密閉微波輔助提取-HPLC法測定還亮草中硬飛燕草堿和巴比翠雀堿的含量

樊輕亞，郝艷紅，代春美

(1.信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)院， 河南 信陽 464000;2.信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)院， 河南 信陽 464000;3.中國中醫(yī)科學(xué)院，北京 100700)

密閉微波輔助提取-HPLC法測定還亮草中硬飛燕草堿和巴比翠雀堿的含量

樊輕亞1*，郝艷紅2，代春美3

(1.信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)院， 河南 信陽 464000;2.信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)院， 河南 信陽 464000;3.中國中醫(yī)科學(xué)院，北京 100700)

采用密閉微波輔助法(PMAE)提取還亮草中的硬飛燕草堿和巴比翠雀堿。采用單因素試驗結(jié)合正交試驗方法對微波實驗條件進行優(yōu)化。得到硬飛燕草堿和巴比翠雀堿的最佳提取方案：藥物顆粒度100目，固液比1∶60，微波溫度80 ℃，微波功率560 W，微波時間10 min。以甲醇-0.2%三乙胺(45∶55)為流動相，建立了高效液相色譜(HPLC)測定硬飛燕草堿和巴比翠雀堿含量的方法。硬飛燕草堿和巴比翠雀堿分別在0.50～50.0，0.30～30.0 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回收率為98.3%～104.5%，相對標準偏差(RSD)分別為2.0%和2.2%。與傳統(tǒng)溶劑回流法(SRE)進行比較，該方法簡單、提取率更高。

還亮草；密閉微波提??；硬飛燕草堿；巴比翠雀堿；正交試驗

還亮草(Delphinium anthriscifolium Hance)是毛茛科、翠雀屬多年生草本植物,分布于中國廣東、廣西、貴州、湖南、江西等地，有祛風(fēng)除濕、止痛活絡(luò)功效，用于治療風(fēng)濕痛、半身不遂、食積脹滿、咳嗽；外用于癰瘡癬疥[1]。藥用還亮草主要含有生物堿成分，另外還有固定油、類脂、苷類等成分。硬飛燕草堿和巴比翠雀堿是還亮草中含量較多的生物堿類成分。研究發(fā)現(xiàn)硬飛燕草堿有箭毒樣作用，并有神經(jīng)節(jié)阻斷作用，可用于肌緊張或運動過多癥，巴比翠雀堿則具有解痙作用，是治療急性菌痢、腸炎的有效成分[1]。

微波輔助提取技術(shù)以其加熱迅速、耗能低、操作時間短、溶劑耗量少、選擇性好、提取效率高等優(yōu)點受到廣泛重視[2-17]，目前主要有密閉式微波提取系統(tǒng)(PMAE)和聚焦微波提取系統(tǒng)(FMAE)。PMAE提取法是利用微波對置于密閉提取罐中的藥材和提取溶劑進行照射，使藥材在高溫高壓的環(huán)境下被提取,可同時處理多個樣品，提取快速、高效；FMAE是在常壓微波輻射下進行開放式提取，安全、樣品處理量大，但設(shè)備需改裝，受穿透能力限制，提取不均勻，提取時間長，且易導(dǎo)致?lián)]發(fā)性物質(zhì)損失。本文首次采用PMAE-高效液相色譜法測定還亮草中硬飛燕草堿和巴比翠雀堿的含量，通過單因素實驗對顆粒度、固液比、微波溫度、微波功率和微波時間等條件進行考察，進一步通過正交試驗的優(yōu)化得到最佳提取工藝，大大增加了提取率。該法避免了使用大量有機溶劑，不破壞環(huán)境，降低了污染，是生物堿類化合物有效的提取方法。

1 實驗部分

1.1 試驗藥材、試劑與儀器

巴比翠雀堿標準品、硬飛燕草堿標準品(成都普菲德生物技術(shù)有限公司，純度>98%)，還亮草藥材(產(chǎn)地：廣西)，甲醇、乙腈(色譜純，美國Merck 公司)，三乙胺、氨水、95%乙醇、鹽酸、氯仿(分析純，鄭州德眾化學(xué)試劑廠)，實驗用水為蒸餾水。

