185700@163.com

羅永能(1966-)，男，博士，研究員，研究方向：從事醫(yī)學病毒學研究。E-mail：ynl101@163.com

研究報告

R-332

A

1671-7856(2017) 01-0037-06

10.3969.j.issn.1671-7856.2017.01.008

2016-07-04