牛糞堆肥中氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其與環(huán)境因子相關(guān)性研究

孫雪微,許修宏,孟慶欣,成利軍,張文浩,門夢(mèng)琪,許本姝,孫 瑜

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030)

牛糞堆肥中氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其與環(huán)境因子相關(guān)性研究

孫雪微,許修宏*,孟慶欣,成利軍,張文浩,門夢(mèng)琪,許本姝,孫 瑜

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030)

采用PCR-DGGE(聚合酶鏈反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳)和Real-time PCR技術(shù)，分析牛糞堆肥期間氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和數(shù)量的變化及其與理化因子的相關(guān)性。結(jié)果表明，在牛糞堆肥過程中氨氧化細(xì)菌數(shù)量變化范圍為1.62×106～3.80×107copies·g-1，在第14 d氨氧化細(xì)菌數(shù)量達(dá)到最高值；DGGE圖譜顯示，堆肥各個(gè)時(shí)期氨氧化細(xì)菌群落組成存在明顯的差異；Shannon指數(shù)隨著溫度的變化而變化，在第7 d達(dá)到最大值2.671 8；系統(tǒng)發(fā)育分析表明，氨氧化細(xì)菌均隸屬于β-變形菌綱不可培養(yǎng)的亞硝化螺菌屬Uncultured Nitrosospira sp.和不可培養(yǎng)的亞硝化單胞菌屬Uncultured Nitrosomonas sp.，其中與Uncultured Nitrosospira sp.相似性高的氨氧化細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)菌，占60%左右；冗余分析(Redundancy analysis，RDA)顯示，溫度和銨態(tài)氮等對(duì)氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響較大。研究表明在牛糞堆肥期間氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化，同時(shí)證實(shí)了氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化受堆肥理化因子的影響。

牛糞堆肥；PCR-DGGE；Real-time PCR；氨氧化細(xì)菌；冗余分析

隨著我國(guó)畜禽養(yǎng)殖業(yè)的大規(guī)模發(fā)展，畜禽糞便排放量也在逐年遞增，給環(huán)境帶了巨大的壓力[1]。好氧堆肥是一種對(duì)牛糞等有機(jī)固體廢棄物進(jìn)行資源化、無害化和穩(wěn)定化的經(jīng)濟(jì)高效的處理方法[2]。畜禽糞便經(jīng)堆肥處理后轉(zhuǎn)變成有機(jī)肥料，實(shí)現(xiàn)了資源再利用，但在堆肥過程中，往往伴隨著嚴(yán)重的氮素?fù)p失，一般損失量為初始總氮量的17%～76%[3]，既降低了堆肥產(chǎn)品的質(zhì)量，也會(huì)釋放臭氣和氮氧化物等氣體，對(duì)環(huán)境造成二次污染[4]。因此，控制堆肥過程氨氧化反應(yīng)造成的氮素?fù)p失，已成為提高堆肥質(zhì)量的重要途徑之一。

硝化作用作為全球氮循環(huán)最重要的環(huán)節(jié)之一，以亞硝酸鹽作為載體將氨鹽氧化成硝酸鹽[5]。由氨氧化細(xì)菌催化的氨氧化反應(yīng)是硝化作用的限速步驟，在全球氮素生物化學(xué)循環(huán)中起著重要的作用[6]。氨氧化細(xì)菌屬于專性化能自養(yǎng)的功能性微生物[7]，其驅(qū)動(dòng)的氨氧化反應(yīng)是通過氨單加氧酶(Ammonia monooxygenase，AMO)催化，編碼AMO基因來完成的[8]。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究也引起了國(guó)內(nèi)外研究者的關(guān)注，如Yamada等[9]在氨含量較高的牛糞堆肥中檢測(cè)到了氨氧化細(xì)菌群落的動(dòng)態(tài)變化，邱珊蓮等[10]在雞糞堆肥中發(fā)現(xiàn)氨氧化細(xì)菌占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位。但在堆肥領(lǐng)域中，氨氧化細(xì)菌的理論知識(shí)仍未完善，無法全面地對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐起到理論指導(dǎo)的作用，所以，將氨氧化細(xì)菌作為研究對(duì)象，研究其群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)演替及其與環(huán)境因子之間的相關(guān)性，對(duì)于揭示堆肥過程中氮素轉(zhuǎn)移與變化規(guī)律具有深遠(yuǎn)的意義。

