淫羊藿苷對實驗性IgA腎病大鼠的作用及相關(guān)機制

張 紅, 劉 念, 李 征

(鄭州大學(xué)附屬南陽市中心醫(yī)院 1.腎病風(fēng)濕免疫科；2.骨二科；3.泌尿外科，河南 南陽 473400)

淫羊藿苷對實驗性IgA腎病大鼠的作用及相關(guān)機制

張 紅1*, 劉 念2, 李 征3

(鄭州大學(xué)附屬南陽市中心醫(yī)院 1.腎病風(fēng)濕免疫科；2.骨二科；3.泌尿外科，河南 南陽 473400)

目的 探究不同劑量的淫羊藿苷對實驗性IgA腎病大鼠的影響，并研究其相關(guān)作用機制。 方法 建立實驗性IgA腎病大鼠模型，實驗共分為5組，正常對照組(con)，造模組(IgA)，淫羊藿苷低劑量組(ICA-L)，淫羊藿苷中劑量組(ICA-M)和淫羊藿苷高劑量組(ICA-H)；各組經(jīng)相應(yīng)處理后，測定各組大鼠尿紅細(xì)胞、尿蛋白和尿NAG水平；免疫熒光染色檢測IgA沉淀情況；免疫組化染色法與實時熒光定量PCR分別檢測NF-κBp65與MCP-1的蛋白表達水平和IL-4，IL-10與IL-13的mRNA表達變化。 結(jié)果 給予淫羊藿苷處理后，降低實驗性IgA腎病大鼠的尿紅細(xì)胞、尿蛋白和尿NAG水平與減少IgA沉淀，并降低NF-κBp65與MCP-1的蛋白表達水平和IL-4，IL-10與IL-13的mRNA表達。 結(jié)論 淫羊藿苷對實驗性IgA腎病有一定的療效，可能與調(diào)控NF-κBp65，MCP-1因子的表達以及機體免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。

淫羊藿苷；IgA腎??；NF-κBp65；MCP-1；IL-4；IL-10；IL-13

IgA腎病(IgA nephropathy，IgAN)是最常見的原發(fā)性腎小球疾病之一，主要表現(xiàn)為腎小球系膜區(qū)IgA沉積，伴隨膜細(xì)胞增生和系膜基質(zhì)擴張[1]。臨床病狀表現(xiàn)多樣，主要有腎病綜合征、高血壓、急性腎炎與腎功能不全等，既往認(rèn)為IgA腎病患者的預(yù)后良好，但仍有25%～30%的患者最終發(fā)展為終末期腎病[2]。IgA腎病及導(dǎo)致得腎衰竭給患者造成嚴(yán)重的健康困擾及沉重的經(jīng)濟分擔(dān)。因此，有效地預(yù)防及治療IgA腎病是臨床急切需要解決的難題。

淫羊藿苷(Icariin，ICA)是小檗科淫羊藿屬淫羊藿莖葉的主要活性成分之一。主要具有免疫調(diào)節(jié)，抗腫瘤，促進骨細(xì)胞發(fā)育和心血管系統(tǒng)等藥理作用。吳東方等[3]研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷通過抑制腎皮脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生與減輕谷胱甘肽的消耗，從而降低腎損傷大鼠的血肌酐和尿素氮水平。另外，陳香美等[4]研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷能夠增加Na+-K+-ATP酶活性，減輕慶大霉素對腎小管與腎間質(zhì)的損傷。此外，研究表明淫羊藿苷還可增強血凝素，從而誘生IL-2、IL-3和IL-6的作用，與劑量呈正相關(guān)，通過促進IL-2的含量提高淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和B細(xì)胞的功能[5]。隨著淫羊藿苷的藥理作用研究的不斷深入，臨床上療效也顯示出巨大的優(yōu)勢。我們通過建立IgA腎病大鼠模型，探討不同劑量的淫羊藿苷對IgA腎病的作用，并研究其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠50只，體重180～200 g，雌雄各半，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，[SCXK(京)2014-0009]。飼養(yǎng)于南陽理工學(xué)院中醫(yī)學(xué)實驗中心SPF級動物房，實驗動物使用許可證號[SYXK(豫)2014-0006]，相對濕度45%～75%。并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑

淫羊藿苷(Icariin)購自西安小草植物科技有限公司，純度>98%；牛血清白蛋白購自北京希凱創(chuàng)新科技有限公司；脂多糖購自Sigma公司，NF-κBp65與MCP-1抗體購自博士德生物工程有限公司；IL-4，IL-10，IL-13引物購自廣州邁博生物科技有限公司；其他試劑購自國產(chǎn)分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物造模與分組