Agilent 1200高效液相色譜儀(美國安捷倫公司);B-260恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠);SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科貿(mào)有限公司);RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);KQ2200B超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司);TOPEX全能型微波化學(xué)工作平臺(上海屹堯微波化學(xué)有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 PMAE提取稱取一定量的還亮草藥材(100目)于提取罐中，按照1∶60的固液比加入95%乙醇后，置于密閉微波瓶中加熱提取(10 min，80 ℃)，提取液冷卻至室溫。

1.2.2 SRE提取稱取一定量的100目還亮草藥材于提取罐中，按照1∶60的固液比加入95%乙醇后置于水浴上(80 ℃，提取40 min)，提取液冷卻至室溫。

1.2.3 提取液的純化將提取液減壓抽濾，濾液旋干，用30 mL鹽酸溶液(pH 2.0)超聲溶解，傾出，置于分液漏斗，氯仿萃取后的水相用1%NaOH溶液調(diào)至pH 10.0，再用氯仿萃取3次，每次30 mL，收集氯仿層，旋干，用甲醇溶解、定容，HPLC含量待測。

1.2.4 HPLC測定條件色譜柱(Phenomenon Gemini C18柱，4.6 mm×250 mm，5 mm);流動相：甲醇-0.2%三乙胺(45∶55);檢測波長：254 nm；流速：1 mL/min；柱溫：室溫；進樣量：10 mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 藥材顆粒度和固液比的影響樣品顆粒度大小直接影響微波的穿透能力，從而影響微波加熱的速率和均勻性?？疾炝怂幉念w粒度(70,80,90,100,110目)對提取率的影響，結(jié)果表明，提取率隨著藥材顆粒度的增大而增加，當(dāng)樣品顆粒度為100目時提取率最高，繼續(xù)增大顆粒度時提取率反而降低。這是因為顆粒度太大時微波難以完全穿透樣品，破壁不完全；顆粒度太小時微波雖能完全穿透樣品，但由于相鄰細胞間的相互作用增強，細胞所受阻力增大，因而其內(nèi)部細胞被破壞的程度相對較小。而且實驗發(fā)現(xiàn)顆粒度太小時，微波照射時易出現(xiàn)焦化，會影響有效成分的提取。因此選擇樣品的最佳顆粒度為100目。

實驗還考察了固液比(1∶20～1∶60)對硬飛燕草堿及巴比翠雀堿的影響(圖1A)。結(jié)果表明，固液比為1∶60時有效成分的提取率最大，而固液比在1∶50和1∶60時提取率相差不大，說明物料已達到飽和，這可能是因為有效成分在溶劑中的溶解度一定，增加固液比相當(dāng)于增加了溶劑量，所以有效成分的溶解量會逐漸增加，直至達到飽和狀態(tài)，之后提取量基本保持恒定。

2.1.2 微波溫度、微波功率、微波時間的影響由于微波溫度較低不利于細胞膜內(nèi)有效成分的釋出，使之提取不完整，提取率降低，而過高的微波溫度又會使待測物質(zhì)不穩(wěn)定，造成有效成分的降解，并且燒焦藥材，提取率降低。本實驗考察了微波溫度(60～100 ℃)對硬飛燕草堿、巴比翠雀堿的影響，結(jié)果顯示，在80 ℃時硬飛燕草堿和巴比翠雀堿達到最大提取率，溫度過低或過高均會導(dǎo)致提取率降低。

考察了微波功率對兩種有效成分提取率的影響(圖1B)。結(jié)果表明，隨著微波功率的增加，提取率升高，但功率過高時，樣品因受熱過度而焦化，顆粒粘結(jié)，使得生物堿類成分更難被提取出，因而造成提取率下降。實驗選擇微波溫度80 ℃，微波功率560 W，此時可獲得最佳提取率。

微波時間主要取決于大部分有效成分釋放出的時間，時間過長，可能使已釋出的有效成分降解，時間過短則釋出不完全。實驗考察了不同微波時間(2～18 min)對硬飛燕草堿和巴比翠雀堿的影響。結(jié)果顯示，硬飛燕草堿和巴比翠雀堿在10 min時達到最大提取率，說明微波時間小于10 min時，有效成分未被完全提出，而微波時間大于10 min時，有效成分可能發(fā)生降解，導(dǎo)致提取率降低。因此選擇最佳微波時間為10 min。

