基于線粒體CO Ⅰ基因序列對中國海蛾螺科的分子系統(tǒng)學分析

張樹乾，張素萍*

(1. 中國科學院 海洋研究所，山東 青島266071)

基于線粒體CO Ⅰ基因序列對中國海蛾螺科的分子系統(tǒng)學分析

張樹乾1，張素萍1*

(1. 中國科學院 海洋研究所，山東 青島266071)

本研究利用18種蛾螺總科(Buccinoidea)動物的CO Ⅰ基因序列對中國海蛾螺科進行了科上和科內水平的分子系統(tǒng)學分析。在建立的系統(tǒng)發(fā)育樹中，蛾螺科種類聚成了4個明顯的分枝：第一枝包括側平肩螺(Japelionlatus)、朝鮮蛾螺(Buccinumkoreana)、黃海蛾螺(Buccinumyokomaruae)、皮氏蛾螺(Voluthapaperryi)、香螺(Neptuneacumingi)、小鼠脊蛾螺(Lirabuccinummusculus)以及褐線蛾螺(Japeuthriacingulata)；第二枝包括莫氏角亮螺(Antillophosmonsecourorum)和尖魚籃螺(Nassariaacuminata)；第三枝包括黑口甲蟲螺(Cantharusmelanostoma)和矛唇齒螺屬(Enginalanceolata)；第四枝包括褐管蛾螺(Siphonaliaspadicea)和長吻真螺(Euthrialubrica)。該結果與先前基于形態(tài)分析進行的亞科劃分基本一致。蛾螺科的單系性沒有得到支持，織紋螺科種類(Nassariusthachi、N.sinarus、N.euglyptus)插到蛾螺科系統(tǒng)樹中并與角亮螺屬(Antillophos)及魚籃螺屬(Nassaria)聚成一枝；東風螺科種類(Babyloniaareolata、B.spirata)和榧螺科種類(Olivamustelina)與褐線蛾螺(Japeuthriacingulata)聚成一枝。東風螺屬起初隸屬于蛾螺科，現(xiàn)已被移出并作為單獨的一科——東風螺科Babyloniidae，本研究確認了這一結論。魚籃螺屬(Nassaria)和角亮螺屬(Antillophos)與織紋螺屬(Nassarius)種類聚在一起，這與最近的分子研究得到的結果一致。

腹足綱；蛾螺科；系統(tǒng)發(fā)育；CO Ⅰ基因

1 引言

蛾螺科(Buccinidae)隸屬于軟體動物門(Mollusca)、腹足綱(Gastropoda)、新腹足目(Neogastropoda)。其種類繁多、形態(tài)多變，且分布廣泛，從熱帶海域到兩極地區(qū)、從海水到淡水、從潮間帶至數(shù)千米的海底深淵，都有它們的蹤跡。最早的蛾螺科化石種發(fā)現(xiàn)于下白堊紀時期(late Cretaceous)，因此被看作為新腹足目中最古老的類群。經(jīng)過漫長的適應輻射，蛾螺科已經(jīng)進化成為新腹足目中最成功的類群之一[1]。到目前為止，全世界共發(fā)現(xiàn)和報道蛾螺科種類1 500余種，隸屬于150屬[2]。