將健康SD大鼠進行1周的適應(yīng)性喂養(yǎng)，造模方法按照湯穎等[6]實驗性IgA腎病模型進行，除正常對照組(control group)外，其余各組大鼠用400 mg/kg 10%牛血清白蛋白灌胃，每日一次，直至實驗結(jié)束，共21周；于第6周和第8周末尾靜脈注射0.05 mg脂多糖，每只每次；每周末皮下注射蓖麻油0.5 mL與四氯化碳0.1 mL，共給藥9周；正常對照組在相應(yīng)時間等體積給予蒸餾水灌胃，生理鹽水皮下注射和尾靜脈注射。于第9周末，心臟取血處死4只模型組大鼠，取腎臟組織做免疫熒光檢查，其余大鼠隨機分為造模組(IgA group)，淫羊藿苷低劑量組(ICA-L group)，淫羊藿苷中劑量組(ICA-M group)和淫羊藿苷高劑量組(ICA-H group)，在第9周末開始，淫羊藿苷低劑量組，淫羊藿苷中劑量組和淫羊藿苷高劑量組分別灌胃60 mg/kg，90 mg/kg和120 mg/kg，每日一次，直至實驗結(jié)束，共12周，試驗中并無大鼠死亡。

1.3.2 尿紅細(xì)胞、尿蛋白和尿NAG水平的測定

于21周末，將大鼠置于代謝籠中，飲食正常，收集24 h尿液，測量尿液中尿紅細(xì)胞、尿蛋白和尿NAG的水平。

1.3.3 免疫熒光染色

處死大鼠后，摘除腎臟，用組織包埋劑OCT包埋后，置于-80℃液氮中冷凍，切片，晾干，PBS洗滌3次，滴入加FITC標(biāo)記的IgA抗體(1∶50)，置于37%孵育30 min，PBS洗滌，滴入甘油封片，置于熒光顯微鏡觀察IgA的沉淀情況與綠色熒光的強度。

1.3.4 免疫組化染色

將大鼠腎組織制成石蠟切片，置于80℃烘箱60 min，分別浸泡于二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min，再置于梯度酒精(100%、95%、85%、75%)浸泡5 min，PBS沖洗，置于3% H2O2浸泡8 min，PBS沖洗，加入8%山羊血清封閉，孵育10 min，滴入一抗，4℃孵育過夜，PBS沖洗，加入相應(yīng)帶生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育20 min，加入DAB顯色劑，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，1%鹽酸分化，碳酸鋰溶液藍化，梯度酒精脫水(75%，85%，95%，100%)，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明，中性樹脂封片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.5 實時熒光定量PCR(qPCR)

取各組大鼠腎臟組織，依據(jù)Trizol說明書要求，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用PCR儀進行擴增，所用引物序列如表1所示。擴增條件：94℃ 30 s，63℃ 30 s，73℃ 45 s，共34個循環(huán)，74℃延伸5 min。實驗結(jié)果在熒光定量操作系統(tǒng)中進行分析對比，目標(biāo)基因的相對定量用2-△△CT計算。

表1 引物序列

表2 尿紅細(xì)胞、尿蛋白和尿NAG水平變化(±s，n=10)

Tab.2 The change of urine erythrocyte, urinary protein and urinary NAG content

表2 尿紅細(xì)胞、尿蛋白和尿NAG水平變化(±s，n=10)

組別Group尿紅細(xì)胞(per/μL)Urineerythrocyte尿蛋白(mg/L)Urinaryprotein尿NAG(U/L)UrinaryNAG正常對照組Controlgroup712±3．57853±4．38097±0．47造模組IgAgroup39186±13．94a6218±11．73a612±1．64a淫羊藿苷低劑量組ICA?Lgroup26428±18．57ab4867±8．34ab453±1．57ab淫羊藿苷中劑量組ICA?Mgroup17362±15．82ab3246±4．57ab283±0．83ab淫羊藿苷高劑量組ICA?Hgroup8634±9．34ab1834±2．37ab176±0．37ab

注：與正常對照組相比，aP< 0.05；與IgA組相比，bP< 0.05。

Note.aP< 0.05 vs control group.bP< 0.05 vs IgA group.

