丁苯酞對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞凋亡的保護作用及機制

趙素晨 吳慶文 程月發(fā) 賈玉鳳 陳 娟 閆春林

(華北理工大學護理與康復學院，河北 唐山 063000)

丁苯酞對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞凋亡的保護作用及機制

趙素晨1吳慶文 程月發(fā)2賈玉鳳 陳 娟 閆春林

(華北理工大學護理與康復學院，河北 唐山 063000)

目的 探討丁苯酞對1-甲基-4-苯基-吡啶離子(MPP+)誘導的人體神經母細胞瘤(SH-SY5Y)細胞凋亡途徑的保護作用及其機制。方法 體外培養(yǎng)SH-SY5Y細胞，建立MPP+誘導的SH-SY5Y細胞凋亡模型。應用噻唑藍(MTT)比色法檢測不同劑量丁苯酞對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞存活率的影響；篩選出丁苯酞的最佳作用濃度；Annexin-V/PI流式細胞分析術檢測細胞凋亡率；倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化；Western印跡法檢測線粒體相關凋亡蛋白P53、Bcl-2、Bax的表達。結果 丁苯酞預處理的細胞比單純MPP+處理的細胞存活率增加(P<0.05)，且呈一定的劑量依賴性；丁苯酞可以降低MPP+誘導的SH-SY5Y細胞的凋亡率(P<0.05)。丁苯酞下調P53、Bax蛋白的表達，上調Bcl-2蛋白的表達(P<0.05)。結論 丁苯酞對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞損傷具有一定的保護作用，其機制可能是調節(jié)P53、Bcl-2、Bax的表達，抑制細胞凋亡的發(fā)生。

丁苯酞；帕金森?。籗H-SY5Y細胞；凋亡

帕金森病(PD)主要病理改變是黑質致密部多巴胺能神經元變性缺失和紋狀體多巴胺含量顯著減少，而多巴胺神經元廣泛的缺失是形成障礙的最重要原因〔1〕。現行藥物只能緩解疾病癥狀并不能徹底阻止疾病發(fā)展〔2〕。中藥在治療PD病方面具有臨床應用經驗豐富、作用途經靶點多、副作用小等潛在優(yōu)點，在臨床上的應用越來越廣泛，從中藥中獲取活性成分成為尋求預防和治療PD的重要途徑〔3〕。丁苯酞為脂溶性的藥物，可以直接通過血腦屏障發(fā)揮作用，重構缺血區(qū)微循環(huán)，保護線粒體免受損傷，改善能量代謝〔4～7〕。本實驗應用丁苯酞對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞進行預處理，觀察對線粒體凋亡通路相關蛋白P53、Bcl-2、Bax表達變化。

1 材料與方法

1.1 細胞株、藥物、試劑及儀器 SH-SY5Y細胞株購自中國科學院昆明細胞庫。丁苯酞購于中國食品藥品檢定研究院。MPP+、MTT、Annexin-V/PI試劑盒均購于Sigma公司；DMEM/F12=1∶1培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清(FBS)購于Gibco公司；GAPDH抗體(華安生物技術有限公司)，P53、Bcl-2、Bax抗體(巴傲得生物科技有限公司)。CO2培養(yǎng)箱、酶標儀(意大利Bio-Rad公司)，倒置相差顯微鏡(Olympus公司)，流式細胞儀(FACS Calibuar，BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 SH-SY5Y細胞接種于培養(yǎng)瓶中，DMEM/F12培養(yǎng)基(含10%的胎牛血清，青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。實驗分為對照組，模型組，丁苯酞組。

1.2.2 MTT比色法檢測細胞存活率 以每孔(1～5)×104個/ ml的活細胞懸液100 μl接種于96孔板中，不同劑量(1、10、20、100 μmol/L)丁苯酞預先處理2 h后加入1 mmol/L MPP+繼續(xù)培養(yǎng)24 h后各組分別加入50 mg/ml的MTT 15 μl繼續(xù)孵育3 h，吸去培養(yǎng)基，加入150 μl的DMSO，搖床10 min，酶標儀490 nm波長檢測吸光度值(OD值)，計算細胞生長抑制率，實驗重復3次。

1.2.3 Annexin-V/PI染色檢測細胞凋亡 以每孔(2～5)×105個/ml的密度接種于6孔板中，用最佳濃度丁苯酞預先作用2 h后加入1 mmol/L的MPP+繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，胰酶消化，收集細胞，PBS清洗，加入400 μl Annexin V-FITC結合液重懸細胞后，加入5 μl Annexin V-FITC，室溫避光孵育15 min，加10 μl的PI染色液混勻，室溫避光孵育5 min，隨即進行流式細胞儀檢測分析。以上實驗重復3次。

