水楊酸濃硫酸比色法測定滸苔中硝酸鹽含量

趙倩，石曉勇,3，陳月紅，王麗莎，唐洪杰*

(1.中國海洋大學 化學化工學院，山東 青島 266100；2.中國海洋大學 海洋化學理論與工程技術(shù)教育部重點實驗室，山東 青島 266100；國家海洋局海洋減災中心，北京 100194)

水楊酸濃硫酸比色法測定滸苔中硝酸鹽含量

趙倩1,2，石曉勇1,2,3，陳月紅1,2，王麗莎1,2，唐洪杰1,2*

(1.中國海洋大學 化學化工學院，山東 青島 266100；2.中國海洋大學 海洋化學理論與工程技術(shù)教育部重點實驗室，山東 青島 266100；國家海洋局海洋減災中心，北京 100194)

滸苔是我國綠潮的主要肇事物種，測定其體內(nèi)硝酸鹽含量對研究滸苔對硝酸鹽的同化和吸收有著重要意義。本文采用水楊酸濃硫酸比色法對滸苔體內(nèi)硝酸鹽含量進行了測定，并對該方法中樣品預處理、顯色劑使用量及工作曲線選擇等步驟進行了相應的探討及優(yōu)化，使其更適用于測定滸苔體內(nèi)的硝酸鹽含量，同時確定了該方法的檢出限、精確度和準確度。研究結(jié)果表明本文所確定的方法適用于滸苔樣品中硝酸鹽含量的快速測定。

滸苔；水楊酸濃硫酸比色；硝酸鹽

1 引言

自2007年以來，黃海海域每年都會暴發(fā)大規(guī)模綠潮災害，主要肇事物種為滸苔(Ulvaprolifera)[1—2]。滸苔綠潮暴發(fā)會改變生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)[3]，降低生物多樣性[4]，對海洋生態(tài)環(huán)境造成極大危害。氮作為浮游植物生命活動中不可缺少的營養(yǎng)元素，其代謝也是浮游植物營養(yǎng)代謝的重要部分[5—6]，對海洋植物生長繁殖有重要影響。而海水中的氮主要以NO3-N形態(tài)存在[7]，浮游植物的生長與其對硝酸鹽的同化和吸收能力密切相關(guān)。因此，測定滸苔體內(nèi)硝酸鹽的含量有利于滸苔對硝酸鹽同化過程的研究，可以為滸苔暴發(fā)防治措施的建立提供一定的理論依據(jù)。

目前，檢測植物體內(nèi)硝酸鹽濃度的方法主要有高效液相層析法[8—9]、離子色譜法[10—11]、液相色譜法[12]、分光光度測定法[13—14]、極譜法[15]、電位測定法[16]、毛細管電泳法[17]和酚二磺酸法[18]等。其中光譜法和色譜法都需將硝酸根離子經(jīng)鎘柱還原成亞硝酸根離子間接測定，前處理操作繁瑣，而應用較為廣泛的酚二磺酸法操作條件要求嚴格，耗時較長，不適宜大批量樣品的檢測。相比于上述其他方法，水楊酸濃硫酸比色法具有不需要復雜的前處理過程、準確性高等優(yōu)點，適用于快速測定植物體內(nèi)硝酸鹽含量，在測定蔬菜體內(nèi)硝酸鹽的含量方面得到了一定的應用[19]。該方法的原理是基于硝酸根與水楊酸在濃硫酸的作用下所生成的硝基水楊酸在堿性環(huán)境中會呈現(xiàn)黃色，并且一定濃度范圍內(nèi)，顏色深淺與硝酸鹽含量成正比[20]。因此，通過測定此黃色溶液在其最適波長(410 nm)下的吸光度，即可計算得到相應的硝酸鹽濃度。目前，已有研究者[21]將該方法應用于滸苔體內(nèi)硝酸鹽含量的測定，但在測定過程中，某些實驗條件的改變會直接影響到測定結(jié)果，為此，本文對該方法的測定條件進行了優(yōu)化，以確保其測定滸苔體內(nèi)硝酸鹽含量時的準確性和穩(wěn)定性。

2 材料與方法

2.1 主要儀器

UV2550紫外-可見分光光度計、分析天平、恒溫水浴鍋、移液槍等。

2.2 所用試劑

100 mg/L硝酸鹽標準溶液；4%醋酸鋅溶液；8%氫氧化鈉溶液；5%水楊酸濃硫酸(所用試劑均為優(yōu)級純)。

2.3 實驗材料及培養(yǎng)