盡管關于蛾螺科種類的研究和報道可以追溯至林奈時期，但到目前為止，蛾螺科仍然缺乏穩(wěn)定、統(tǒng)一的分類系統(tǒng)，甚至在每個分類階元上都存在著爭議和混亂。一些學者認為，織紋螺科(Nassariidae)、細帶螺科(Fasciolariidae)及盔螺科(Melongenidae)與蛾螺科(Buccinidaes.s.)在解剖結構上非常相似，并沒有充分可靠的形態(tài)特征可以把它們分到科的水平上，因此將這幾個科看作蛾螺科(Buccinidaes.l.)的4個亞科[3—4]。而在最新的分類系統(tǒng)中，這4個亞科被看作4個獨立的科[2]。在科內水平上，蛾螺科種類各屬、種間的系統(tǒng)演化關系仍然不夠明確。Harasewych[5]認為，由于蛾螺科形態(tài)特征的復雜性，有接近200個種在分類上是不明確的。一些學者對蛾螺科進行了亞科水平上的劃分，如Vaught[6]根據(jù)貝殼的形態(tài)特征將蛾螺科分為4個亞科：Buccininae、Volutopsiinae、Photinae以及Pisaniinae；而Higo等[7]則認為蛾螺科應該分為10個亞科：Beringiinae、Volutopsiinae、Parancistrolepisinae、Ancistrolepisinae、Neptuneinae、Photinae、Siphonaliinae、Pisaniinae、Babyloniinae以及Buccininae。這些亞科的劃分主要依靠貝殼外部形態(tài)和齒舌結構，而貝殼表面的顏色、雕刻以及厴的形態(tài)，容易受到環(huán)境的影響，具有較大的不穩(wěn)定性；齒舌在不同的年齡、性別中存在著差異[8]。Cernohorsky[9]認為，齒舌在科內水平上并不能作為有效的分類依據(jù)。張樹乾和張素萍[10]通過觀察對比蛾螺科的齒舌后發(fā)現(xiàn)，蛾螺科種類的齒舌在各屬間存在著差異，可以作為區(qū)分屬和種的有效依據(jù)。

Kantor[11]認為魚籃螺屬Nassaria種類胃的外部形態(tài)與織紋螺種類相似，最近的分子研究表明，魚籃螺屬(Nassaria)和角亮螺屬(Antillophos)與織紋螺科種類聚在一起，而與其他蛾螺科種類具有相對較遠的親緣關系[12]。傳統(tǒng)上，東風螺屬(Babylonia)依據(jù)其貝殼特征被歸入在蛾螺科內，但相關的解剖和分子研究表明，東風螺種類與榧螺有更近的親緣關系，而與蛾螺科種類具有較遠的親緣關系[13—15]。

盡管分子生物學被越來越多地應用到腹足類的系統(tǒng)發(fā)育分析上，但關于蛾螺科的系統(tǒng)發(fā)育學研究仍然很少，且大多為一些區(qū)域性的研究[14—18]。本研究將利用18種蛾螺總科(Buccinoidea)動物的CO Ⅰ基因序列對中國海域分布的蛾螺科種類進行科上和科內水平的分子系統(tǒng)學分析。

2 材料和方法

本研究所用標本包括采自于中國海域的蛾螺科種類12屬13種、織紋螺科1屬3種、東風螺科1屬1種，共計22個個體，經(jīng)70%酒精固定，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。其余的基因序列來自GenBank(表1)。

2.1 DNA提取

切取蛾螺腹足肌肉約30 mg，使用TIANGEN海洋生物基因組DNA抽提試劑盒(北京，天根生化科技)提取基因組DNA，獲得的總DNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 PCR及測序

實驗所用的引物為Folmer等[19]所設計引物：LCO1490(F)：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’, HCO2198(R): 5’-TTAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。由華大基因公司合成。引物稀釋濃度為10 μmol/L，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR反應總體積為25 μL，其中模板DNA為50～80 ng，12.5 μL Taq Mix (北京康為世紀生物科技有限公司)，引物(10 μmol/L)各0.5 μL，雙蒸水加至總體積為25 μL。PCR反應程序為：95℃預變性3 min，95℃變性30 s，42～47℃退火30 s，72℃延伸1 min，共運行35個循環(huán)，最后70℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物直接送交華大基因公司完成純化、測序。

2.3 序列對比和對齊

利用MEGA 6.06軟件中的Clustal X對所選取的CO Ⅰ基因序列進行序列對比，輔以人工校對。利用MEGA計算各序列的堿基組成和基于Kimura 2-parameter法的各屬間、種間的遺傳距離[20]，并利用鄰接法(Neighbor-joining，NJ)和最大似然法(Maximum Likelihood method，ML)構建系統(tǒng)發(fā)育樹[21]，1 000次重復獲得自展檢驗值。