本研究采用變性梯度凝膠電泳(Denaturing gra dient gel electrophoresis，DGGE)和Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)牛糞堆肥過程中氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化，同時(shí)采用冗余分析(Redundancy analy sis，RDA)方法分析氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與堆肥環(huán)境因子之間的相關(guān)性，來了解堆肥過程中氮素的轉(zhuǎn)移與轉(zhuǎn)化規(guī)律，為減少氮素?fù)p失提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 堆肥及樣品采集

堆肥材料由牛糞和水稻秸稈組成(表1)。牛糞源于哈爾濱幸福鄉(xiāng)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)，水稻秸稈源于哈爾濱市香坊區(qū)東北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地。將水稻秸稈截成5 cm左右，與牛糞按質(zhì)量1∶3.5的比例均勻混合，并調(diào)整水分含量為65%～70%，置于規(guī)格為50 cm×50 cm× 100 cm(長(zhǎng)×寬×高)的堆肥模擬容器中，每隔30 min通風(fēng)一次，采用上、中、下三點(diǎn)取樣方式，均勻混合，每次取樣后翻堆。堆肥過程共36 d，取樣時(shí)間為：原始樣品第1 d，升溫階段第2 d，高溫階段第3、4、7、11、14 d，腐熟階段第19、25、36 d，樣品編號(hào)分別為D1、D2、D3、D4、D7、D11、D14、D19、D25和D36。堆肥樣品分為兩份：一份在-4℃儲(chǔ)存，用于理化指標(biāo)的測(cè)定；另一份在-80℃儲(chǔ)存，用于DNA提取。

表1 堆肥材料的主要成分Table 1 Properties of raw materials for composting

1.2 理化指標(biāo)測(cè)定

用LNI-TUT325數(shù)字電子溫度計(jì)測(cè)定堆體上、中、下三個(gè)位置的溫度。堆肥樣品的pH采用鮑士旦[11]的農(nóng)化分析方法進(jìn)行測(cè)定。水溶性銨態(tài)氮和硝態(tài)氮以2 mol·L-1氯化鉀溶液浸提，采用連續(xù)流動(dòng)分析儀(AA3，德國(guó))測(cè)定其含量。堆肥潛在硝化能力(PAO)的測(cè)定采用He等[12]的研究方法進(jìn)行測(cè)定。稱取10 g堆肥樣品，置于100 mL 25 mg N·L-1NH4Cl緩沖液中，25℃，150 r·min-1恒溫?fù)u床振蕩24 h，每隔4 h取培養(yǎng)液一次，用連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定NO2-N的含量。全碳和全氮分別采用重鉻酸鉀容量法和凱氏定氮法[11]測(cè)定。

1.3 DNA提取和PCR擴(kuò)增

取堆肥樣品3～5 g，采用Liu等[13]的方法提取堆肥樣品的總DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用DNA純化試劑盒(Omega,美國(guó))純化回收DNA，再用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，于-20℃的冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴(kuò)增采用氨氧化細(xì)菌的16S rRNA特異性引物進(jìn)行巢式PCR(Nested PCR)擴(kuò)增，引物序列和反應(yīng)程序見表2。第一輪，反應(yīng)體系為25 μL，包含400 μmol·L-1dNTP 2.5 μL，10×PCR Buffer(含MgCl2)2.5 μL，引物對(duì)各0.2 μL(上游引物為CTO189fAB與CTO189fC按照 2∶1的比例混合，下游引物為CTO654r)[14]，Taq聚合酶0.3 μL，模板DNA 0.5 μL，添加無菌水調(diào)整終體積到25 μL。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為465 bp，將其稀釋100倍作為第二輪PCR反應(yīng)的DNA模板。第二輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件同上，引物選用細(xì)菌特異性引物338f-GC和518r[15]，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為234 bp。最后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