本實驗選取黃海綠潮暴發(fā)區(qū)常見的綠潮肇事藻種滸苔(Ulvaprolifera)為研究對象。藻體取自蘇北紫菜養(yǎng)殖筏架區(qū)，現(xiàn)場用天然海水反復沖洗干凈，帶回陸地實驗室培養(yǎng)，挑選綠色健康藻體，在質(zhì)量分數(shù)0.2%的KI溶液中浸泡1 min[22]，用過濾滅菌的天然海水反復沖洗，暫養(yǎng)于溫度為(15±1)℃、光照強度283 μmol photons/(m2·s)、光照周期12L∶12D[23]的光照培養(yǎng)箱中。NaNO3和KH2PO4作為唯一的外加氮源和磷源，濃度分別為80 μmol/L和5 μmol/L，其余營養(yǎng)液等同于f/2配方，接種指數(shù)生長期的滸苔于上述培養(yǎng)基。實驗所用海水為天然海水，經(jīng)GF/F膜過濾后，蒸汽滅菌備用。

2.4 樣品預處理及測定

稱取約3 mg新鮮滸苔樣品于組織研磨器，加入1 mL 4% 醋酸鋅溶液將滸苔充分研磨，并用1 mL去離子水沖洗組織研磨器，將研磨液轉(zhuǎn)移至加有5 mg活性炭粉末的離心管中。然后將離心管置于70℃恒溫水浴中加熱30 min[21]，待冷卻至室溫，離心力為3 800×g的條件下離心10 min后，取上清液用于測定。

取0.4 mL上清液于10 mL比色管中，加入5%水楊酸濃硫酸溶液，室溫放置顯色25 min，用質(zhì)量分數(shù)8% NaOH溶液定容至10 mL，冷卻至室溫后，于最適波長410 nm下測定其吸光度。

2.5 檢測方法的改進

在使用水楊酸濃硫酸比色法進行滸苔體內(nèi)硝酸鹽含量測定時，樣品預處理方法、顯色劑用量、工作曲線的選擇等因素均會對測定結(jié)果產(chǎn)生一定程度的影響[24]，因此本文將對上述影響因素進行探討，進而確定適宜的實驗條件，并得到該方法的檢出限、準確度及精密度。

2.5.1 顯色劑-5%水楊酸濃硫酸體積的影響

按2.4節(jié)中的方法，取一定量上清液，加入5%水楊酸濃硫酸溶液，設(shè)定其體積范圍為0.2～0.6 mL，考察顯色劑體積對硝酸鹽含量測定的影響，以期獲得顯色劑的最佳用量，每個顯色劑體積設(shè)3組平行實驗。

2.5.2 工作曲線的選擇

在采用水楊酸濃硫酸比色法測定滸苔體內(nèi)硝酸鹽含量時，樣品的預處理過程可能會對硝酸鹽產(chǎn)生吸附，從而對結(jié)果的準確度產(chǎn)生影響。因此，本文分別采用未經(jīng)過及經(jīng)過2.4節(jié)中所述處理過程的硝酸鹽標準溶液來繪制標準曲線和工作曲線，以確定樣品的預處理方法是否會對樣品硝酸鹽含量的測定產(chǎn)生影響。同時選取5.035 mg/L、20.140 mg/L、25.175 mg/L的硝酸鹽溶液，按照2.4處理方法進行處理，測定其濃度，計算硝酸鹽的回收率。

2.5.3 檢出限及準確度、精密度的確定

取空白樣(即0.4 mL去離子水)按2.5.2小節(jié)中確定的工作曲線測定方法進行處理，測定樣品的A410，每組設(shè)20個平行樣，設(shè)置3組，確定其檢出限。

2.5.4 滸苔中硝酸鹽的提取效率

滸苔經(jīng)預處理后經(jīng)離心分離得到上清液和殘渣，將殘渣以去離子水進行洗滌、震蕩后離心取其上清液。分別測定兩份上清液中硝酸鹽含量，擬檢驗殘渣中是否有硝酸鹽殘留。共設(shè)置10組平行樣。