1.2.4 Western印跡法檢測凋亡相關蛋白的表達情況 細胞干預情況同上，每孔加入60 μl裂解液，用細胞刮刮掉細胞，放入EP管中，超聲打碎，離心，取上清。用BCA試劑盒檢測樣品濃度進行蛋白定量。蛋白變性，SDS-PAGE電泳，采用濕轉轉膜，5%牛奶封閉1 h，一抗4℃搖床過夜，TBST洗3次，每次5 min，二抗37℃孵育1 h，TBST洗3次，ECL顯色，用ImageJ軟件對結果進行分析。以上實驗重復3次。

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1 丁苯酞對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞存活率的影響 模型組〔(39.50±4.05)%〕與對照組〔(100.08±0.00)%〕比較，細胞相對存活率明顯降低(P<0.05)，而給予1、10、20、100 μmol/L丁苯酞預處理后的細胞存活率高于模型組，相對存活率分別為(56.76±3.70)%、(74.00±6.24)%、(81.47±7.45)%、(78.93±1.21)%(P<0.05)，丁苯酞濃度為20 μmol/L時，細胞存活率最高，為最佳濃度。后續(xù)研究選擇20 μmol/L丁苯酞作為治療劑量。

2.2 細胞形態(tài)學的改變 模型組細胞大部分變圓，突起結構減少，貼壁細胞數目減少，丁苯酞預處理組，亦有變圓的現象，但比模型組貼壁細胞增多，細胞間的突起聯系增多且細胞形態(tài)逐漸接近對照組，見圖1。

2.3 細胞凋亡率的變化 模型組與對照組相比凋亡率明顯升高〔(30.04±2.14)% vs (8.72±0.99)%，P<0.05〕，丁苯酞組與模型組相比，凋亡率明顯下降〔(16.84±0.54)%，P<0.05〕。

2.4 Western印跡法檢測P53、Bcl-2、Bax蛋白的表達 模型組P53、Bax蛋白的表達量較對照組明顯升高(P<0.05)，丁苯酞組P53、Bax蛋白的表達量較模型組明顯降低(P<0.05)；模型組Bcl-2蛋白表達量較對照組明顯降低(P<0.05)，丁苯酞組Bcl-2蛋白表達較模型組明顯升高(P<0.05)，見圖2，表1。

圖1 各組細胞形態(tài)學的變化(HE，×400)

圖2 Western印跡法檢測凋亡相關蛋白的變化

組別P53Bcl?2Bax對照組050±0041)084±0001)055±0011)模型組082±001045±000089±003丁苯酞組060±0031)075±0021)067±0021)

與模型組比較：1)P<0.05

3 討 論

PD主要病理變化為中腦黑質致密部多巴胺神經元的大量缺失，從而導致基底節(jié)功能性減退〔8，9〕。在PD的發(fā)生發(fā)展進程中，細胞凋亡是重要的病理性過程，與其相關的細胞信號轉導因子包括死亡受體、Bcl-2家族、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶、鈣激活酶、周期素依賴性激酶5、p53、聚腺苷酸二磷酸核糖轉移酶-1等〔10～12〕。目前認為關于細胞凋亡過程中信號轉導系統主要通路有兩條：膜受體通路和線粒體通路。線粒體途徑在細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，丁苯酞可有效提高線粒體膜流動性，增加神經細胞線粒體ATP酶活性，穩(wěn)定線粒體膜及增加線粒體ComplexⅣ的活性〔13〕。丁苯酞治療PD的臨床實踐已有相關報道，張霞萍等〔14〕研究發(fā)現，丁苯酞對中晚期PD患者治療中出現運動波動等并發(fā)癥及非運動癥狀有一定療效。劉建國等〔15〕通過對4例臨床病例的觀察發(fā)現，丁苯酞對神經變性疾病及神經遺傳疾病有治療作用，可能是通過改善線粒體功能而發(fā)揮作用。賈敏等〔16〕通過魚藤酮誘導SH-SY5Y細胞，用丁苯酞預處理過的SH-SY5Y細胞，其細胞形態(tài)的變化小，活性下降程度輕，線粒體膜電位降低幅度小，表明丁苯酞可能有抑制細胞凋亡效應，從而發(fā)揮其神經保護作用。

本研究顯示，丁苯酞預處理的細胞存活率明顯高于單獨MPP+誘導的細胞，在一定范圍內，隨丁苯酞濃度的升高，細胞存活率逐漸升高，當濃度達到一定值時，細胞存活率反而有所下降，可能是由于藥物濃度過大，對細胞產生了毒性作用。丁苯酞預處理可以抑制MPP+誘導的細胞凋亡，降低細胞凋亡率，對細胞起到保護作用，這與賈敏等〔16〕的研究結果相一致。

