腺苷預處理星形膠質(zhì)細胞氧糖剝奪復氧糖后CX3CL1、GLT-1表達的變化

王 潔 韓艷艷 李 娟 毛向雷 牛草原 李艷艷 蘭春偉 譚 軍

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453000)

腺苷預處理星形膠質(zhì)細胞氧糖剝奪復氧糖后CX3CL1、GLT-1表達的變化

王 潔 韓艷艷 李 娟 毛向雷 牛草原 李艷艷 蘭春偉 譚 軍

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453000)

目的 探討在缺氧復氧情況下腺苷預處理誘導星形膠質(zhì)細胞谷氨酸轉(zhuǎn)運體蛋白(GLT-1)和趨化因子(CX3CL1)的表達變化。方法 原代培養(yǎng)的大鼠星形膠質(zhì)細胞分為正常組、模型組和腺苷預處理組。模型組:細胞接受5 h氧糖剝奪/復氧糖24 h處理；腺苷預處理組：細胞在氧糖剝奪前24 h加入100 μmol/L腺苷后接受5 h氧糖剝奪/復氧糖24 h。在5 h氧糖剝奪/復氧糖24 h后觀察各組的細胞形態(tài)、MTT法檢測各組細胞活力，ELISA檢測各組CX3CL1的相對表達情況，免疫熒光法及Western印跡法檢測各組GLT-1的相對表達情況。結(jié)果 ①正常組、模型組和腺苷預處理組在氧糖剝奪5 h復氧糖24 h后細胞活力(OD值)分別是(0.763±0.065)，(0.217±0.052)和(0.404±0.013)，腺苷可以減少缺氧復氧引起的損傷(P<0.05)。②與正常組相比，星形膠質(zhì)細胞在缺氧復氧后，其釋放的趨化因子CX3CL1明顯升高(P<0.05)，GLT-1的表達明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，腺苷預處理組可明顯降低缺氧復氧組CX3CL1的釋放(P<0.05)，以及增加缺氧復氧GLT-1的表達水平(P<0.05)。結(jié)論 腺苷預處理可使氧糖剝奪/復氧糖后CX3CL1的釋放減少，GLT-1表達量升高，從而增強腦對缺血再灌注損傷的耐受。

CX3CL1；谷氨酸轉(zhuǎn)運體蛋白；星形膠質(zhì)細胞；氧糖剝奪/復氧糖

腦組織過度的炎癥反應(yīng)是造成腦缺血再灌注損傷的重要機制之一，腦缺血再灌注損傷炎癥反應(yīng)發(fā)生的關(guān)鍵是白細胞聚集并遷移至腦實質(zhì)中。CX3CL1作為腦中主要的趨化因子，具有黏附、趨化、調(diào)節(jié)小神經(jīng)膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞功能及神經(jīng)保護等多重作用，參與腦缺血再灌注損傷的發(fā)生和發(fā)展〔1〕。谷氨酸積聚所致的興奮性毒性被認為是腦缺血再灌注損傷的另一重要機制〔2〕。腦內(nèi)清除谷氨酸的主要機制是谷氨酸轉(zhuǎn)運體蛋白(GLT)-1將胞外谷氨酸重攝取至胞內(nèi)，以終止谷氨酸的神經(jīng)興奮作用。星形膠質(zhì)細胞膜上表達大量GLT-1，參與了大部分胞外谷氨酸的清除，但在缺血缺氧等條件下其功能表達會發(fā)生顯著變化，從而導致谷氨酸興奮性毒性。腺苷作為一種神經(jīng)遞質(zhì)與G蛋白耦聯(lián)受體(主要是受體A1)相結(jié)合后，激活ATP依賴的鉀離子通道，抑制興奮性氨基酸釋放，阻止興奮性氨基酸誘導的神經(jīng)元除極效應(yīng)，降低細胞膜對鈣離子的通透性，擴張血管，抑制炎性細胞黏附和浸潤，抑制血小板聚集以及減輕炎性細胞、自由基導致的血管內(nèi)皮損傷。本研究探討腺苷是否通過調(diào)節(jié)CX3CL1及GLT-1發(fā)揮抗腦缺血再灌注損傷作用。

1 材料與方法

1.1 材料 出生24 h內(nèi)的SD大鼠，雌雄不限，體重10～12 g。由新鄉(xiāng)醫(yī)學院實驗動物中心提供。高糖DMEM培養(yǎng)基，無糖DMEM(Gibco)，胎牛血清，青鏈霉素，0.25%胰蛋白酶，MTT試劑盒，ELISA試劑盒，膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)抗體、GLT-1抗體均購自武漢博士德生物有限公司。