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示；組間采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，P< 0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 尿紅細(xì)胞、尿蛋白和尿NAG水平

與control組相比，IgA組大鼠的尿紅細(xì)胞、尿蛋白和尿NAG水平均顯著升高(P< 0.05)，給予淫羊藿苷干預(yù)后，隨劑量增大尿紅細(xì)胞、尿蛋白和尿NAG水平逐漸下降，如表2所示。

2.2 腎組織IgA免疫熒光檢測結(jié)果

如圖1所示，control組不出現(xiàn)IgA沉淀；IgA組大鼠腎小球系膜區(qū)出現(xiàn)彌漫性顆粒狀沉淀，強陽性綠色熒光，呈彌漫性團塊狀；給予淫羊藿苷干預(yù)的大鼠腎組織沉淀較少，呈弱綠色熒光，并隨劑量升高熒光強度減弱。

2.3 腎組織的NF-κBp65與MCP-1的蛋白表達水平

如圖2,3所示，control組腎組織中NF-κBp65與MCP-1蛋白少量表達；與control組相比，IgA組中NF-κBp65與MCP-1的蛋白表達顯著升高，呈強陽性表達；與IgA組相比，給予淫羊藿苷干預(yù)后，隨劑量增大，NF-κBp65與MCP-1的蛋白表達逐漸減弱。

2.4 腎組織中IL-4， IL-10與IL-13的mRNA表達變化

如圖4所示，與control組相比，IgA組中IL-4，IL-10和IL-13的mRNA表達顯著升高(P< 0.05)；與IgA組相比，給予淫羊藿苷干預(yù)后，隨劑量增大，IL-4，IL-10和IL-13的mRNA表達逐漸減弱。

圖1 腎組織IgA免疫熒光檢測結(jié)果Fig.1 The immunofluorescence result of IgA

圖2 免疫組化染色檢測NF-κBp65蛋白的表達變化Fig.2 The protein expression of NF-κBp65

圖3 免疫組化染色檢測MCP-1蛋白的表達變化Fig.3 The protein expression of MCP-1

注： aP < 0.05 vs con組； bP < 0.05 vs IgA組。圖4 淫羊藿苷對 IL-4， IL-10與IL-13 mRNA表達變化的影響(±s，n=3)Note. aP < 0.05 vs control group. bP < 0.05 vs IgA group.Fig.4 The effect on the mRNA expression of IL-4, IL-10 and IL-13 by icariin

3 討論

本試驗采用聯(lián)合牛血清白蛋白+脂多糖+蓖麻油+四氯化碳方法進行造模，通過免疫熒光結(jié)果顯示造模組大鼠腎小球系膜區(qū)出現(xiàn)彌漫性顆粒狀沉淀，符合IgA腎病的病理變化，提示本試驗IgA腎病大鼠模造模成功。蛋白尿是IgA腎病患者最常出現(xiàn)的臨床癥狀，蛋白尿是引起腎小管間質(zhì)損害的因素之一，使腎小管細(xì)胞缺氧導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞萎縮[7]。本試驗顯示淫羊藿苷明顯減輕IgA腎病大鼠的尿紅細(xì)胞、尿蛋白和尿NAG水平，從而減少對腎小管間質(zhì)的損害。

核轉(zhuǎn)錄因子κB是轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員，主要參與免疫反應(yīng)、淋巴細(xì)胞分化、細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，參與多種調(diào)控多種炎癥細(xì)胞因子和趨化因子的合成[8]。NF-κB參與調(diào)控IL-2、IL-6、IL-8、MCP-1等參與多種腎臟疾病發(fā)生發(fā)展過程[9]。通常NF-κB與多肽p65和p50蛋白亞基組成二聚體，但只有p65在蛋白c末端含有轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域[10]。MCP-1是單核巨噬細(xì)胞最重要的趨化和活化因子。研究表明NF-κB在腎小球腎炎模型中活性顯著增強，且MCP-1的表達上調(diào)，抑制NF-κB后MCP-1的表達下調(diào)，提示MCP-1的表達與NF-κB密切相關(guān)[11,12]。在IgA腎病中蛋白尿可引起NF-κB的活化，從而增強MCP-1的表達，引起單核細(xì)胞趨化浸潤激活[13]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷抑制IgA腎病中NF-κB與MCP-1的表達，并與劑量呈正相關(guān)，提示淫羊藿苷可能通過抑制NF-κB與MCP-1的表達，從而抑制單核細(xì)胞的趨化浸潤，從而減輕對腎間質(zhì)的損傷。