3 結果

3.1 堿基組成和遺傳距離

利用CO Ⅰ引物均擴增出一條亮帶，且?guī)鸵恢?，大小均?600 bp 左右，符合預定結果。測序后，共獲得CO Ⅰ基因片段22條。對研究所得的22條蛾螺總科種類線粒體CO Ⅰ基因片段與從GenBank下載所得的3條CO Ⅰ基因片段進行同源序列對齊和對比。保留序列長度為552～604 bp，序列無堿基插入和缺失。17條蛾螺科種類CO Ⅰ基因序列的平均堿基組成為：T：37.1%，C：17.7%，A：25.1%，G：20.1，A+T含量明顯高于G+C含量，這一結果符合其他腹足類線粒體CO Ⅰ基因序列堿基的組成特點[22—23]。3個朝鮮蛾螺(Buccinumkoreana)個體間的G+C含量無差別，2個黃海蛾螺(Buccinumyokomaruae)個體間的G+C含量分別為37.9%和38.1%；其他蛾螺種類的G+C含量為36.2%～44.1%，其中尖魚籃螺(Nassariaacuminata)的G+C含量最低，長吻蛾螺(Euthrialubrica)的G+C含量最高。在同源序列中，共有369個保守位點；235個變異位點，其中單突變子48個，簡約信息位點187個。變異為轉換和顛換，無插入和缺失。本研究中的堿基平均轉換/顛換值(Ts/Tv)為1.78，說明尚未達到突變飽和[20]。

通過對比遺傳距離表明，尖魚籃螺(Nassariaacuminata)的種內遺傳距離為0.022，朝鮮蛾螺(Buccinumkorena)的種內遺傳距離為0～0.011，黃海蛾螺(Buccinumyokomaruae)的種內遺傳距離為0.002；蛾螺科種類種間遺傳距離為0.009～0.256，其中莫氏角亮螺(Antillophosmonsecourorum)與尖魚籃螺(Nassariaacminata)之間的遺傳距離最小，而尖魚籃螺(Nassariaacuminata)與長吻真螺(Euthrialubrica)之間的遺傳距離最大。蛾螺科種類與織紋螺科種類之間的遺傳距離為0.162～0.268；蛾螺科種類與東風螺種類之間的遺傳距離為0.190～0.285；東風螺種類與榧螺種類之間的遺傳距離為0.197～0.227；東風螺種類與織紋螺種類之間的遺傳距離為0.185～0.216(表2)。

3.2 序列分析

以芋螺科種類Conussponsalis為外群，采用鄰接法(Neighbor-joining，NJ)和最大似然法(Maximum Likelihood method，ML)構建系統(tǒng)樹，兩種方法得到的結果基本一致(圖1，圖2)：蛾螺科的單系性沒有得到支持，織紋螺種類、東風螺種類和榧螺種類穿插到蛾螺科形成的枝序中，其中，3種織紋螺先與尖魚籃螺和角亮螺聚在一起，再與其他蛾螺科種類相聚合；東風螺先與伶鼬榧螺聚成一枝，再與其他蛾螺科種類相聚合；蛾螺科聚成4枝：第一枝包括朝鮮蛾螺(Buccinumkoreana)、黃海蛾螺(Buccinumyokomaruae)、皮氏蛾螺(Volutharpaperryi)、側平肩螺(Japelionlatus)、香螺(Neptuneacumingi)、小鼠脊蛾螺(Lirabuccinummuculus)和褐線蛾螺(Japeuthriacingulata)；第二枝包括莫氏角亮螺(Antillophosmonsecourorum)和尖魚籃螺(Nassariaacuminata)；第三枝包括黑口甲蟲螺(Cantharusmelanostoma)和矛唇齒螺(Enginalanceolata)；第四枝包括褐管蛾螺(Siphonaliaspadicea)和長吻蛾螺(Euthrialubrica)。