1.2 實驗分組和OGD模型的建立〔3〕大鼠星形膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng)參照參考文獻〔4〕。將第三代融合80%以上的星形膠質(zhì)細胞傳代至24孔板內(nèi)，隨機分為正常組，模型組和腺苷預處理組。細胞經(jīng)24 h基本貼壁并伸出突觸，待細胞貼壁后腺苷預處理組給予腺苷預處理，即細胞換含100 μmol/L腺苷的DMEM預處理，24 h后進行氧糖剝奪。正常組不進行氧糖剝奪，模型組和腺苷預處理組在糖氧剝奪期分別更換為預熱的無糖DMEM培養(yǎng)基，去培養(yǎng)板蓋，放入95%氮氣、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育。缺氧5 h后，模型組及腺苷預處理組均更換為預熱的復糖DMEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。正常組在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。

1.3 星形膠質(zhì)細胞形態(tài)學觀察 用光學顯微鏡(德國Leica)直接觀察各組細胞在氧糖剝奪復氧后形態(tài)變化。

1.4 細胞活性檢測 取第3代星形膠質(zhì)細胞以1×105個/ml的密度接種于96孔板，每孔細胞數(shù)為104個，待24 h后細胞基本融合后，氧糖剝奪處理過程如同上述，各孔加入相應(yīng)的培養(yǎng)基100 μl，在再復氧復糖24 h時，每孔加入MTT50 μl，充分混勻，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h后平板離心機1 000 r/min離心5 min，小心去除培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO，37℃搖晃10 min，用450 nm波長測定OD值，各實驗組設(shè)5個復孔，獨立重復3次。

1.5 ELISA檢測CX3CL1表達 將對數(shù)生長期的星形膠質(zhì)細胞以5×104個/ml的密度接種于24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞基本融合后，吸棄培養(yǎng)液，進行隨機分組，每組設(shè)3個復孔，重復3次，各組氧糖剝奪處理過程如同上述，各孔加入相應(yīng)的培養(yǎng)基1 000 μl，在再復氧復糖24 h時，收集各組細胞上清液，按大鼠試劑盒進行CX3CL1測定。

1.6 免疫熒光測GLT-1的表達〔4〕取第3代星形膠質(zhì)細胞傳代至24孔板內(nèi)，隨機分為正常組、模型組、腺苷預處理組(ADO/R)，氧糖剝奪過程如上述。24 h細胞貼壁后，用PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，棄去，PBS洗3次，0.1%Triton-X 100作用10 min，PBS液漂洗3次，5%BSA封閉1 h，棄封閉液，加入兔抗GLT-1抗體(1∶200稀釋)，孵育過夜，棄一抗，PBS液漂洗3次，加FITC標記的羊抗兔IgG抗體(1∶200稀釋)，室溫孵育1 h，棄二抗，熒光顯微鏡下觀察拍照。觀察照相后以Image Pro-Plus 6.0軟件分析得出平均吸光度值及熒光強度。

1.7 Western印跡測GLT-1表達量 分別消化各組缺氧復氧后的細胞，加上蛋白裂解液，冰上裂解20 min，測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液，沸水變性5 min，每孔加入40 μg蛋白樣品電泳，用NC膜轉(zhuǎn)膜，封閉后加一抗(1∶500稀釋)，4℃孵育過夜，加入HRP標記的二抗，37℃孵育1 h，ECL顯影，GAPDH作為內(nèi)參對照，用ImageJ軟件分析熒光條帶吸光度值。以目的蛋白GLT-1與內(nèi)參的比值進行統(tǒng)計分析。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，兩兩比較均采用Turkey法。

2 結(jié) 果

2.1 星形膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng)及鑒定結(jié)果 分離培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞接種2 h 開始貼壁生長，3 d后胞體增大，7 d時基本成熟，胞體較大、扁平、形狀多樣，從胞體發(fā)出許多長而分支的突起，形成密集的細胞網(wǎng)絡(luò)。原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞傳到第3 代后，用兔抗GFAP 多克隆抗體進行免疫熒光染色，可見細胞陽性率達95%以上;熒光顯微鏡下顯示清晰的星形膠質(zhì)細胞，輪廓清晰，胞質(zhì)中呈綠色熒光，胞核處熒光淺淡，胞體寬大而扁平，發(fā)出多個短而粗大的突起，形態(tài)不規(guī)則，相互連接成片。見圖1。