IL-4，IL-10與IL-13主要是由Th2細(xì)胞產(chǎn)生，具有普遍抑制炎癥細(xì)胞因子的作用，促進抗體的生成，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。其中IL-4與IL-13是可直接影響IgA源性B細(xì)胞的增殖和活化，影響抗體的分泌，對腎小管上皮細(xì)胞造成一定的損傷。已有研究發(fā)現(xiàn)IL-4與IL-13對腎小管上皮細(xì)胞的形態(tài)和功能有所影響，進而對腎小管上皮細(xì)胞造成損傷[14]。徐勇等[15]研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用IL-4與IL-10可抑制中性白細(xì)胞浸潤，對腎缺血在灌注損傷的大鼠有腎保護的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷通過抑制IgA腎病大鼠腎組織中IL-4，IL-10與IL-13的表達，從而對腎具有保護作用。

綜上所述，淫羊藿苷對Ig腎病具有一定的療效，可能與淫羊藿苷對NF-κB與MCP-1因子的表達的影響，以及機體免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。

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專家問答

問：不同類型的糖尿病動物模型血糖檢測在何時進行合適？

答：DM動物模型分為 1型糖尿病(T1DM)模型和2型糖尿病(T2DM)模型，T1DM動物模型主要檢測空腹血糖，而T2DM動物模型除檢測空腹血糖外，同時還檢測餐后血糖和隨機血糖，因此，不同類型的DM模型的血糖檢測時間和要求也是不同的。

1、空腹血糖檢測的合適時間

(1)T1DM動物模型空腹血糖檢測的合適時間，一般在早上8:00～9:00，大動物要求提前禁食不禁水12 h以上，嚙齒類動物T1DM模型提前禁食不禁水要求10～12 h。

(2)T2DM動物模型空腹血糖檢測的合適時間：大鼠、小鼠等嚙齒類動物T2DM模型空腹血糖的合適檢測時間是在下午4:00～5:00，大鼠提前禁食不禁水6～8 h，小鼠提前禁食不禁水5～6 h。其它動物T2DM模型空腹血糖的合適檢測時間在早上8:00～9:00，要求提前禁食不禁水12 h以上。

2、餐后血糖檢測的合適時間

餐后血糖通常是口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)2 h血糖，也有研究者采用動物進食后2 h或3 h血糖。餐后血糖檢測的合適時間，一般在早上8:00～9:00，大動物要求提前禁食不禁水12 h以上，嚙齒類動物DM模型禁食不禁水要求10～12 h。

3、隨機血糖檢測的合適時間

大鼠、小鼠等嚙齒類動物T2DM模型的合適檢測時間是在上午未加喂飼料前或在加喂飼料后3 h至下午加喂飼料前。其它一日二餐定時飼喂的動物，T2DM模型隨機血糖的合適檢測時間是在上午飼喂后3 h至下午飼喂前。

(感謝浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心 陳民利 教授的解答)

Effects of Icariin of experimental IgA nephropathy in rats

ZHANG Hong1，LIU Nian2，LI Zheng3

(1.Department of Nephropathy Rheumatology,2.Department of Orthopaedics, 3.Department of Urology, Nanyang Central Hospital of Zhengzhou University, Nanyang 473400, China)

Objective To investigate the effect of Icariin (ICA) experimental IgA nephropathy in rats and to explore related mechanisms. Methods Experimental IgA nephropathy rat model was established and then model rat were treated with or without different doses of ICA. Then, urine RBC, Urine protein and urine NAG were analyzed; IgA precipitation was detected with immunofluorescence staining; the protein level of NF-κBp65 and MCP-1 were examined by immunohistochemical staining; the mRNA level of IL-4, IL-10 and IL-13 were determined by quantitative PCR. Results The concentrations of urine RBC, Urine protein and urine NAG were reduced after ICA treatment, as companied by a decrease of IgA precipitation. Moreover, ICA treatment also decreased the protein level of NF-κBp65 and MCP-1, and the mRNA level of IL-4, IL-10 and IL-13. Conclusions ICA exerts a certain degree of efficacy on the treatment of experimental IgA nephropathy through regulating NF-κBp65 and MCP-1 expression and the immunoregulation mechanism.

Icariin; IgA nephropathy; NF-κBp65; MCP-1; IL-4; IL-10; IL-13

張紅(1980-)，女，主治醫(yī)師，碩士，研究方向：腎病風(fēng)濕免疫方向。E-mail：nyzhanghong@126.com

研究報告

【文獻標(biāo)識碼】 A 【文章編號】1671-7856(2017) 01-0073-06

10.3969.j.issn.1671-7856.2017.01.015

2016-04-06