4 討論

4.1 (蛾螺亞科)蛾螺屬+渦螺屬+平肩螺屬+香螺屬+脊蛾螺屬+線蛾螺屬

本實驗中，香螺屬(Neptunea)種類和蛾螺屬(Buccinum)種類聚成一枝，盡管置信度較低(小于50%)。Powell[25]認為香螺屬(Neptunea)和蛾螺屬(Buccinum)屬于不同的亞科，香螺屬屬于香螺亞科(Neptuneinae)而蛾螺屬屬于蛾螺亞科(Buccininae)，因為兩者在厴和齒舌特別是厴的形態(tài)特征方面存在明顯的區(qū)別，香螺屬種類的厴為葉狀，核在頂端，而蛾螺屬種類的厴為橢圓形，核在中央或亞中央；Higo等[7]同樣認為蛾螺屬和香螺屬應分別歸入蛾螺亞科(Buccininae)和香螺亞科(Neptuneinae)中；Harasewych和Kantor[13]則認為，這兩者除了在食道盲囊(oesophageal caecum)和萊布林腺(gland of Leiblein)的發(fā)達程度略有不同外，其他方面均很相似，兩者應同屬于蛾螺亞科。Hayashi[14]基于線粒體16S rRNA基因片段構建系統(tǒng)發(fā)育樹后認為，這兩屬之間存在較近的親緣關系。本實驗支持了這一結論。本實驗中，皮氏蛾螺(Volutharpaperryi)和蛾螺屬種類聚在一起，且置信度較高(96%)。Smith[26]指出，皮氏蛾螺(Volutharpaperryi)軟體部分頭、觸角以及眼點的位置都與蛾螺屬種類非常地相似，說明兩者之間存在較近的親緣關系，本實驗支持了這一觀點。Vaught[6]將側平肩螺歸入蛾螺亞科中，張樹乾和張素萍[10]通過觀察側平肩螺的齒舌發(fā)現(xiàn)，其側齒和中央齒形態(tài)與蛾螺亞科其他種類很相似，兩者應該有較近的親緣關系，這一結論在本實驗中得到了驗證。小鼠脊蛾螺(Lirabuccinummuculus)的齒舌形態(tài)顯示[10]，其結構特征符合蛾螺亞科的齒舌形態(tài)，因而應歸入蛾螺亞科中。線蛾螺屬(Japeuthria)先與東風螺和榧螺聚在一起，再與其他的蛾螺亞科種類聚在一枝上。事實上，在去除東風螺和榧螺的情況下，線蛾螺屬會直接與香螺屬(Neptunea)聚在一起。褐線蛾螺(Japeuthriacingulata)的齒舌中央基板呈方形，后緣具6個齒尖，側齒具3個齒尖[10]，這些特征與其他蛾螺亞科種類特別是蛾螺屬(Buccinum)和香螺屬(Neptunea)的齒舌結構相似[27]。

4.2 (波特亞科)角亮螺屬+魚籃螺屬

在本實驗中，尖魚籃螺(Nassariaacuminata)先與莫氏角亮螺(Antillophosmonsecourorum)聚在一起，再跟3個織紋螺聚成一枝。Cernohorsky[27]指出波特亞科(Photinae)種類的中央齒基板呈拱形，后緣具3個齒尖，而側齒具2個齒尖。Cernohorsky[28]將魚籃螺屬(Nassaria)歸入波特亞科中，盡管魚籃螺屬種類的齒舌中央齒基板后緣具5～10個齒尖。Galindo等[12]甚至認為，角亮螺屬和魚籃螺屬應屬于織紋螺科(Nasariidae)而非蛾螺科Buccinidae。事實上，角亮螺屬最初歸在織紋螺科[29—30],它們的齒舌形態(tài)與織紋螺更為接近。解剖學方面，Adams[31]指出，角亮螺屬種類足部后端呈細絲狀，與織紋螺種類的足部形態(tài)近似；Kantor[11]通過觀察胃部形態(tài)后認為，魚籃螺屬種類胃的外部形態(tài)更接近織紋螺科而非蛾螺科。

