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    內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白肌醇需求酶1α介導(dǎo)的凋亡通路在兔骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的作用及機(jī)制

    2017-02-14 09:10:45劉廣宇張曉峰
    中國老年學(xué)雜志 2017年2期
    關(guān)鍵詞:松解術(shù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滑膜

    劉廣宇 張 杰 張曉峰

    (黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科,黑龍江 哈爾濱 150001)

    內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白肌醇需求酶1α介導(dǎo)的凋亡通路在兔骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的作用及機(jī)制

    劉廣宇 張 杰 張曉峰

    (黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科,黑龍江 哈爾濱 150001)

    目的 探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白肌醇需求酶(IRE)1α介導(dǎo)的凋亡通路在骨關(guān)節(jié)炎(OA)發(fā)病中的作用及機(jī)制。方法 新西蘭兔膝關(guān)節(jié)注射木瓜蛋白酶模擬OA模型,HE染色檢測OA關(guān)節(jié)軟骨以及關(guān)節(jié)滑膜的形態(tài),ELISA法檢測OA關(guān)節(jié)滑膜中炎性因子白細(xì)胞介素(IL)-6的含量。檢測閉合性松解術(shù)關(guān)節(jié)軟骨的組織形態(tài)以及IL-6的含量。Western印跡檢測IRE1α介導(dǎo)的凋亡通路在OA滑膜中的表達(dá)水平。結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的OA模型中,關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞發(fā)生明顯壞死,纖維組織變性、機(jī)化以及纖維蛋白壞死物沉積,ELISA結(jié)果顯示關(guān)節(jié)滑膜中的IL-6水平明顯升高,閉合性松解術(shù)后的OA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡減少,且關(guān)節(jié)滑膜中IL-6水平也明顯降低。蛋白水平顯示OA膝關(guān)節(jié)滑膜中IRE1α的磷酸化水平以及Caspase3的表達(dá)水平明顯升高,介導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡,而閉合性松解術(shù)后Caspase3的表達(dá)水平降低。結(jié)論 閉合性松解術(shù)可緩解OA的癥狀,抑制IRE1α-Caspase3信號通路介導(dǎo)的凋亡作用。

    閉合性松解術(shù);內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白肌醇需求酶1α;骨關(guān)節(jié)炎;凋亡

    骨關(guān)節(jié)炎(OA)目前尚無有效的根治方法,此前西醫(yī)多采用玻璃酸鈉注射液關(guān)節(jié)腔注射緩解局部疼痛癥狀,不但遠(yuǎn)期療效不理想,而且長期服用會引起嚴(yán)重的副作用,包括胃潰瘍、胃出血、肝腎損害等〔1,2〕。閉合性松解術(shù)主要是通過減輕關(guān)節(jié)腔內(nèi)的內(nèi)壓力,減壓和阻斷惡性循環(huán),緩解或消除癥狀,而且可恢復(fù)關(guān)節(jié)的力學(xué)平衡,OA痛苦小、見效快,更易為醫(yī)生或患者接受。研究發(fā)現(xiàn),骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的過度凋亡會破壞軟骨發(fā)育和關(guān)節(jié)區(qū)的穩(wěn)態(tài),可能參與了膝OA的發(fā)生和發(fā)展〔3〕。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白肌醇需求酶(IRE)1α是適應(yīng)性未折疊蛋白響應(yīng)(UPR)中最保守也是最早發(fā)現(xiàn)的一個分支〔4〕。IRE1α是I型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白,它的氨基端含有一個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)結(jié)構(gòu)域,羧基端含有一個激酶結(jié)構(gòu)域和核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域,IRE1α對Hac1或者切割XBP1產(chǎn)生XBP1s后者翻譯出一個更長、更穩(wěn)定也更有轉(zhuǎn)錄活性的轉(zhuǎn)錄因子XBP1〔5〕。IRE1α還可以激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)和半胱天冬酶(Caspase)3介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡。本文旨在探究閉合性松解術(shù)緩解OA的機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 試劑和儀器 戊巴比妥鈉、木瓜蛋白酶購自Sigma公司,10%甲醛購自上海銀海圣生物科技有限公司。微量移液器(Eppendorf公司),冷凍式離心機(jī)以及高速離心機(jī)(Eppendorf公司),NanoDrop紫外分光光度計(Thermo)。IRE1α抗體、p-IRE1α抗體、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)3抗體和β-actin抗體購自上海銀海圣生物科技有限公司。

    1.2 新西蘭兔的飼養(yǎng)條件 試驗中所用的雄性新西蘭兔均由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供,新西蘭兔可自由進(jìn)食及飲水,飼養(yǎng)于溫度(23±2)℃、濕度(36±4)%、晝夜循環(huán)周期為12 h的SPF級動物房中。所有新西蘭兔實驗操作方法和操作程序都得到醫(yī)院實驗動物管理和使用委員會以及倫理委員會的批準(zhǔn)。