2.5.5 滸苔體內(nèi)硝酸鹽測定方法準確性驗證

為了驗證采用水楊酸濃硫酸比色法測定滸苔體內(nèi)硝酸鹽的準確性，本文對滸苔樣品進行加標回收試驗，即在滸苔樣品研磨液中加入一系列濃度梯度的硝酸鹽標準溶液(0～25 mg/L)，依據(jù)2.5.4小節(jié)中的操作，依次測定各組樣品上清液和離心后殘渣中硝酸鹽的濃度。其中，將上清液中的硝酸鹽濃度記為測定值1，將上清液和殘渣中的硝酸鹽濃度之和記為測定值2，分別計算每個標準濃度的硝酸鹽回收率，每個標準濃度設(shè)定3組平行實驗。

2.6 實際樣品測定

在滸苔的一個培養(yǎng)周期內(nèi)，每天定點取樣，按照2.4節(jié)所述對滸苔樣品進行預處理后，參照2.5確立的水楊酸濃硫酸比色法測定滸苔處理液中硝酸鹽的濃度，計算其體內(nèi)硝酸鹽的含量(單位為μg/g，以鮮質(zhì)量計)。每組實驗設(shè)置3個平行樣，所得數(shù)據(jù)以平均值±標準差(mean±SD)表示。具體計算公式如下：

(1)

式中，w代表滸苔體內(nèi)硝酸鹽的含量(μg/g，以濕質(zhì)量計)，co代表測定滸苔處理液中硝酸鹽濃度(mg/L)，v代表處理液的體積(mL)，M代表滸苔測定樣品的鮮質(zhì)量(g)。

3 結(jié)果與討論

3.1 顯色劑用量的確定

滸苔體內(nèi)硝酸鹽的提取液在加入顯色劑(5%水楊酸濃硫酸溶液)后，其在410 nm的吸光度(A410)隨著顯色劑用量的不同發(fā)生變化：當顯色劑體積范圍為0.2～0.5 mL時，實驗可正常顯色；而當顯色劑體積大于0.6 mL時，反應產(chǎn)物出現(xiàn)白色針狀物，干擾了A410的獲得。不同用量顯色劑對A410的影響結(jié)果見圖1。由圖1可知，顯色劑體積在0.2～0.4 mL時，隨著顯色劑用量的增大，A410值呈上升趨勢，并且在顯色劑的加入量為0.4 mL時，其A410值達到最大；之后，隨著顯色劑體積的加大，A410并未出現(xiàn)上升反而呈現(xiàn)下降趨勢。因此，在能正常顯色的范圍內(nèi)，當顯色劑體積為0.4 mL時，所得A410值最大，顯色效果最佳，故而可確定顯色劑的最適用量為0.4 mL。

圖1 不同顯色劑用量下的吸光度Fig.1 Absorbance vs dosage of reagent

3.2 工作曲線的選擇

未經(jīng)過處理和經(jīng)過處理的硝酸鹽標準溶液濃度和吸光度A410之間的關(guān)系如圖2所示。由圖2可知，當硝酸鹽濃度為3 mg/L左右時均存在較明顯的拐點，因此，將0～25.175 mg/L濃度范圍內(nèi)分為兩個濃度區(qū)間后，分別進行線性擬合(其中0～3 mg/L為低濃度范圍，3～ 25.175 mg/L為高濃度范圍)，得到圖2所示的兩組線性回歸方程。

擬合結(jié)果顯示，兩種方式所得線性回歸方程均存在著較好的相關(guān)性(r2>0.99)。為選取最適宜的校準曲線，分別取濃度為5.035 mg/L、20.140 mg/L和25.175 mg/L的硝酸鹽溶液，按照2.4處理方法處理后，進行濃度測定，計算硝酸鹽的回收率(表1)。由回收率結(jié)果可知，當硝酸鹽濃度為5.035 mg/L時，未處理組所得回收率很低，僅為47.21%±2.66%，而處理組計算所得的回收率可達94.50%±5.78%。推測其原因，可能是對滸苔進行預處理時，在采用活性炭吸附色素的過程中及在使用醋酸鋅沉淀滸苔體內(nèi)蛋白質(zhì)的過程中造成了部分硝酸鹽于活性炭或者蛋白質(zhì)沉淀上的附著，引起了硝酸鹽的損失。當以未處理組所得標準曲線進行硝酸鹽濃度測定時，預處理過程中硝酸鹽的損耗并未考慮在內(nèi)，故而使得所測得的結(jié)果產(chǎn)生了一定的偏差。當硝酸鹽濃度為20.140 mg/L和25.175 mg/L時，兩種方式均得到了較高的回收率，接近于100%，樣品的預處理過程幾乎未對測定結(jié)果帶來影響。由此可見，樣品預處理過程中由于吸附所產(chǎn)生的硝酸鹽損耗對高硝酸鹽含量樣品的測定結(jié)果影響較小，但當樣品中硝酸鹽含量較低時，所帶來的影響不可忽視?，F(xiàn)有的研究表明，滸苔經(jīng)處理后所得處理液的硝酸鹽濃度大多分布在本文所設(shè)硝酸鹽標準溶液的中低濃度范圍內(nèi)[21]，因此，為保證實驗結(jié)果的準確性，在后續(xù)實驗中應選擇對標準溶液進行相應預處理的標準曲線為工作曲線。

