EGFR抑制劑對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29中CD44+細(xì)胞及側(cè)群細(xì)胞作用的研究

鞏超捷 唐燕 夏璐

EGFR抑制劑對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29中CD44+細(xì)胞及側(cè)群細(xì)胞作用的研究

鞏超捷 唐燕 夏璐

目的探討表皮生長因子受體（EGFR）抑制劑對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29中CD44+細(xì)胞及側(cè)群（SP）細(xì)胞的作用機(jī)制。方法應(yīng)用Hoechst33342染色、流式細(xì)胞儀檢測HT29中CD44+細(xì)胞以及SP細(xì)胞比例和成瘤性，并對(duì)不同濃度EGFR抑制劑吉非替尼作用后球囊形成及SP細(xì)胞比例、不同化療藥物處理后CD44+細(xì)胞比例進(jìn)行分析與比較。結(jié)果空白對(duì)照組HT29中SP細(xì)胞比例為（3．82±0．08）%，經(jīng)維拉帕米阻斷后降為（0．34±0．03）%，吉非替尼10、15μmol/L作用48h后HT29中SP細(xì)胞比例明顯降低（均P＜0．01），5-氟尿嘧啶（5-FU）作用48h后SP細(xì)胞比例變化不大（P＞0．05）。與空白對(duì)照組比較，吉非替尼7．5、10、15μmol/L作用24、48h后CD44+細(xì)胞比例均明顯降低（均P＜0．05）；且隨著吉非替尼的濃度增大，CD44+細(xì)胞比例逐漸降低（P＜0．05）。與空白對(duì)照組比較，多烯紫杉醇、順鉑作用24、48h后CD44+比例均明顯增大（均P＜0．05）。隨著時(shí)間延長，加入不同濃度的吉非替尼對(duì)球囊形成均具有抑制作用。結(jié)論EGFR抑制劑對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29中CD44+細(xì)胞及SP細(xì)胞具有生長抑制作用，且可抑制球囊形成。

CD44+側(cè)群細(xì)胞吉非替尼結(jié)腸癌

結(jié)腸癌是第三大常見惡性腫瘤，盡管診療水平不斷提高，但由于術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)等問題，5年生存率依然較低[1]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，來源于結(jié)腸隱窩細(xì)胞的結(jié)腸腫瘤干細(xì)胞對(duì)腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移具有重要影響[2]，其增殖分化可能受到生長因子[表皮生長因子（EGF）、血管源性生長因子（VEGF）和纖維母細(xì)胞生長因子（FGF）]的調(diào)控與影響。其中EGF對(duì)CD133+標(biāo)記的腫瘤干細(xì)胞增殖具有明顯促進(jìn)作用[3]，可提高UMSCC10B和HN12這兩種人頭頸部鱗癌細(xì)胞系中側(cè)群（SP）細(xì)胞比例[4]，而EGF受體（EGFR）抑制劑——吉非替尼可以降低SP細(xì)胞比例[5]。以上研究結(jié)果表明EGFR抑制劑或許能有效抑制結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞增殖分化，在結(jié)腸癌靶向治療方面具有潛在的臨床意義。目前，關(guān)于EGFR抑制劑對(duì)結(jié)腸癌干細(xì)胞作用的研究較少，且具體機(jī)制尚未清楚。本研究以人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29為對(duì)象，觀察吉非替尼對(duì)細(xì)胞中CD44+細(xì)胞以及SP細(xì)胞比例的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29購自上海信裕生物科技有限公司，由上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室保存。主要試劑：煙酸己可堿（德國Hoechst公司），鼠抗人FITC-CD44單克隆抗體（美國Becton Dickinson公司），Hoechst33342、胰島素、B27因子、胎牛血清、二甲基亞砜（DMSO）、AnnexinV/碘化丙啶（PI）、噻唑藍(lán)染色液均購自美國Sigma公司，0.5%及0.05%Trypsin-EDTA、RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液、DMEM/ F12細(xì)胞培養(yǎng)液、牛血清白蛋白BSA均購自美國Gibco公司，重組表皮生長因子EGF、堿性成纖維生長因子bFGF均購自美國PeproTech公司，維拉帕米（英國Tocris公司）。吉非替尼（商品名：易瑞莎，阿斯利康公司）溶于DMSO中，儲(chǔ)存濃度為20μmol/L，-20℃保存，每次實(shí)驗(yàn)前用新鮮培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，其中DMSO濃度不超過1‰；5-氟尿嘧啶（5-FU）購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司；順鉑、多烯紫杉醇均購自浙江恒瑞藥業(yè)公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)（1）HT29培養(yǎng)：HT29接種于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基（SSM）中，傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期，用PBS清洗，0.5%Trypsin-EDTA消化。（2）球囊形成及傳代培養(yǎng)：HT29消化、清洗，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞后，以5×105/ml濃度重懸于無血清培養(yǎng)基（SFM）中形成球囊，球囊傳代用0.05%Trypsin-EDTA消化。