    1.3 新西蘭兔OA動物模型的制備以及處理 將40只新西蘭兔隨機(jī)分為治療組、對照組、模型組、假模組,每組10只,均采用1%戊巴比妥鈉(3 ml/kg)兔耳靜脈麻醉。前三組兔左側(cè)臥位用75%酒精棉球消毒下肢3遍并用剃毛器腿部兔毛。于膝關(guān)節(jié)稍外側(cè)進(jìn)針,針頭從下向上前斜刺入直到針頭的阻力突然變小,然后針頭稍微外退垂直進(jìn)入關(guān)節(jié)腔,待出現(xiàn)落空感表明針頭已經(jīng)進(jìn)入關(guān)節(jié)腔,其中前三組為緩慢推注4%的木瓜蛋白酶0.5 ml,關(guān)節(jié)腔正常組織不做任何處理,制備OA模型,假模組為等量的生理鹽水,推注量為1.2 ml/kg。造模2 w后,治療組使用小針刀配合捏拿手法治療。小針刀治療首先暴露兔右側(cè)膝關(guān)節(jié),觀察患肢是否出現(xiàn)腫脹、變形和肌肉萎縮;對膝關(guān)節(jié)進(jìn)行按壓檢查,壓痛點(diǎn):內(nèi)外側(cè)支持帶、內(nèi)外側(cè)膝眼;膝關(guān)節(jié)上方髕上囊、股四頭肌各肌肌腹,膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)股薄肌肌腹及止點(diǎn)、收肌肌群肌腹及止點(diǎn)和脛骨平臺附近。針刀松解每次選取上述部位壓痛點(diǎn)10個,按針刀四步進(jìn)針法對局部壓痛點(diǎn)或病理性條索狀物進(jìn)行切割松解。捏拿手法由上而下捏拿兔右下肢股四頭肌,繼先順時針后逆時針旋轉(zhuǎn)揉按患膝髕骨、屈伸牽張膝關(guān)節(jié),每次每只兔施術(shù)10 min,1次/w,連續(xù)治療5 w共5次,丹參注射液0.3 ml關(guān)節(jié)腔注射每1次,連用5 w。對照組每周每只兔右膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射玻璃酸鈉注射液0.6 ml,注射后屈伸膝關(guān)節(jié)20次,連用5 w。模型組及假模組不作任何處理,所有動物同樣條件下關(guān)養(yǎng)。閉合松解術(shù)后5 w 3%戊巴比妥鈉麻醉,解剖暴露出膝關(guān)節(jié),觀察關(guān)節(jié)滑膜的形態(tài)和顏色以及是否與周圍組織粘連。取關(guān)節(jié)面上的軟骨組織用于蘇木素-伊紅(HE)染色,關(guān)節(jié)滑膜置于-80℃冰箱保存用于后續(xù)ELISA檢測。

    1.4 關(guān)節(jié)滑膜的HE染色 參照常規(guī)的HE染色步驟,取材與固定,脫水透明,浸蠟包埋,切片,二甲苯脫蠟,酒精水化,HE染色液染色,經(jīng)純酒精脫水和二甲苯透化,樹膠封片即可,然后顯微鏡下觀察關(guān)節(jié)軟骨組織的結(jié)構(gòu)。

    1.5 ELISA檢測關(guān)節(jié)滑膜炎性因子白細(xì)胞介素(IL)-6 檢測試劑盒購自南京建成生物科技有限公司,檢測原理均雙抗體夾心法,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算IL-6的含量。

    1.6 Western印跡檢測 滑膜組織用RIPA裂解后進(jìn)行蛋白濃度測定,用10%的十二烷硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)上樣電泳,電泳結(jié)束后將分離膠切出,做成濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙夾心(負(fù)極-正極),放入Bio-Rad濕轉(zhuǎn)裝置,以350 mA恒流將蛋白電轉(zhuǎn)到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜完成后,按照膜上的彩色蛋白Marker根據(jù)要檢測蛋白大小切割出不同的膜條,用含5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1 h。封閉結(jié)束后用一抗4℃過夜孵育,用Tris鹽酸緩沖液(TBST)搖床室溫洗膜3次后加入二抗室溫結(jié)合2 h,再用TBST洗膜3次顯影。

    1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0 軟件,組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。