圖2 未經(jīng)處理(a)及經(jīng)過處理(b)的硝酸鹽標準溶液濃度和吸光度A410的關(guān)系Fig.2 Absorbance vs the concentration of untreated(a) and treated(b) nitrate standard solution

真實濃度/mg·L-1標準溶液未經(jīng)處理組標準溶液經(jīng)過處理組實測濃度/mg·L-1回收率/%實測濃度/mg·L-1回收率/%5.0352.377±0.13447.21±2.664.758±0.29294.50±5.7820.14021.733±0.747107.91±3.7120.994±0.733104.24±3.6425.17526.993±0.501107.22±1.9926.162±0.491103.92±1.95

3.3 方法的檢出限、精密度和準確度

3.3.1 檢出限

3組空白樣測定結(jié)果A410的平均值及標準偏差見表2。參考《儀器分析》[25]中關(guān)于檢出限的定義，qm=3SD/m(m-方法靈敏度)，得出其檢出限分別為0.373 mg/L、0.370 mg/L、0.362 mg/L，其均值為0.368 mg/L，該方法的檢出限低于文獻報道的滸苔體內(nèi)硝酸鹽最低濃度[21]。

表2 3組空白樣的A410及檢出限

3.3.2 準確度和精密度

表測定方法的準確度及精密度

綜上所述，該方法的檢出限、精密度和準確度均可滿足滸苔中硝酸鹽的測定。

3.4 硝酸鹽的提取效率

10組滸苔上清液和殘渣中硝酸鹽的檢出值顯示，上清液中硝酸鹽所占比例為73.92%±14.77%(范圍是43.08%～92.44%)，殘渣中硝酸鹽的比例可達26.08%±14.77%(范圍為7.56% ～56.92%)(如圖3所示)。由此可見，上清液和殘渣中硝酸鹽各自占總體比例的最大值與最小值相差49.36%，存在較大波動性。這說明雖然上清液中硝酸鹽所占比重總體高于殘渣所占比重，但殘渣中吸附和殘留的硝酸鹽仍不能忽略，并且由于二者硝酸鹽比例的波動范圍大，上清液中硝酸鹽含量也難以反映滸苔樣品中硝酸鹽的真實情況，因此，在實際測定時尚需將殘渣中硝酸鹽的含量考慮在內(nèi)。

圖3 滸苔上清液和殘渣中硝酸鹽占總體的比重Fig.3 The proportion of nitrate between supernatant and the residue in the whole Ulva prolifera