表2 PCR引物及反應(yīng)條件Table 2 Primer and reaction condition of PCR amplification

1.4 DGGE

使用Bio-Rad DCodeTMsystem(Bio-Rad，美國(guó))對(duì)氨氧化細(xì)菌的16S rRNA PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行DGGE分析，最適的變性梯度為30%～60%(100%的變性劑量中含有40%的去離子甲酰胺和7 mol·L-1尿素)，聚丙烯酰胺膠的濃度為8%[丙烯酰胺∶雙丙烯酰胺= 37.5∶1(m·V-1)]。電泳運(yùn)行條件：在1×TAE電泳緩沖液中，恒溫60℃，恒壓120 V，電泳12 h。電泳完成后，采用硝酸銀銀染法染色，拍照后將回收的優(yōu)勢(shì)DGGE條帶置于滅菌的1.5 mL離心管中并編號(hào)，加30 μL無菌水，-4℃保存過夜，采用引物338f和518r進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，將擴(kuò)增產(chǎn)物送測(cè)序公司完成測(cè)序。

1.5 Real-time PCR

Real-time PCR反應(yīng)采用 SYBY Green法，在CFX-96TMReal-Time PCR儀上進(jìn)行，采用的氨氧化細(xì)菌引物對(duì)為CTO189fAB、CTO189fC和CTO654r，反應(yīng)體系為20 μL，包含10 μL SYBR Premix Ex TaqⅡ、1.6 μL稀釋10倍的DNA模板以及上下游引物各0.8 μL，其余以6.8 μL無菌水補(bǔ)齊。Real-time反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃30 s；95℃5 s，60℃30 s共40個(gè)循環(huán)。RealtimePCR標(biāo)準(zhǔn)曲線通過特異性引物PCR擴(kuò)增DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，連接到PMD-18T載體上，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過藍(lán)白斑試驗(yàn)，利用引物M13F(5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′)和M13R(5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3′)篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒后，采用A260/A280核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定其濃度，以8倍稀釋梯度獲取氨氧化細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率和相關(guān)系數(shù)分別為99.9%和0.94。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Quantity One軟件(Bio-Rad，美國(guó))對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行分析，采用UPGAMA法進(jìn)行聚類分析。采用多樣性指數(shù)(H)，均勻度指數(shù)(E)和豐富度(S)來分析氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因的多樣性，計(jì)算公式如下：

式中：H為Shannon多樣性指數(shù)；E為均勻度指數(shù)；S為DGGE膠中條帶數(shù)目，即豐富度；Pi為第i條帶灰度占該樣品總灰度的比率[16]。

通過Blast程序?qū)⑺脙?yōu)勢(shì)條帶的序列與已知序列進(jìn)行比對(duì)，采用Mega 6.0軟件構(gòu)建氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹；采用Canoco 4.5軟件對(duì)堆肥樣品中氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子進(jìn)行冗余分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 堆肥過程中理化指標(biāo)的變化