2.2 各組星形膠質(zhì)細胞形態(tài)觀察及活力檢測結(jié)果 糖氧剝奪復糖氧后正常組星形膠質(zhì)細胞生長狀態(tài)良好，折光性強，相連的細胞之間形成大量的突觸聯(lián)系，與氧糖剝奪復氧糖前相比無明顯形態(tài)學變化。模型組星形膠質(zhì)細胞胞體水腫變圓，細胞形態(tài)由不規(guī)則變成梭形，突起明顯變短或消失；腺苷預處理組細胞水腫較輕。見圖2。

2.3 MTT 與細胞的形態(tài)變化相一致。正常組、模型組、腺苷預處理組在氧糖剝奪5 h復氧24 h后細胞活力(OD值)分別是(0.763±0.065)，(0.217±0.052)，(0.404±0.013)。模型組星形膠質(zhì)細胞活力下降，明顯低于正常組(P<0.05)。腺苷預處理組細胞活力顯著高于模型組，表明腺苷與處理組能明顯改善細胞活力(P<0.05)。三組間兩兩比較差異顯著(P<0.05)。

2.4 糖氧剝奪復糖氧24 h后細胞培養(yǎng)液中CX3CL1濃度 模型組星形膠質(zhì)細胞CX3CL1濃度明顯高于正常組(P<0.05)，表明細胞受到缺氧缺糖損傷，細胞損傷嚴重，釋放大量CX3CL1；與模型組比較，腺苷預處理組細胞損傷輕，CX3CL1釋放減少(P<0.05)。

2.5 GLT-1免疫熒光結(jié)果 正常組胞膜及胞質(zhì)中熒光信號最強；糖氧剝奪復糖氧后，胞膜熒光信號減弱；而胞質(zhì)中熒光表達弱且無明顯變化。與模型組相比，腺苷預處理組胞膜熒光強度降低但高于正常組。見圖3。

2.6 Western印跡檢測氧糖剝奪/復糖后GLT-1的表達 如圖4所示，正常組星形膠質(zhì)細胞在氧糖剝奪5 h復氧糖24 h后蛋白表達相對最高，腺苷預處理組次之，模型組最低(P<0.05)。

圖1 免疫熒光染色鑒定星形膠質(zhì)細胞(×200)

圖2 各組星形膠質(zhì)細胞缺氧復氧后的形態(tài)學改變(×100)

圖3 各組GLT-1免疫熒光結(jié)果(×200)

圖4 各組細胞在氧糖剝奪5 h復氧糖24 h后GLT-1的表達

3 討 論

近年研究表明，缺血后的血流恢復在某些情況下能導致進一步的組織損傷和功能障礙，這種恢復血流灌注后的有害情況稱為缺血再灌注損傷(IRI)〔6〕。雖然目前人們對其病理機制進行了深入研究發(fā)現(xiàn)，其病理過程是一個多因素、多機制，涉及復雜的時間和空間的級聯(lián)反應(yīng)。腦缺血再灌注損傷機制復雜，炎癥反應(yīng)在其中的作用越來越受到重視。腦缺血再灌注損傷的最早反應(yīng)是局部白細胞遷移、炎性細胞因子出現(xiàn)和增多。另外，炎癥反應(yīng)會加大梗死核心區(qū)周圍區(qū)域神經(jīng)細胞損傷。在此過程中，趨化因子是調(diào)節(jié)白細胞遷移和小神經(jīng)膠質(zhì)細胞活化的關(guān)鍵因素。能在腦中持續(xù)表達的趨化因子極少，CX3CL1 為其中之一〔7〕。它對中性粒細胞、淋巴細胞及單核細胞均有趨化作用。研究表明，僅基質(zhì)細胞衍生因子和CX3CL1可在中樞神經(jīng)系統(tǒng)持續(xù)表達〔8〕。趨化因子與炎癥過程密切相關(guān)，能吸引炎性細胞在炎癥區(qū)域聚集，參與調(diào)控白細胞遷移，在炎癥中誘導性表達。有人提出趨化因子能增加血腦脊液屏障通透性，使炎性細胞及因子在病灶處聚集，加重腦損傷。生理狀態(tài)時小鼠的CX3CL1幾乎僅存在于大腦，其特異性受體CX3CR1 在腦中也呈高表達，CX3CL1 及受體主要分布于大腦皮質(zhì)、海馬、基底神經(jīng)節(jié)、紋狀體及嗅球，主要表達于皮質(zhì)板層Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ及海馬CA1 區(qū)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元上，在腦干、小腦僅少量表達〔9〕。CX3CL1是目前發(fā)現(xiàn)唯一不依賴黏附因子而介導炎性細胞及炎癥介質(zhì)黏附于內(nèi)皮細胞的趨化因子，能加快炎性因子滲出，促進炎癥級聯(lián)反應(yīng)發(fā)生，獨特的結(jié)構(gòu)和生物特性使其可能在缺血再灌注損傷中起重要作用〔10〕。腦缺血再灌注損傷中的炎癥反應(yīng)在缺血再灌注損傷過程十分復雜〔11〕，其特點是血腦脊液屏障崩裂導致白細胞穿透血腦屏障并在損傷區(qū)異常聚集黏附。在缺血1～48 h 內(nèi)出現(xiàn)明顯的中性粒細胞浸潤和聚集，2～15 d單核細胞浸潤明顯。缺血再灌注時缺血處血管內(nèi)皮細胞出現(xiàn)功能障礙，各種趨化因子及炎癥介質(zhì)表達增加，白細胞在缺血處聚集，且與微血管內(nèi)皮細胞間黏附性增強，白細胞貼壁、嵌塞并游出微血管外，釋放大量氧自由基和炎性因子，導致神經(jīng)元繼發(fā)性損傷。除炎性細胞因子和黏附分子外，趨化因子及其受體在白細胞聚集進入缺血性損傷部位中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔12〕。缺乏CX3CR1 不會誘發(fā)腦缺血后小膠質(zhì)細胞的神經(jīng)毒性，而是顯著降低了腦缺血的損傷和炎癥反應(yīng)。