表1 硬飛燕草堿、巴比翠雀堿的正交試驗因素水平表

2.2 正交試驗優(yōu)化萃取條件

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，由于微波溫度、微波功率、微波時間之間存在交互影響作用，所以選取微波溫度、微波功率、微波時間3個因素，以硬飛燕草堿和巴比翠雀堿的提取率為指標，L9(34)正交試驗設(shè)計見表1。實驗結(jié)果見表2～3。

表2 正交試驗設(shè)計及測定結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

由表2～3可見，在不同萃取條件下測得的還亮草中硬飛燕草堿、巴比翠雀堿的提取率相差很大，影響硬飛燕草堿和巴比翠雀堿提取率的因素主次順序為：B>C>A,即微波功率>微波時間>微波溫度，最佳萃取方案為A2B2C2，即微波溫度80 ℃，微波功率560 W，微波時間10 min。這是因為當(dāng)微波功率太低，輻射時間太短的情況下，產(chǎn)生的熱量少，細胞中局部過熱的現(xiàn)象不明顯，因而破壁效果差，以致硬飛燕草堿和巴比翠雀堿的提取率較低；而微波輻射時間太長，微波功率太高，還亮草樣品因受熱過度而焦化，樣品顆粒粘結(jié)，有效成分更難被提取出，因而造成提取率下降。

在最優(yōu)條件下，取3份藥材進行驗證，結(jié)果表明按照最佳方案A2B2C2萃取得到硬飛燕草堿的提取率可達913.35 μg/g，巴比翠雀堿可達706.32 μg/g，因此采用最優(yōu)條件A2B2C2提取還亮草中的硬飛燕草堿和巴比翠雀堿是可行的。

2.3 HPLC分析結(jié)果

采用HPLC法對硬飛燕草堿和巴比翠雀堿進行含量測定。分別取一定量的標準品及還亮草藥材的提取液，按HPLC條件進行分離，色譜圖如圖2所示。

由圖2可見，以甲醇-0.2%三乙胺(45∶55)作為流動相，在254 nm波長處檢測，硬飛燕草堿和巴比翠雀堿可以得到良好的分離，分離度(R)大于1.5，保留時間分別為20.65 min和30.37 min。

2.3.1 線性關(guān)系與檢出限取一定量的硬飛燕草堿和巴比翠雀堿混合標準溶液，分別配制成一系列濃度的硬飛燕草堿和巴比翠雀堿混合標準品，分別進樣10 μL，以其峰面積(A)對濃度(C，mg/L)繪制標準曲線；按3倍信噪比(S/N=3)計算檢出限，結(jié)果見表4。 由表4可知，硬飛燕草堿、巴比翠雀堿的線性范圍分別為0.50～50.0，0.30～30.0 mg/L，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，方法可滿足還亮草提取液中生物堿的測定要求。

表4 硬飛燕草堿、巴比翠雀堿的標準工作曲線、線性范圍與檢出限

2.3.2 精密度、穩(wěn)定性與重復(fù)性精密吸取供試品溶液10 μL，連續(xù)進樣5次，測得硬飛燕草堿、巴比翠雀堿的相對標準偏差(RSD)分別為0.9%和1.2%，表明儀器精密度良好；分別在溶液配制2，4，6，8，10，12 h后進樣，進行穩(wěn)定性試驗，測得硬飛燕草堿、巴比翠雀堿的RSD值分別為1.8%和1.2%，表明提取液中的硬飛燕草堿、巴比翠雀堿可在12 h內(nèi)保持穩(wěn)定。按本方法進行6次平行試驗，得硬飛燕草堿、巴比翠雀堿的RSD值為1.7%和1.9%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.3.3 加標回收試驗分別準確稱取藥材5份，加入一定量的900 μg/mL硬飛燕草堿和700 μg/mL巴比翠雀堿混合標準品，按“1.2.1”方法提取、預(yù)處理，計算硬飛燕草堿、巴比翠雀堿的回收率，結(jié)果見表5。硬飛燕草堿、巴比翠雀堿的回收率為98.3%～104.5%，RSD分別為2.0%和2.2%，方法的準確度及精密度滿足分析檢測的要求。