    2結(jié) 果

    2.1 HE染色檢測新西蘭兔造模后的軟骨形態(tài) 木瓜蛋白酶處理后兔關(guān)節(jié)滑膜色澤比較昏暗,組織疏松,表面有明顯的炎性滲出,滑膜厚度較薄,部分與軟骨粘連且破損漏出滑膜下軟骨,附著于關(guān)節(jié)軟骨周緣的部分發(fā)生明顯的纖維粘連。HE染色顯示生理鹽水組關(guān)節(jié)滑膜顏色正常,呈現(xiàn)出表面平滑光亮、粉紅色且柔潤的滑膜結(jié)締組織結(jié)構(gòu);HE染色可見明顯的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)。模型組顯示關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞多已經(jīng)壞死,未見明顯的軟骨細(xì)胞,纖維組織變性、增生及機(jī)化,纖維素及類纖維蛋白壞死物沉積。見圖1。

    圖1 新西蘭兔OA造模后滑膜形態(tài)

    2.2 造模后關(guān)節(jié)滑膜中IL-6因子含量 造模后,關(guān)節(jié)滑膜中IL-6的含量〔(12.46±4.58)pg/ml〕較對照組〔(5.21±2.27)pg/ml〕明顯升高(P<0.05)。

    2.3 HE染色檢測閉合性松解術(shù)對OA滑膜形態(tài)的影響 模型組的OA滑膜色澤比較暗淡,且厚薄不均,部分滑膜發(fā)生粘連和破損,HE染色顯示關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞多發(fā)生壞死,未見明顯的細(xì)胞形態(tài),多為變性的纖維蛋白。治療組關(guān)節(jié)滑膜顏色較鮮紅,滑膜整體形態(tài)光滑且粘連較少,HE染色顯示關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)尚可,細(xì)胞變性程度較輕,變形蛋白堆積較少。對照組關(guān)節(jié)滑膜顏色略鮮紅,滑膜整體形態(tài)光滑且粘連較少,HE染色顯示關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)尚可,細(xì)胞變性程度略輕,變形蛋白堆積略少,見圖2。

    2.4 閉合性松解術(shù)對OA滑膜中IL-6含量的影響 治療組滑膜中IL-6的表達(dá)〔(3.25±1.81)pg/ml〕較模型組〔(15.21±1.39)pg/ml〕明顯降低(P<0.01)。

    2.5 Western印跡檢測IRE1α介導(dǎo)的凋亡通路在OA滑膜中的表達(dá)水平 如圖3所示,模型組膝關(guān)節(jié)滑膜中IRE1α的磷酸化水平以及Caspase3的表達(dá)水平明顯升高,閉合性松解術(shù)后Caspase3的表達(dá)水平降低,表明OA中伴有IRE1α-Caspase3凋亡通路的激活,而閉合性松解術(shù)可抑制IRE1α-Caspase3凋亡通路的激活。

    圖3 IRE1α介導(dǎo)的凋亡通路在OA新西蘭兔滑膜中的表達(dá)水平

    3 討 論

    軟骨細(xì)胞凋亡異常是OA發(fā)病的重要原因〔6,7〕。隨著對軟骨細(xì)胞凋亡研究的深入,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡和OA的發(fā)生發(fā)展較為密切〔8〕,其發(fā)生機(jī)制以及各種因素之間相互作用的關(guān)系仍不十分清楚。研究發(fā)現(xiàn)多種因素如炎癥〔9〕、氧化應(yīng)激〔10〕、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激〔11〕等均可引起關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡,且關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡參與了OA的發(fā)病。Kim等〔12〕應(yīng)用TUNEL染色法顯示OA組新西蘭兔軟骨細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組,且OA軟骨細(xì)胞凋亡主要位于軟骨表層和中層。同時有研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測OA軟骨細(xì)胞凋亡率約為22.3%明顯高于正常對照組(4.8%)〔13〕。這表明OA是一種由于軟骨細(xì)胞凋亡增加所致的壞死性疾病。目前研究發(fā)現(xiàn)參與軟骨細(xì)胞凋亡的信號通路包括:(1)NO途徑。NO上調(diào)Caspase-3的活性,促進(jìn)軟骨細(xì)胞的凋亡數(shù)量〔14〕。(2)Fas途徑。Fas作用于細(xì)胞表面的FasL介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的凋亡通路〔15〕。(3)Caspase凋亡級聯(lián)通路。p53基因表達(dá)產(chǎn)物的聚集上調(diào)Bax的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放并激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡〔16〕。本研究結(jié)果顯示OA中關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡,且關(guān)節(jié)滑膜中炎性因子IL-6水平升高;IRE1α-Caspase 3凋亡通路在OA的發(fā)病中具有重要的角色。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)IRE1α通過上調(diào)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中Caspase3的表達(dá)水平,誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡,明確了IRE1α-Caspase 3信號通路對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的促凋亡作用。

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    〔2015-12-14修回〕

    (編輯 袁左鳴)

    黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)科研基金項目(201310)

    劉廣宇(1979-),男,主治醫(yī)師,主要從事中醫(yī)微創(chuàng)治療骨病研究。

    R68

    A

    1005-9202(2017)02-0291-03;

    10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.014

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