興奮性氨基酸毒性是腦缺血再灌注損傷的另一重要因素。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，對維持正常腦功能至關(guān)重要，但過高濃度的谷氨酸又具有很強的神經(jīng)毒性。研究表明，谷氨酸的興奮性毒性是腦缺血再灌注損傷的重要機制之一〔13〕。因此，降低腦缺血再灌注時細胞外液中谷氨酸的濃度，是減輕神經(jīng)元損傷的重要策略。腦內(nèi)細胞外沒有谷氨酸代謝酶，腦內(nèi)細胞外谷氨酸的穩(wěn)態(tài)主要依靠高親和力興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運體系統(tǒng)(EAATs)維持〔14〕。目前，已經(jīng)克隆出5種高親和力谷氨酸轉(zhuǎn)運體，包括EAAT1(GLAST)、EAAT2、EAAT3(EAAC1)、EAAT4、EAAT5。EAAT2主要分布在星形膠質(zhì)細胞膜上，又稱為膠質(zhì)細胞GLT-1〔15〕。GLT-1在清除突觸間隙的谷氨酸、維持細胞外液谷氨酸濃度處于低水平、防止其興奮性毒性方面發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，GLT-1表達上調(diào)在腦缺血預處理誘導的腦缺血耐受中發(fā)揮重要作用，提示GLT-1的功能異常在缺血性腦損傷中發(fā)揮重要作用，調(diào)制GLT-1的表達和功能、增強其攝取谷氨酸的能力，有可能成為腦缺血類疾病預防和治療研究的新靶點〔16〕。

腺苷用于腦缺血再灌注損傷的預處理作用效果好，價格便宜，且腺苷預處理方面已取得了一定的成果〔17〕。腺苷能抑制EAA的釋放，降低細胞膜對鈣離子的通透性，抑制炎性細胞黏附和浸潤，抑制血小板聚集，減輕自由基引起的血管內(nèi)皮損傷，是一種內(nèi)源性神經(jīng)保護劑，腺苷的作用是通過特異性腺苷受體調(diào)節(jié)的，腺苷受體分為A1、A2、A3三種〔18〕。缺血預處理時用藥物阻斷A1受體或ATP通道能阻斷缺血耐受的形成。A1R在腦缺血中具有神經(jīng)保護作用原代培養(yǎng)的皮質(zhì)或海馬神經(jīng)元細胞，在糖-氧剝奪的條件下給予A1R選擇性激動劑環(huán)己基處理后，其細胞損傷明顯減輕，而A1R特異性拮抗劑可加重同一缺氧模型所誘導的細胞損傷〔19〕。同樣，在腦缺血的動物模型中也有類似發(fā)現(xiàn)。這些都提示A1R對腦缺血再灌注損傷具有保護作用。本實驗腺苷通過抑制CX3CL1的釋放及上調(diào)GLT-1的表達，產(chǎn)生腦保護效應(yīng)。

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〔2015-09-30修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

王 潔(1987-)，女，碩士，醫(yī)師，主要從事腦血管疾病研究。

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A

1005-9202(2017)02-0288-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.013