表5 硬飛燕草堿和巴比翠雀堿的加標回收率與相對標準偏差(n=3)

2.4 微波輔助提取法與溶劑回流提取法的比較

生物堿通常采用溶劑回流提取法(SRE)進行提取，因此本文采用SRE法的最佳提取方案“1.2.2”與密閉微波輔助提取法的最佳提取方法“1.2.1”對3批次還亮草進行比較研究，結(jié)果見表6。

表6 不同批次的提取分析結(jié)果(n=3)

由表6可知，采用SRE法提取還亮草中生物堿的提取率只有PMAE法的2/3，這表明不同的提取加熱方式對生物堿的提取率影響較大。傳統(tǒng)的SRE法在提取過程中首先是在大氣環(huán)境中加熱溶劑并溶脹樣品細胞，以熱傳導(dǎo)方式將熱能從溶劑傳遞到細胞內(nèi)部進行加熱。而PMAE法中95%乙醇是吸收微波的良好溶劑，與細胞內(nèi)的極性物質(zhì)共同吸收微波，并迅速轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮埽崛∪軇┘八幉谋谎杆僬w性的“體加熱”，且在具有攪拌裝置的密閉體系中，溶劑蒸汽有一定壓力，溶劑回流效果及傳熱效率高，提取率大大提高。由于PMAE的均勻加熱以及密閉微波裝置的電磁攪拌克服了傳統(tǒng)提取方式加熱不均勻的缺點，改善了提取的重現(xiàn)性。因此采用PMAE提取還亮草中生物堿，快速、高效，提取效率優(yōu)于傳統(tǒng)SRE提取方法。

3 結(jié) 論

本文考察了密閉微波輔助提取高效液相色譜測定還亮草中硬飛燕草堿和巴比翠雀堿含量的方法。該方法操作便捷，精密度高，準確度好，并能保護被提取物質(zhì)原有特性，能很好的提取出有效成分，避免使用大量有機溶劑，降低了污染，適應(yīng)于還亮草中有效成分的提取分析，對其他中藥材的分析具有一定的指導(dǎo)意義。

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Determination of Belsoline and Eldeline Contituents in Delphinium Anthriscifolium Hance by Microwave-assisted Extraction with HPLC

FAN Qing-ya1*, HAO Yan-hong2，DAI Chun-mei3

(1.College of Pharmacy,Vocational and Technical College School of Xinyang,Xinyang 464000,China；2.College of Medicine,Vocational and Technical College School of Xinyang,Xinyang 464000,China；3.China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100700,China)

A method of extraction of belsoline and eldeline in Delphinium anthriscifolium Hance was developed by pressurized microwave-assisted extraction(PMAE).The single factor test and orthogonal test were used to optimize the experimental conditions.The optimum extraction conditions were as follows:particle size:100 mesh,ratio of solid to liquid:1∶60,microwave temperature:80 ℃,microwave power:560 W,microwave time:10 min.Under the optimal conditions,belsoline and eldeline were separated,and determined by HPLC using methanol-0.2% triethylamine(45∶55) as mobile phase.The linear ranges of belsoline and eldeline were in the ranges of 0.50-50.0 mg/L and 0.30 -30.0 mg/L,respectively.The recoveries of belsoline and eldeline were in the range of 98.3%-104.5%,and RSDs were 2.0% and 2.2%,respectively.Compared with the solvent reflux extraction method(SRE) ,the proposed method was simple,and showed high extraction efficiencies.

Delphinium anthriscifolium Hance;pressurized microwave-assisted extraction;belsoline;eldeline;orthogonal test

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.01.018

2016-07-20；

2016-08-21

第24批中國博士后科技服務(wù)團合作項目

*通訊作者：樊輕亞，碩士，講師，研究方向：藥物提取分離及分析， Tel：0376-6281969，E-mail：fqy2006hn@163.com

O657.72；TQ460.72

A

1004-4957(2017)01-0106-06