1.2.2 細(xì)胞噻唑藍(lán)染色（MTT）A組單用吉非替尼，終濃度分別5、7.5、10、12.5、15μmol/L；B組只加入等量DMSO，作為空白對(duì)照。將細(xì)胞濃度為5×103/L的HT29接種于96孔板，每孔200μl，24h后換液，按上述分組情況處理細(xì)胞，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，置于恒溫孵育箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24、48h后，應(yīng)用MTT法于570 nm波長處測得吸光值（A），計(jì)算藥物的細(xì)胞增殖抑制率=（1-A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組）×100.00%，并作出量效曲線，求出藥物的50%生長抑制劑量（IC50，細(xì)胞對(duì)藥物敏感性指標(biāo)）。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 Hoechst33342染色檢測不同藥物作用后SP細(xì)胞比例選擇對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，消化、漂洗、離心，將細(xì)胞以5×105/L接種于6孔板，每孔3ml，24h后換液，A組單用吉非替尼，終濃度分別為5、10、15μmol/L；B組加入用表示，不同濃度藥物組與空白對(duì)照組比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不同濃度吉非替尼作用24、48h后CD44+細(xì)胞比例比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。

2 結(jié)果

2.1 吉非替尼對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率吉非替尼對(duì)HT29的作用較為敏感，IC50=（10.27±0.77）μmol/L；隨著濃度增大，細(xì)胞增殖抑制率逐漸增高。

2.2 吉非替尼對(duì)SP細(xì)胞的作用空白對(duì)照組HT29中SP細(xì)胞比例為（3.82±0.08）%，見圖1a；經(jīng)維拉帕米阻斷后降為（0.34±0.03）%，其流式細(xì)胞圖見圖1b。吉非替尼10、15μmol/L作用48h后HT29中SP細(xì)胞比例分別為（0.01±0.01）%和0%，明顯低于空白對(duì)照組（均P＜0.01），其流式細(xì)胞圖見圖1c-d；5-FU作用48h后SP細(xì) 5-FU，終濃度分別為10、15、20μmol/L；C組加入維拉帕米，終濃度為維拉帕米50μg/ml；D組為空白對(duì)照。48h后收集細(xì)胞并重懸于含3%胎牛血清的2ml RPMI1640培養(yǎng)液中，密度1×106/ml，加入Hoechst33342至終濃度為5μg/ml。將細(xì)胞置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育90min，每隔15min輕輕晃動(dòng)離心管（15ml）1次，使染料分布均勻；將細(xì)胞置于4℃低溫離心，去盡培養(yǎng)液，用冰冷的PBS沖洗2次，加入冰冷的3%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液2ml及PI至終濃度為2μg/ml，上機(jī)分選。使用流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter公司）去除PI染色陽性死細(xì)胞，收集SP細(xì)胞和非側(cè)群（non-SP）細(xì)胞[7]。

1.2.4 吉非替尼對(duì)球囊形成的影響觀察收集球囊細(xì)胞，經(jīng)0.05%Trypsin-EDTA消化，處理后接種于非黏附6孔板（德國Greiner公司）中，24h后加入不同濃度的吉非替尼，作用第5、8天在倒置顯微鏡下觀察球囊形成，并觀察與對(duì)照組的差異。

1.2.5 不同化療藥物處理后HT29中CD44+細(xì)胞比例的檢測收集HT29，0.5%Trypsin-EDTA消化、PBS漂洗、離心，將細(xì)胞以5×105/L接種于6孔板，每孔3ml，24h后換液，A組單用吉非替尼，終濃度分別為5、10、15μmol/L；B組加入多烯紫杉醇，終濃度分別為6、8、10nmol/L；C組單用順鉑，終濃度分別為8、12、16μmol/L；D組為空白對(duì)照。設(shè)置2個(gè)復(fù)孔。藥物作用24、48h后分別收集細(xì)胞，重懸于PBS中，細(xì)胞計(jì)數(shù)約1×106/ml，用鼠抗人FITC-CD44單克隆抗體標(biāo)記，置于4℃孵育20 min；PBS洗2次，使用流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter公司）檢測和分選，重復(fù)檢測3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料胞比例為（3.10±0.07）%，與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其流式細(xì)胞圖見圖1e。

2.3 吉非替尼對(duì)球囊形成的影響隨著時(shí)間延長，加入不同濃度的吉非替尼均對(duì)球囊形成具有抑制作用，球囊細(xì)胞大部分調(diào)亡，見圖2-3。