理化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果見表3。隨著堆肥的發(fā)酵，微生物快速分解有機(jī)質(zhì)，釋放大量的熱量，使堆體溫度急劇上升，在第7 d堆體溫度達(dá)到最高溫度，并且溫度超過55℃的堆肥時(shí)間持續(xù)了11 d，殺死大量的病原菌，達(dá)到了基本堆肥的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[17]，堆體溫度在第14 d開始持續(xù)下降，且堆肥后期溫度接近室溫。在堆肥過程中，pH變化范圍為8.85～8.14，在第4 d達(dá)到最大值，一直處于弱堿性的狀態(tài)。在堆肥前期，含氮有機(jī)物快速降解，銨態(tài)氮大量積累，從而使堆體的pH值不斷上升，而在堆肥后期，銨態(tài)氮減少，堆體pH值開始下降[18]。C/N是評(píng)價(jià)堆肥腐熟度的一種方法，在整個(gè)堆肥過程中C/N持續(xù)下降，在堆肥結(jié)束時(shí)下降到19.6，據(jù)此可以認(rèn)為堆肥已達(dá)到腐熟標(biāo)準(zhǔn)[19]。

在堆肥過程中，銨態(tài)氮含量呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，因?yàn)樵诙逊食跗?，微生物氨化作用及礦化作用加速了氮素的分解，所以堆肥前期銨態(tài)氮含量不斷增多；而堆肥后期，由于部分銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮和氨氣揮發(fā)等原因，導(dǎo)致銨態(tài)氮含量下降[20]。硝態(tài)氮含量呈現(xiàn)波動(dòng)性上升的趨勢(shì)，含量增加速度緩慢，可能是由于過多的銨態(tài)氮和過高的溫度，在一定程度上抑制了微生物的活性，使硝態(tài)氮生成速度減緩[21]。PAO的變化范圍是33.0～94.5 ng N·g-1·h-1，在第7 d達(dá)到最大值。

表3 堆肥過程中理化性質(zhì)的變化Table 3 Changes in physic-chemical properties in composting

2.2 樣品總DNA的提取和PCR的擴(kuò)增

采用Liu等[13]的研究方法成功地提取了所用堆肥樣品的總DNA，其長(zhǎng)度約23 kb。將純化后的DNA作為進(jìn)行巢式PCR第一輪的模板，所有樣品均獲得了特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，其大小為465 bp左右，將其稀釋100倍作為第二輪PCR的DNA模板，均得到了234 bp左右的特異性片段。

2.3 氨氧化細(xì)菌豐度的分析

采用Real-time PCR技術(shù)對(duì)堆肥樣品進(jìn)行氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因的定量分析，獲得的氨氧化細(xì)菌基因豐度如圖1所示。在整個(gè)堆肥過程中，氨氧化細(xì)菌基因豐度較低，基因拷貝數(shù)的變化范圍為1.62× 106～3.8×107copies·g-1，在堆肥前期氨氧化細(xì)菌的基因拷貝數(shù)持續(xù)下降，第14 d達(dá)到最大值。氨氧化細(xì)菌基因豐度基本上都處于同一數(shù)量級(jí)，波動(dòng)范圍并不是特別大。這與Lu等[22]的研究結(jié)果一致，在淡水水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘中氨氧化細(xì)菌的基因豐度較低。隨著堆肥進(jìn)入發(fā)酵高溫期，氨氧化細(xì)菌基因拷貝數(shù)明顯降低。這可能與溫度影響有關(guān)，溫度過高，抑制了多數(shù)微生物的生長(zhǎng)繁殖，僅一些耐熱微生物在快速生長(zhǎng)，所以高溫期的氨氧化細(xì)菌相對(duì)較少[23]，而在堆肥第14 d，堆體溫度達(dá)到55℃，隨后進(jìn)入降溫階段，有利于微生物快速生長(zhǎng)，所以氨氧化細(xì)菌的基因拷貝數(shù)明顯增多。在本研究中高銨離子濃度可能是導(dǎo)致氨氧化細(xì)菌豐度低的另一個(gè)關(guān)鍵原因，隨著銨態(tài)氮的逐漸積累，在一定程度上抑制了氨氧化細(xì)菌的生長(zhǎng)，在堆肥后期受銨態(tài)氮濃度的影響，氨氧化細(xì)菌的生長(zhǎng)減緩，導(dǎo)致基因豐度下降[24]。這與Wuchter等[25]的研究結(jié)果一致，在海水中氨氧化微生物的基因豐度與銨態(tài)氮的濃度顯著負(fù)相關(guān)。