3.5 滸苔體內(nèi)硝酸鹽測定方法的準確性驗證

與2.5.4小節(jié)的實驗所得結(jié)果類似，對滸苔樣品的加標回收實驗結(jié)果顯示(表4)，當僅考慮樣品預處理后上清液中硝酸鹽含量時，所得硝酸鹽回收率為73.45%～96.59%，平均值為89.37%，標準偏差為6.58%，回收率較低，特別是當外加的硝酸鹽濃度較低時，所測結(jié)果明顯偏低，進一步提示僅以上清液中硝酸鹽含量不能完全表征滸苔中硝酸鹽的含量。結(jié)合3.4節(jié)所述的實驗結(jié)果，將滸苔處理后殘渣中硝酸鹽含量同時考慮在內(nèi)，此時硝酸鹽回收率可達到90.04%～102.28%，平均值可達97.80%，接近于100%，表明殘渣中含有一定量的硝酸鹽，且經(jīng)過一次再處理后基本提取完全，可以滿足滸苔體內(nèi)硝酸鹽測定的需要。將測定值1和測定值2進行顯著性差異分析，結(jié)果顯示測定值2的精密度明顯高于測定值1(F檢驗，α=0.05)；進一步的t檢驗(成對雙樣本均值分析)結(jié)果顯示，t>tα,f(tα,f查表可得，自由度f=9)，兩者在置信區(qū)間95%時存在顯著性差異。由上述分析可知，將殘渣中硝酸鹽含量兼顧在內(nèi)的方法的確優(yōu)于僅考慮上清液中硝酸鹽含量的方法。當外加硝酸鹽濃度較低(0～3 mg/L)時，對比測定值1和測定值2的結(jié)果可知，將殘渣中硝酸鹽含量計算在內(nèi)時，所得結(jié)果更加接近于真實濃度并且波動性相對較小(測量值1的平均值及標準偏差分別為85.45%、7.22%；測量值2的平均值和標準偏差分別為98.02、4.64%)，可得到較好的回收率。t檢驗結(jié)果也表明，當硝酸鹽外加濃度在0～3 mg/L時，測定值1和測定值2間差異顯著(t>tα,f，其中顯著性水平α=0.01，自由度f=4)。由于滸苔體內(nèi)硝酸鹽在測定時所得硝酸鹽濃度多出現(xiàn)在低濃度范圍內(nèi)，因此，考慮殘渣中硝酸鹽的量尤為重要。

綜上所述，在測定滸苔中硝酸鹽的含量時，為確保實驗結(jié)果真實有效，應分別測定上清液和殘渣中硝酸鹽的含量，并且對殘渣中的硝酸鹽經(jīng)過一次處理即可滿足實際測定需求。

表4 兩種處理方法的回收率實驗結(jié)果Tab.4 The result of recovery experiments under two treatment methods

表4 兩種處理方法的回收率實驗結(jié)果Tab.4 The result of recovery experiments under two treatment methods

樣品編號標準加入值/mg·L-1測定值1*/mg·L-1回收率/%測定值2*/mg·L-1回收率/%10.5040.438±0.14786.90±29.100.500±0.04499.21±8.7221.0070.875±0.19386.89±19.191.000±0.10799.30±10.6431.5111.313±0.39286.90±25.961.500±0.05899.27±3.8142.0141.875±0.42493.10±21.052.060±0.202102.28±10.0353.0212.219±0.48673.45±16.092.720±0.36390.04±12.0265.0354.594±0.33891.24±6.725.030±0.39299.90±7.7878.0567.781±1.00896.59±12.517.910±0.35298.19±4.38810.079.594±0.98995.27±9.8210.090±0.326100.20±3.23915.10514.031±0.61992.89±4.1014.341±0.68794.94±4.541025.17522.781±1.23590.49±4.9123.841±0.63994.70±2.53平均值89.37±6.5897.80±3.57低濃度平均值**85.45±7.2298.02±4.64RSD7.363.65

注：測定值1*為上清液中硝酸鹽濃度；測定值2*為上清液和殘渣中硝酸鹽含量之和；低濃度平均值**為添加濃度在0～3 mg/L的范圍時的平均值。

3.6 滸苔實際樣品的測定結(jié)果

實驗培養(yǎng)條件下(N濃度80 μmol/L, P濃度5 μmol/L;溫度：15℃)，滸苔一個生長周期內(nèi)硝酸鹽含量變化如圖4所示。實驗結(jié)果表明，無論是否將預處理過程中殘渣所含的硝酸鹽考慮在內(nèi)，滸苔體內(nèi)硝酸鹽含量的變化趨勢一致，即在培養(yǎng)實驗初始階段滸苔體內(nèi)硝酸鹽的含量最高，隨著培養(yǎng)時間的延長，硝酸鹽的含量迅速降低，當?shù)竭_滸苔培養(yǎng)中后期時，滸苔體內(nèi)硝酸鹽含量較低。但在研究滸苔對硝酸鹽的同化作用時，除了要得到滸苔體內(nèi)硝酸鹽含量的變化趨勢外，還需要得到準確的變化量。而當僅測定上清液中硝酸鹽含量時，所得實驗結(jié)果明顯偏低，特別是在滸苔培養(yǎng)初期滸苔體內(nèi)硝酸鹽快速消耗的階段(見表5)，這種偏差不容忽視。因此，在實際測定中應選用同時考慮上清液和殘渣中硝酸鹽含量的測定結(jié)果作為實驗最佳結(jié)果。