2.4 不同化療藥物對(duì)HT29中CD44+細(xì)胞比例的作用與空白對(duì)照組比較，吉非替尼7.5、10、15μmol/L作用24、48h后CD44+細(xì)胞比例均明顯降低（均P＜0.05）；隨著吉非替尼的濃度增大，CD44+細(xì)胞比例均逐漸降低（均P＜0.05）。與空白對(duì)照組比較，多烯紫杉醇、順鉑作用24、48h后CD44+比例均明顯增大（均P＜0.05），見表1。不同化療藥物作用48h后HT29中CD44+細(xì)胞比例的流式細(xì)胞圖，見圖4。

圖1 吉非替尼與5-FU對(duì)HT29中SP細(xì)胞作用后的流式細(xì)胞圖[a：Hoechst33342（空白對(duì)照）；b：Hoechst33342+維拉帕米；c：吉非替尼10μmol/L；d：吉非替尼15μmol/L；e：5-Fu 20μmol/L]

圖2 不同濃度吉非替尼作用5d后球囊形成情況（a：空白對(duì)照；b：10μmol/L；c：15μmol/L；×100）

圖3 不同濃度吉非替尼作用8d后球囊形成情況（a：空白對(duì)照；b：10μmol/L；c：15μmol/L；d：20μmol/L；×200）

3 討論

表1 不同化療藥物作用24、48h后HT29中CD44+細(xì)胞比例（%）

EGFR是細(xì)胞表面erbB受體家族中的一員，主要與細(xì)胞增殖、生長、遷移、浸潤與存活等有關(guān)，在結(jié)腸癌形成與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用[6]。多種藥物與物質(zhì)可通過EGFR信號(hào)途徑發(fā)揮抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞增殖的作用[7-8]。本研究選用臨床治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌患者的小分子靶向藥吉非替尼（EGFR酪氨酸激酶抑制劑）作為EGFR抑制劑，來研究EGFR在腫瘤球囊細(xì)胞增殖和CD44+細(xì)胞中的作用。吉非替尼是一種選擇性EGFR酪氨酸激酶抑制劑，對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29和LoVo增殖具有明顯的抑制作用[9]。動(dòng)物試驗(yàn)或體外研究已證實(shí)吉非替尼可提高化療、放療及激素治療的抗腫瘤活性[10]。結(jié)腸癌干細(xì)胞在結(jié)腸癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，會(huì)使癌細(xì)胞對(duì)化療產(chǎn)生耐受[11]，直接導(dǎo)致結(jié)腸癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，吉非替尼能夠減少HT29細(xì)胞中SP細(xì)胞比例，提示吉非替尼能抑制腫瘤樣干細(xì)胞增殖。Mimeault等[13]研究發(fā)現(xiàn)吉非替尼能夠抑制前列腺癌細(xì)胞中SP細(xì)胞比例，與多烯紫杉醇、環(huán)巴胺存在協(xié)同效應(yīng)。Ma等[5]研究發(fā)現(xiàn)吉非替尼能通過EGFR/AKT/βcatenin途徑抑制鼻咽癌SP細(xì)胞比例。以上研究結(jié)果均表明吉非替尼可能通過抑制腫瘤干細(xì)胞比例而發(fā)揮抗癌作用。

本研究發(fā)現(xiàn)吉非替尼可抑制人結(jié)腸癌干細(xì)胞中EGF與EGFR結(jié)合，對(duì)HT29具有明顯抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用，從而抑制HT29球囊形成。與常用化療藥物相比，吉非替尼對(duì)HT29中的結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞（包括SP細(xì)胞和CD44+細(xì)胞）更為敏感，其抑制作用呈劑量-反應(yīng)關(guān)系。這表明吉非替尼對(duì)結(jié)腸癌干細(xì)胞具有特異性的作用。Nautiyal等[14]研究發(fā)現(xiàn)EGFR抑制劑能降低結(jié)腸癌細(xì)胞上干細(xì)胞樣標(biāo)志物（CD166和乙醛脫氫酶-1）和miRNA-21的表達(dá)，提示吉非替尼可通過特定的機(jī)制發(fā)揮作用。

綜上所述，EGFR抑制劑對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29中CD44+細(xì)胞及SP細(xì)胞具有生長抑制作用，且可抑制球囊形成。

圖4 不同化療藥物作用48h后HT29中CD44+細(xì)胞的流式細(xì)胞圖（a：空白對(duì)照；b：吉非替尼7.5μmol/L；c：吉非替尼10μmol/L；d：多烯紫杉醇6nmol/L；e：多烯紫杉醇8nmol/L；f：順鉑12μmol/L）

[1]Levin B,Lieberman D A,McFarland B,et al．Screening and surveillance for the early detection of colorectal cancer and adenomatous polyps,2008:a joint guideline from the American Cancer Society,the US Multi-Society Task Force on Colorectal Cancer, and the American College of Radiology[J]．Gastroenterology, 2008,134(5):1570-1595．