圖1 堆肥過程中氨氧化細(xì)菌的基因拷貝數(shù)Figure 1 amoA gene copy numbers per gram compost sample during composting

2.4 氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因群落多樣性的分析

采用氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因特異性引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE，得到的氨氧化細(xì)菌DGGE圖譜如圖2所示。圖譜中各個(gè)泳道的條帶有較大的差異，說明堆肥各時(shí)期氨氧化細(xì)菌的群落變化較劇烈。利用Quantity One軟件進(jìn)行數(shù)字化處理，聚類分析(圖3)結(jié)果也顯示了氨氧化細(xì)菌在堆肥過程中群落結(jié)構(gòu)存在明顯的差異，泳道3和8、6和10、5和7、4和9彼此聚合，相似性系數(shù)分別達(dá)49%、31%、46%和59%。這說明各泳道群落組成相似性較高，而泳道1和2并未與其他泳道聚為一類，表明進(jìn)入高溫期后氨氧化細(xì)菌的菌群組成發(fā)生了劇烈的變化。

圖2 牛糞堆肥中氨氧化細(xì)菌DGGE圖譜Figure 2 DGGE profile of ammonia oxidizing bacteria in cow manure composting

圖3 氨氧化細(xì)菌DGGE圖譜聚類分析Figure 3 Cluster analysis of DGGE profile of ammonia oxidizing bacteria in cow manure composting

通過Quantity One軟件計(jì)算出氨氧化細(xì)菌群落的多樣性指數(shù)、均勻度指數(shù)和豐富度指數(shù)(表4)，結(jié)果顯示，均勻度指數(shù)變化不大，但多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)出現(xiàn)了明顯的改變。隨著堆肥的進(jìn)行，氨氧化細(xì)菌的多樣性指數(shù)呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，在第7 d達(dá)到最大值2.671 8。這可能是因?yàn)樵诙逊是捌?，銨態(tài)氮等硝化作用底物含量充足，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，利于氨氧化細(xì)菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致多樣性指數(shù)上升；而隨著堆肥的不斷發(fā)酵、溫度的升高和銨態(tài)氮濃度的下降，部分氨氧化細(xì)菌的生長(zhǎng)受到了影響而被淘汰，使多樣性指數(shù)逐漸減小[26]。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

氨氧化細(xì)菌DGGE圖譜優(yōu)勢(shì)條帶切膠測(cè)序比對(duì)結(jié)果見表5。序列比對(duì)結(jié)果表明，大多數(shù)序列與不可培養(yǎng)的亞硝化螺菌屬Uncultured Nitrosospira sp.和不可培養(yǎng)的亞硝化單胞菌屬Uncultured Nitrosomonas sp.這兩個(gè)屬的細(xì)菌相似度較高，在90%～100%之間，其中，與Uncultured Nitrosospira sp.相似度高的氨氧化細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)菌，約占60%，而Uncultured Nitrosomonas sp.菌群約占40%。由所獲得優(yōu)勢(shì)菌序列構(gòu)建的氨氧化細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4。由圖可知，氨氧化細(xì)菌序列被劃分成Uncultured Nitrosospira sp.和Uncultured Nitrosomonas sp.兩大分支，其中Uncultured Nitrosospira sp.分支占優(yōu)勢(shì)。

表4 堆肥過程中氨氧化細(xì)菌Shannon指數(shù)、均勻度指數(shù)和豐富度指數(shù)的變化Table 4 Changes in Shannon，evenness and richness index of ammonia oxidizing bacteria in composting

表5 DGGE優(yōu)勢(shì)條帶序列比對(duì)結(jié)果Table 5 Results of BLAST analysis on the sequences of dominant DGGE bands

