顱腦創(chuàng)傷后大鼠腦組織自噬表達(dá)變化及渥曼青霉素保護(hù)作用的研究

湯崇輝 方戰(zhàn)艦 胡益嵐 童云 鄔芬贊 傅小君 魏曉捷

顱腦創(chuàng)傷后大鼠腦組織自噬表達(dá)變化及渥曼青霉素保護(hù)作用的研究

湯崇輝 方戰(zhàn)艦 胡益嵐 童云 鄔芬贊 傅小君 魏曉捷

目的探索顱腦創(chuàng)傷后大鼠腦組織自噬表達(dá)變化及渥曼青霉素的保護(hù)作用，為臨床治療腦外傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法將120只健康成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組[假手術(shù)組（A組）、顱腦創(chuàng)傷組（B組）、渥曼青霉素治療組（C組）]，每組40只。B、C組使用PinPointTM精密顱腦創(chuàng)傷撞擊器、直徑4mm的打擊頭制作中度創(chuàng)傷性腦損傷模型，其中C組于建模前10min側(cè)腦室注入渥曼青霉素（0．5μg/kg），B組注入含有二甲基亞砜（DMSO）的PBS（25μl/kg）；A組暴露硬腦膜但不撞擊，建模前注入含有DMSO的PBS（25μl/kg）。采用Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白（LC3-Ⅱ，p62）表達(dá)水平，應(yīng)用大鼠行為學(xué)評(píng)分觀察大鼠顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)功能的變化，采用干濕法檢測(cè)腦組織含水量。結(jié)果與A組相比，B組和C組大鼠在顱腦創(chuàng)傷后24、72、168h腦組織LC3-Ⅱ表達(dá)水平增加，p62表達(dá)水平減少，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．05）。與B組相比，C組大鼠在顱腦創(chuàng)傷后24、72、168h腦組織LC3-Ⅱ表達(dá)水平減少，p62表達(dá)水平增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．05）；傷后72、168h腦組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低（均P＜0．05）。顱腦創(chuàng)傷后48、72h，C組大鼠行為學(xué)評(píng)分均高于B組（均P＜0．05）。顱腦創(chuàng)傷后72h，B組和C組腦組織含水量均較A組明顯增加（均P＜0．05），但C組較B組明顯減少（P＜0．05）。結(jié)論渥曼青霉素能明顯抑制顱腦創(chuàng)傷后過度的自噬反應(yīng)，減輕腦水腫，改善大鼠神經(jīng)功能。

顱腦創(chuàng)傷自噬相關(guān)蛋白渥曼青霉素

顱腦創(chuàng)傷發(fā)生率在全身創(chuàng)傷中位居第二，病殘率位居第一[1]。顱腦創(chuàng)傷后保護(hù)神經(jīng)元是臨床治療腦外傷的重要措施[2]。有研究指出尋求作用于神經(jīng)細(xì)胞死亡程序中的上游靶位或多個(gè)靶點(diǎn)才有希望糾正顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)細(xì)胞的變性、壞死，使神經(jīng)功能恢復(fù)正常，從而產(chǎn)生綜合治療效應(yīng)[3]。亦有研究報(bào)道顱腦創(chuàng)傷后腦組織自噬活性明顯增強(qiáng)，或引起神經(jīng)功能缺失加重[4]。故本研究建立顱腦創(chuàng)傷動(dòng)物模型，探討顱腦創(chuàng)傷后大鼠腦組織自噬表達(dá)變化及渥曼青霉素的保護(hù)作用，為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組健康成年雄性SD大鼠120

只，體重（253±16）g，由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[清潔級(jí)，編號(hào)：SCXK（滬）2012-0002]。采用隨機(jī)單位組設(shè)計(jì)法將SD大鼠分為3組，即假手術(shù)組（A組）、顱腦創(chuàng)傷組（B組）和渥曼青霉素治療組（C組），每組40只。每組隨機(jī)選取8只進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分和腦組織水含量檢測(cè)，余下32只進(jìn)行Western blot檢測(cè)；根據(jù)取材時(shí)間點(diǎn)（建模到處死時(shí)間）分為6、24、72、168h亞組，各亞組大鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。所有大鼠飼養(yǎng)于室溫20℃、相對(duì)濕度55%、12h晝夜節(jié)律（光照時(shí)間8：00～20：00）的實(shí)驗(yàn)室中，自由進(jìn)食、飲水，適應(yīng)環(huán)境l周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 渥曼青霉素給藥方法將1mg的渥曼青霉素（19545-26-7，美國(guó)Aladding公司）溶解于1ml二甲基亞砜（DMSO）中，并用0.1mmol/L的PBS稀釋成50ml，配成20μg/ml的渥曼青霉素溶液。將大鼠用2%戊巴比妥納40mg/kg腹腔麻醉后，固定于立體定向儀上；備皮、消毒后作頭皮正中切口并暴露右頂骨，選取大鼠前鹵后0.8mm、矢狀竇右側(cè)1.5mm為腦室穿刺點(diǎn)，穿刺深度4mm。造模前10min，C組大鼠以0.5μg/kg的劑量自右側(cè)側(cè)腦室注入渥曼青霉素溶液；A組和B組大鼠以25μl/kg的劑量注入相同DMSO濃度的PBS作為對(duì)照。1.2.2顱腦創(chuàng)傷動(dòng)物模型的建立給藥時(shí)大鼠已麻醉且固定于立體定向儀上；備皮、消毒后作頭皮正中切口并暴露左頂骨，以冠狀縫后4mm、中線旁開3mm為中心，開直徑5mm的骨窗；使用PinPointTM精密顱腦創(chuàng)傷撞擊器、直徑4mm的打擊頭制作中度創(chuàng)傷性腦損傷模型，打擊速度3m/s，打擊深度2mm，打擊時(shí)間120ms。A組大鼠僅開骨窗，不做打擊。