[2]Todaro M,Francipane M G,Medema J P,et al．Colon cancer stem cells:promise of targeted therapy[J]．Gastroenterology,2010,138 (6):2151-2162．

[3]Chen J S,Pardo F S,Wang-Rodriguez J,et al．EGFR regulates the side population in head and neck squamous cell carcinoma[J]．Laryngoscope,2006,116(3):401-406．

[4]Soeda A,Inagaki A,Oka N,et al．Epidermal growth factor plays a crucial role in mitogenic regulation of human brain tumor stem cells[J]．J Biol Chem,2008,283(16):10958-10966．

[5]Ma L,Zhang G,Miao X B,et al．Cancer stem-like cell properties are regulated by EGFR/AKT/β-catenin signaling and preferentially inhibited by gefitinib in nasopharyngeal carcinoma[J]．FEBS J,2013,280(9):2027-2041．

[6]Dhawan P,Ahmad R,Chaturvedi R,et al．Claudin-2 expression increases tumorigenicity of colon cancer cells:role of epidermalgrowth factor receptor activation[J]．Oncogene,2011,30(29): 3234-3247．

[7]Kamekura R,Kolegraff K N,Nava P,et al．Loss of the desmosomal cadherin desmoglein-2 suppresses colon cancer cell proliferation through EGFRsignaling[J]．Oncogene,2014,33(36):4531-4536．

[8]Chung T H,Hsiao J K,Hsu S C,et al．Iron oxide nanoparticle-induced epidermal growth factor receptor expression in human stemcellsfortumortherapy[J]．ACSNano,2011,5(12):9807-9816．[9]Yuan H H,Han Y,Bian W X,et al．The effect of monoclonal antibody cetuximab(C225)in combination with tyrosine kinase inhibitor gefitinib(ZD1839)on colon cancer cell lines[J]．Pathology, 2012,44(6):547-551．

[10]Koizumi F,Kanzawa F,Ueda Y,et al．Synergistic interaction between the EGFR tyrosine kinase inhibitor gefitinib("Iressa")and the DNA topoisomerase I inhibitor CPT-11(irinotecan)in human colorectal cancer cells[J]．Int J Cancer,2004,108(3):464-472．

[11]Luraghi P,Reato G,Cipriano E,et al．MET signaling in colon cancer stem-like cells blunts the therapeutic response to EGFR inhibitors[J]．Cancer Res,2014,74(6):1857-1869．

[12]Dieter S M,Ball C R,Hoffmann C M,et al．Distinct types of tumor-initiating cells form human colon cancer tumors and metastases[J]．Cell Stem Cell,2011,9(4):357-365．

[13]Mimeault M,Johansson S L,Henichart J P,et al．Cytotoxic effects induced by docetaxel,gefitinib,and cyclopamine on side population and nonside population cell fractions from human invasive prostate cancer cells[J]．Mol Cancer Ther,2010,9(3): 617-630．

[14]Nautiyal J,Du J,Yu Y,et al．EGFR regulation of colon cancer stem-like cells during aging and in response to the colonic carcinogen dimethylhydrazine[J]．Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2012,302(7):G655-663．

Effect of epidermal growth factor receptor inhibitor on CD44+cells and side population cells of human colon cancer cell lineHT29

ObjectiveTo explore the effect of epidermal growth factor receptor(EGFR)inhibitor on CD44+and side population(SP)cells in colon cancer HT-29 cells．MethodsThe proportion and tumorigenicity of CD44+cells and SP cells was detected by Hoechst33342 staining and flow cytometry．The effects of EGFR inhibitor gefitinib at different concentrations on the sphere formation and the proportion of CD44+cells and SP cells were analyzed．ResultsEGFR inhibitor significantly inhibited the growth of CD44+cells and SP cells．The proportion of CD44+cells in HT29 cells was decreased after treatment with gefitinib for 24h and 48h．The proportion of SP cells in HT29 cells was decreased from(3．82±0．08)%to(0．34±0．03)%after verapamil treatment．It was also decreased significantly after gefitinib treatment．Gefitinib had an inhibitory effect on the sphere formation in HT29 cells．ConclusionThere are CD44+and SP cells subpopulation in colon cancer cells．EGFR inhibitor can inhibit the growth of CD44+and SP cells in colon cancer HT-29 cells,which may provide information for targeting therapy of colon cancer．

CD44+Side-population cellsGefitinibColon cancer

2015-06-29）

（本文編輯：陳丹）

上海市自然科學(xué)基金（09ZR1418700）

200080上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院老年科（鞏超捷）；建德市中醫(yī)院內(nèi)科（唐燕）；上海國際醫(yī)學(xué)中心內(nèi)鏡中心（夏璐）

夏璐，E-mail：xialu@medmail.com.cn