通過氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹分析可知，在牛糞堆肥過程中氨氧化細(xì)菌都隸屬于β-變形菌綱，多數(shù)序列與Uncultured Nitrosospira sp.和Uncultured Nitrosomonas sp.的相似度較高。這與虞泳等[27]研究結(jié)果一致，在農(nóng)業(yè)好氧堆肥中也發(fā)現(xiàn)了Nitrosomonas sp.和Nitrosospira sp.優(yōu)勢(shì)菌群。由此推測(cè)，在堆肥過程中氨氧化細(xì)菌主要是Nitrosomonas sp.和Nitrosospirasp.菌。在本研究中，以Nitrosospira sp.屬的氨氧化細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)菌群，可能是由于高濃度的銨態(tài)氮含量所引起的。Enwall等[28]的研究結(jié)果表明，在銨態(tài)氮濃度較高的條件下，Nitrosospira sp.菌生長(zhǎng)更為旺盛。

圖4 牛糞堆肥中氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 4 Phylogenetic tree of ammonia oxidizing bacteria based on 16S rRNA gene in cow manure composting

2.6 氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與堆肥環(huán)境因子的冗余分析

采用冗余分析方法分析堆肥過程中氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化與理化因子的相關(guān)性，結(jié)果見圖5。二維排序軸的前兩個(gè)排序軸分別解釋了種群與環(huán)境的積累變化率為79.2%和24.4%。在二維排序圖中，箭頭連線的長(zhǎng)短表示群落與該環(huán)境因子之間相關(guān)系數(shù)的大小，箭頭連線與排序軸的夾角表示該環(huán)境因子與排序軸相關(guān)性的大小，夾角越大，其相關(guān)性越小[29]。硝態(tài)氮和PAO箭頭連線較長(zhǎng)，銨態(tài)氮、C/N、溫度和pH的箭頭連線較短，所以要據(jù)箭頭連線的長(zhǎng)度可知，環(huán)境因子對(duì)氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響的相關(guān)性大小順序?yàn)镻AO>硝態(tài)氮>銨態(tài)氮>C/N>溫度>pH。從圖中也可以看到，隨著堆肥的進(jìn)行，氨氧化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)變化顯著，在升溫階段(day2和day3)，氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較為相似，而在高溫階段與降溫階段，氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)劇烈變化。

通過冗余分析可知，溫度、PAO、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和pH對(duì)氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響較大，基于手動(dòng)選擇的冗余分析表明溫度和銨態(tài)氮的影響較為顯著(P<0.05)，這與Zhang等[30]研究結(jié)果相似，即環(huán)境因子顯著影響著氨氧化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)變化。溫度能夠影響氨氧化細(xì)菌的生長(zhǎng)速度、酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)以及化合物的溶解度等[31]，會(huì)對(duì)氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯的影響。在本研究的堆肥體系中，隨著溫度的升高，氨氧化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化，表明氨氧化細(xì)菌對(duì)溫度的適應(yīng)情況各不相同，僅部分耐高溫氨氧化細(xì)菌存活。這與Yamamoto等[32]的研究結(jié)果一致，即在堆肥高溫期氨氧化細(xì)菌是唯一的耐熱硝化細(xì)菌。

圖5 氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的冗余分析(RDA)Figure 5 Redundancy analysis(RDA)of ammonia oxidizing bacterial community structure during composting

銨態(tài)氮作為氨氧化反應(yīng)的直接底物，其濃度與氨氧化細(xì)菌的數(shù)量與種類有直接關(guān)系[33]。宋亞娜等[34]的研究指出，提高銨濃度可以促進(jìn)間作土氨氧化細(xì)菌的生長(zhǎng)，對(duì)氨氧化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性產(chǎn)生影響。在本研究中，堆肥前期銨態(tài)氮不斷積累，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，氨氧化細(xì)菌生長(zhǎng)旺盛，而在堆肥后期，由于銨態(tài)氮濃度逐漸下降，氨氧化細(xì)菌因底物濃度減小而衰退，表明銨態(tài)氮對(duì)氨氧化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)的變化有十分顯著的影響。