4.3 (土產(chǎn)螺亞科)甲蟲螺屬+唇齒螺屬

本實驗中，黑口甲蟲螺與矛唇齒螺聚在一起，且置信度較高(63%)。Cernorsky[27]指出唇齒螺屬(Engina)與甲蟲螺屬(Cantharus)具有非常相似的外部形態(tài)結構，Vermeij[32]根據(jù)貝殼特別是殼口的形態(tài)將土產(chǎn)螺亞科劃分為3個類群：唇齒螺群(Engina-group)，土產(chǎn)螺群(Pisania-group)和甲蟲螺群(Cantharus-group)。本實驗得到的結果與Vermeij[32]得到的結果一致。

4.4 (管蛾螺亞科)管蛾螺屬+真螺屬

本實驗中，管蛾螺屬與真螺屬聚在一枝上，盡管置信度較低(小于50%)。 Powell[25]根據(jù)貝殼和齒舌的形態(tài)把管蛾螺屬(Siphonalia)歸入到Siphonaliinae中；Higo等[7]接受了這一觀點，但Vaught[6]將管蛾螺屬歸入到蛾螺亞科(Buccininae)中。Hayashi[14]利用16S rRNA構建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，管蛾螺屬沒有與蛾螺亞科種類聚在一枝上，且置信度較高，說明其與蛾螺亞科種類之間存在著較遠的親緣關系。本實驗支持了這一觀點，因此管蛾螺屬更傾向歸入于管蛾螺亞科中。

Vaught[6]將真螺屬(Euthria)歸到蛾螺亞科(Buccininae)中，而Higo等[7]將真螺屬作為土產(chǎn)螺亞科(Pisaniinae)下的一個屬。本實驗中，真螺屬種類既沒有與蛾螺亞科種類也沒有與土產(chǎn)螺亞科種類聚在一起，而是與管蛾螺亞科中的褐管蛾螺聚在一枝上。形態(tài)學方面，真螺屬與蛾螺亞科種類的貝殼形態(tài)和齒舌結構方面均存在明顯的區(qū)別，真螺屬種類的前水管溝很長，齒舌中央齒基板為三角鏟形，而蛾螺亞科種類的前水管溝寬短，齒舌中央齒基板為方形；真螺屬與土產(chǎn)螺亞科(Pisaniinae)亞科種類雖然在殼形上較為相似，但在齒舌結構上存在明顯的區(qū)別[10]；真螺屬種類與管蛾螺屬種類在貝類外形上較為相似(圖1)，且齒舌中央齒和側齒上均具3個齒尖。因此，建議將真螺屬歸入管蛾螺亞科中。

4.5 關于東風螺屬(Babylonia)和皮氏蛾螺的討論

Kuroda等[33]為東風螺屬(Babylonia)建立了東風螺亞科(Babyloniinae)，隸屬于蛾螺科(Buccinidae)。Harasewych和Kantor[13]通過研究發(fā)現(xiàn)，東風螺屬種類與蛾螺科其他種類存在明顯區(qū)別：東風螺屬種類具有不成對的附屬唾液腺(accessory salivary gland)，一些種類中還具有直腸腺(rectal gland)；齒舌中央齒基板外側邊緣具齒尖，且基板后緣的3個大齒尖聚集在中央位置。在根據(jù)分子數(shù)據(jù)建成的系統(tǒng)發(fā)育樹上，Harasewych和Kantor[13]發(fā)現(xiàn)東風螺屬首先與榧螺科種類聚在一起，然后才與蛾螺科相聚。根據(jù)這些證據(jù)，他們認為東風螺種類與蛾螺科種類具有較遠的親緣關系，因此將東風螺亞科提升到了科的水平上。本實驗中，兩個東風螺種類先與伶鼬榧螺聚在一起，其次才與蛾螺科種類相聚，支持了Harasewych和Kantor[13]的結論。