細胞凋亡機制中，P53基因是一種重要的促凋亡基因，由P53介導的凋亡途徑主要包括兩條〔17〕：一條是P53對外源性凋亡途徑的調節(jié)，主要通過激活位于血漿膜的死亡受體如Fas、DR4、DR5等促進細胞凋亡。另一條是P53對內源性凋亡途徑的調節(jié)，主要通過線粒體調控，由于此凋亡途徑中Bcl-2蛋白和線粒體腺苷酸三磷酸酶蛋白的變化依賴P53的調控，因此又稱為P53介導的線粒體依賴凋亡途徑。其中在P53調控凋亡相關基因的轉錄中，Bcl-2蛋白家族成員中Bax是P53調控的重要靶基因之一。Bax作為P53的下游調控基因，被P53蛋白激活轉錄，從而Bax蛋白表達比例上調而Bcl-2蛋白的比例下調誘導細胞凋亡〔18〕。

本實驗說明MPP+作用SH-SY5Y細胞后引起了細胞凋亡。丁苯酞通過降低促凋亡蛋白的表達，提高抗凋亡蛋白的表達，從而抑制細胞凋亡。因此，推測丁苯酞對MPP+誘導的細胞損傷具有一定的保護作用，且這種保護作用的機制可能是通過下調P53、Bax的表達，上調Bcl-2的表達，抑制細胞凋亡的發(fā)生。

1 Haik KL,Shear DA,Hargrove C,etal.7-nitroindazole attenuates 6-hydroxy dopamine-induced spatial learning deficits and dopamine neuron loss in a presymptomatic animal model of Parkinson′s disease〔J〕.Exp Clin Psychopharmacol,2008;16(2):178-89.

2 梁天佳.帕金森病發(fā)病機制研究進展〔J〕.醫(yī)學綜述2008;14(7):1040-2.

3 焦 明,王丹巧,王 巍.中醫(yī)藥治療帕金森病的研究進展〔J〕.中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志,2008;14(11):875-7.

4 崔麗英，朱以誠，高 山,等.DL-3丁基苯酞對急性缺血性腦卒中的九十天的管理：一項隨機，雙盲試驗〔J〕.中華醫(yī)學雜志，2013;126(18):3405-10.

5 鄢學芬,詹 瑾,黃葉寧,等.丁苯酞的藥理作用與臨床評價〔J〕.中國醫(yī)院藥學雜志,2008;28(17):1498-500.

6 馮新紅，袁 偉，彭 英，等.丁基苯酞對肌萎縮側索硬化轉基因小鼠神經保護作用的初步探討〔J〕.中華醫(yī)學雜志，2012；125(10)：1760-6.

7 劉鳴銀,魏麓云.丁苯酞對神經保護作用研究進展〔J〕.現代醫(yī)藥衛(wèi)生,2014;30(2):212-5.

8 Cristine Alves da Costa,Frédéric Checler.Apoptosis in Parkinson′s disease:is p53 the missing link between genetic and sporadic Parkinsonism〔J〕?Cell Signal,2011;23(6):963-8.

9 Schapira AH.Etiology of Parkinson′s disease〔J〕.Neurology,2006;6(Suppl 4):S10-23.

10 Venderova K,Park DS.Programmed cell death in Parkinson′s disease〔J〕.Cold Spring Harbor Perspect Med,2012;2(8):a009365.

11 Perier C,Bové J,Vila M.Mitochondria and programmed cell death in Parkinson′s disease:apoptosis and beyond〔J〕.Antioxid Redox Signal,2012;16(9):883-95.

12 閆春林,程月發(fā),吳慶文,等.葛根素對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞凋亡過程中p53mRNA及相關基因表達的影響〔J〕.中國實驗方劑學雜志,2014;20(4):154-8.

13 熊 杰,徐平湘,孫麗娜,等.丁基苯酞對原代培養(yǎng)神經元線粒體功能的保護作用〔J〕.中藥藥理與臨床,2007;23(5):73-5.

14 張霞萍,俞海泓,嚴玉寧,等.丁苯酞治療中晚期帕金森病的療效觀察〔J〕.上海醫(yī)藥,2011;32(6):274-5.

15 劉建國,戚曉昆,姚 生,等.丁苯酞治療神經變性病及遺傳性疾病的療效觀察〔J〕.中國神經免疫學和神經病學雜志,2008;15(6):468-9.

16 賈 敏,熊 念,黃金莎,等.丁基苯酞對帕金森病細胞模型保護作用的初步研究〔J〕.卒中與神經疾病,2010;17(1):6-8.

17 Pedreanez A,Rincon J,Romero M.Melatonin decreases apoptosis and expression of apoptosis-associated proteins in acute puromycin aminonucleoside nephrosis〔J〕.Nephrol Dial Transplant,2004;19(5):1098-105.

18 周 桔,羅榮保,湯長發(fā).Bcl-2蛋白家族和p53基因在細胞凋亡中的調控效應〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復,2007;11(10):1950-2.

〔2015-08-04修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

吳慶文(1966-)，女，博士，教授，碩士生導師，主要從事康復醫(yī)學、神經康復研究。

趙素晨(1988-),女，碩士，住院醫(yī)師，主要從事神經康復研究。

R742.5

A

1005-9202(2017)02-0316-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.024

1 襄陽市中心醫(yī)院康復醫(yī)學科 2 華北理工大學冀唐學院