3 結(jié)論

(1)堆肥樣品氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因豐度的變化范圍是1.62×106～3.80×107copies·g-1，在第14 d氨氧化細(xì)菌的基因拷貝數(shù)達(dá)到最大值。

(2)不同時(shí)期堆肥樣品氨氧化細(xì)菌多樣性指數(shù)存在明顯的差異，隨溫度達(dá)到最高值，氨氧化細(xì)菌的多樣性指數(shù)也達(dá)到最大。

(3)通過序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析可知，氨氧化細(xì)菌均隸屬于β-變形菌綱，多數(shù)序列與Uncultured Nitrosospira sp.和Uncultured Nitrosomonas sp.屬的細(xì)菌相似度較高，與Uncultured Nitrosospira sp.屬相似度高的氨氧化細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)菌。

(4)冗余分析表明，堆肥環(huán)境因子對(duì)氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響顯著，其相關(guān)性大小為PAO>硝態(tài)氮>銨態(tài)氮>C/N>溫度>pH，其中溫度和銨態(tài)氮對(duì)氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響更為顯著。

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Research of ammonia oxidizing bacterial community structure and its correlation with environmental factors in cow manure composting

SUN Xue-wei,XU Xiu-hong*,MENG Qing-xin,CHENG Li-jun,ZHANG Wen-hao,MEN Meng-qi,XU Ben-shu,SUN Yu (College of Resources and Environment,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

The dynamic succession of ammonia oxidizing bacterial community structure and quantity were investigated using PCR-DGGE (polymerase chain reaction and denaturing gradient gel electrophoresis)and real-time PCR,the correlations between ammonia oxidizing bacterial community structure and physic-chemical factors were evaluated using redundancy analysis(RDA)in cow manure composting. The results showed that during composting the range of ammonia oxidizing bacteria were 1.62×106～3.8×107copies·g-1,the amount of ammonia oxidizing bacteria reached the peak on 14 day;DGGE profile analysis showed that the community composition of ammonia oxidizing bacteria obviously varied in different periods of composting.Shannon index of ammonia oxidizing bacteria changed with composting temperature,reaching the maximum(2.671 8)on the 7th day.Phylogenetic analysis showed that ammonia oxidizing bacteria were clustered into two groups,Uncultured Nitrosomonas sp.and Uncultured Nitrosospira sp.,which belonged to the β-Proteobacteria.the Uncultured Nitrosospira sp.which accounted for about 60%of ammonia oxidizing bacteria were predominant.RDA showed that ammonia and temperature(P<0.05) effected significantly on the community structure of ammonia oxidizing bacteria.Significant changes of ammonia oxidizing bacterial community structure occurred in cow manure composting,and it is confirmed that the changes of ammonia oxidizing bacterial community structure were affected by environmental factors.

cow manure composting;PCR-DGGE;Real-time PCR;ammonia oxidizing bacteria;redundancy analysis

X713

A

1672-2043(2017)01-0189-09

10.11654/jaes.2016-0960

2016-07-25

孫雪微(1991—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)。E-mail：910236195@qq.com

*通信作者：許修宏 E-mail：xuxiuhong@neau.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31372351，31672469)

Project supported：T卜e National Natural Science Foundation of C卜ina(31372351，31672469)

孫雪微，許修宏，孟慶欣，等.牛糞堆肥中氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其與環(huán)境因子相關(guān)性研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2017,36(1)：189-197.

SUN Xue-wei,XU Xiu-hong,MENG Qing-xin,et al.Research of ammonia oxidizing bacterial community structure and its correlation with environmental factors in cow manure composting[J].Journal of Agro-Environment Science,2017,36(1):189-197.