普通的皮氏蛾螺(見圖1E-H)軟體上通常具黑色花紋，作者于遼寧大連采得兩個標本(見圖1A-D)，與普通皮氏蛾螺螺在殼形上非常相似，但在其軟體上并不具黑色花紋或斑點、足寬大，前端為截形而非尖形。本研究中，其與普通的皮氏蛾螺聚在一起，置信度為100，且遺傳距離為0.013，處于種內水平。證明兩者為同一個種。

圖1 基于CO Ⅰ基因序列片段的系統(tǒng)樹(鄰接法). A-D. 皮氏蛾螺(不帶花紋)；E-H. 皮氏蛾螺(帶花紋)Fig.1 Phylogenetic tree based on CO Ⅰ gene sequences (neighbor-joining method). A-D. Volutharpa perryi (without black streak); E-H. Volutharpa perryi (with black streak)A, E. 外殼; B, F. 外殼和軟體; C, G. 足; D, H. 生殖器遠末端A, E. shell; B, F. shell with soft part; C, G. foot; D, H. distal end of penis

圖2 基于CO Ⅰ基因序列片段的系統(tǒng)樹(最大似然法)Fig.2 Phylogenetic tree based on CO Ⅰ gene sequences (maximum likelihood method)

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Molecular phylogeny of Buccinidae (Gastropoda, Neogastropoda) from China seas based on CO Ⅰ gene sequences

Zhang Shuqian1, Zhang Suping1

(1.InstituteofOceanology,ChineseAcademyofSciences,Qingdao266071,China)

The partial mitochondrial cytochrome oxidase Ⅰ gene (CO Ⅰ) sequences of 18 Buccinoidea species were employed to evaluate the phylogenetic relationships of the family Buccinidae at the intra- and suprafamilial level. Within the family, the buccinids formed four clades: Clade Ⅰ includesJapelionlatus,Buccinumkoreana,Buccinumyokomaruae,Voluthapaperryi,Neptuneacumingi,LirabuccinummusculusandJapeuthriacingulata；Clade Ⅱ includesAntillophosmonsecourorumandNassariaacuminata; Clade Ⅲ includesCantharusmelanostomaandEnginalanceolata; Clade Ⅳ includesSiphonaliaspadiceaandEuthrialubrica. This result generally agrees with the previous subfamilial assignments based on morphological data. The monophyly of Buccinidae was interrupted by insertion of Nassariids, Olivids and Babyloniids. Babyloniidae, previously considered as a subfamily of Buccinidae, is now treated as an independent family. The present study confirmed this assignment. The generaNassariaandAntillophosclustered together with nassariids closer than with other buccinids, indicating that they have very close relationship with Nassariidae, this result is consistent with that of recently published molecular study.

Gastropoda; Buccinidae; phylogeny; cytochrome oxidase Ⅰ gene

10.3969/j.issn.0253-4193.2017.02.008

2016-07-14；

2016-11-11。

國家自然科學基金項目(41376167)。

張樹乾(1984—)，男，河北省石家莊市人，助理研究員， 主要從事海洋貝類分類與系統(tǒng)演化研究。E-mail: zsqtaxon@qdio.ac.cn

*通信作者：張素萍，研究員，主要從事海洋貝類分類與系統(tǒng)演化研究。E-mail:museum@qdio.ac.cn

S917.4

A

0253-4193(2017)02-0086-10

張樹乾，張素萍. 基于線粒體CO Ⅰ基因序列對中國海蛾螺科的分子系統(tǒng)學分析[J].海洋學報，2017，39(2)：86—95,

Zhang Shuqian, Zhang Suping. Molecular phylogeny of Buccinidae (Gastropoda, Neogastropoda) from China seas based on CO Ⅰ gene sequences[J]. Haiyang Xuebao，2017，39(2)：86—95, doi:10.3969/j.issn.0253-4193.2017.02.008