圖4 兩種處理方法下滸苔體內(nèi)硝酸鹽含量在一個培養(yǎng)周期中的變化Fig.4 Variation of nitrate contents of Ulvaprolifera dur-ing a culture cycle under two different treatment methods

4 實驗結(jié)論

本文探究了水楊酸濃硫酸比色法測定滸苔中硝酸鹽的條件，結(jié)論如下：

(1)經(jīng)探討可知制作校準曲線時，標準溶液需與樣品分析步驟進行完全相同的處理，即經(jīng)添加活性炭粉末、水浴加熱、冷卻等處理，消除實際測定過程中帶來的誤差。

表5 兩種處理方式下滸苔體內(nèi)硝酸鹽含量的變化

注：變化值以鮮質(zhì)量計；變化值1*為同時考慮上清液和殘渣中硝酸鹽含量時硝酸鹽含量的日變化值；變化值2**為僅考慮上清液中硝酸鹽含量時硝酸鹽含量的日變化值。

(2)確定了實驗影響因素顯色劑溶液的最佳用量為0.4 mL，該方法的檢出限是0.368 mg/L，且精密度和準確度較高，基本滿足大多數(shù)樣品的測定。

(3)通過外加標準實驗可知，滸苔殘渣中殘留一定量的硝酸鹽，對殘渣進行一次處理，可提高實驗結(jié)果準確性，滿足測定需求?；厥章式Y(jié)果表明，方法優(yōu)化后，回收率介于90.04%～102.28%之間，RSD為3.65%。因此，該方法對滸苔中硝酸鹽的測定是可行的，結(jié)果準確可靠。

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Salicylic acid-concentrated sulfuric acid colorimetry method for determination of nitrate content in Ulva prolifera

Zhao Qian1,2,Shi Xiaoyong1,2,3,Chen Yuehong1,2,Wang Lisha1,2,Tang Hongjie1,2

(1.CollegeofChemistryandChemicalEngineering,OceanUniversityofChina,Qingdao266100,China；2.KeyLaboratoryofMarineChemistryTheoryandTechnology,MinistryofEducation,OceanUniversityofChina,Qingdao266100,China；3.NationalMarineHazardMitigationService,Beijing100194,China)

Green-tide events occurred in the Yellow Sea successively in recent years. The marine macrophyteUlvaproliferais the dominant green-tide-forming seaweed. It is necessary to study the nitrogen contents in the algal tissue, which contributes to knowing the uptake and assimilation of nitrate byUlvaprolifera. In this study, the method of salicylic acid-concentrated sulfuric acid colorimetry was employed to investigate the nitrate contents inUlvaprolifera. The influenced factors, including sample pretreatment, the amount of chromogenic reagent addition and the selection of performance curve, were examined and optimized during the determinations. The detection limit, precision and accuracy of this method were also established simultaneously. Our results indicated that this method was applicable for the fast examination of the nitrate contents in the algal tissue.

Ulvaprolifera; salicylic acid-concentrated sulfuric acid colorimetry; nitrate

10.3969/j.issn.0253-4193.2017.02.011

2016-08-30；

2016-11-04。

黃渤海海洋動力環(huán)境和生態(tài)調(diào)查(2012FY112200)。

趙倩(1990—)，女，山東省萊西市人，從事海洋生態(tài)污染生態(tài)化學的研究。E-mail:zhqian0807@163.com

*通信作者：唐洪杰，女，副教授，主要研究海洋生態(tài)污染及生態(tài)化學。E-mail:thjie@ouc.edu.cn

Q945

A

0253-4193(2017)02-0112-08

趙倩，石曉勇，陳月紅，等. 水楊酸濃硫酸比色法測定滸苔中硝酸鹽含量[J].海洋學報，2017，39(2)：112—119,

Zhao Qian,Shi Xiaoyong,Chen Yuehong, et al. Salicylic acid-concentrated sulfuric acid colorimetry method for determination of nitrate content inUlvaprolifera[J]. Haiyang Xuebao，2017，39(2)：112—119, doi:10.3969/j.issn.0253-4193.2017.02.011