1.2.3 Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白（LC3、p62）的表用表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩兩比較采用q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平與A組相比，B組和C組大鼠在顱腦創(chuàng)傷后24、72、168h腦組織LC3-Ⅱ表達(dá)水平增加，p62表達(dá)水平減少，LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與B組相比，C組大鼠在顱腦創(chuàng)傷后24、72、168h腦組織LC3-Ⅱ表達(dá)水平減少，p62表達(dá)水平增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；C組大鼠在顱腦創(chuàng)傷后72、168h腦組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低（均P＜0.05），見表1～3和圖1。

2.2 3組大鼠行為學(xué)評(píng)分比較顱腦創(chuàng)傷后48、72h，C組大鼠行為學(xué)評(píng)分均高于B組（均P＜0.05），見表4。

2.3 3組大鼠腦組織含水量比較大鼠顱腦創(chuàng)傷后72h，3組大鼠腦組織含水量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 9.465，P＜0.01）。B組和C組腦組織含水量分別為（78.71±0.98）%、（77.81±0.29）%，均較A組的（76.86± 1.06）%明顯增加（均P＜0.05）；C組大鼠腦組織含水量達(dá)水平每個(gè)亞組大鼠8只，在6、24、72、168h時(shí)點(diǎn)給予2%戊巴比妥納60mg/kg腹腔注射；在深度麻醉狀態(tài)下快速斷頭取腦，取損傷周圍水腫帶交界處腦組織約100mg進(jìn)行蛋白提取和蛋白含量測(cè)定。取40μg蛋白上樣行SDS-PAGE電泳（90V，3h），轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行抗原封閉；加入LC3和p62特異性抗體（用封閉液按1∶1 000稀釋，美國(guó)CST公司），4℃過夜；二抗稀釋液（1∶2 000，北京中杉金橋生物工程有限公司）室溫下孵育2h，ECL反應(yīng)及曝光、顯影；使用美國(guó)Nikon Spot圖像采集處理系統(tǒng)采集圖像，使用Image-ProPlus 5.0專業(yè)圖像分析軟件分析條帶并測(cè)量累積光密度值。以LC3-Ⅱ和p62條帶累積光密度值與GAPDH條帶累積光密度值之比表示自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，并計(jì)算LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值。1.2.4大鼠行為學(xué)評(píng)分大鼠顱腦創(chuàng)傷后3、6、24、48、72h，從平衡能力、翻身、支頭、行走、逃避、四肢活動(dòng)等6個(gè)方面進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分[5]，分值6～21分，分值越低表示對(duì)神經(jīng)功能影響越大。

1.2.5 干濕法測(cè)量腦組織水含量大鼠顱腦創(chuàng)傷后72h，在麻醉下斷頭取腦，取損傷區(qū)腦組織放置電子天平上稱濕重。移于烤箱，100℃烤24h至恒重，稱干重。按Elliott公式計(jì)算腦組織水含量。腦組織水含量=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料較B組明顯減少（P＜0.05）。

表1 3組大鼠顱腦創(chuàng)傷后不同時(shí)點(diǎn)腦組織LC3-Ⅱ的表達(dá)水平

表2 3組大鼠顱腦創(chuàng)傷后不同時(shí)點(diǎn)腦組織p62的表達(dá)水平

表3 3組大鼠顱腦創(chuàng)傷后不同時(shí)點(diǎn)腦組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值

圖1 Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白（LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ和p62）表達(dá)的電泳圖

表4 3組大鼠顱腦創(chuàng)傷后不同時(shí)點(diǎn)的行為學(xué)評(píng)分比較

3 討論

顱腦創(chuàng)傷是一種常見外傷，隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，我國(guó)顱腦創(chuàng)傷發(fā)生率有逐年增加的趨勢(shì)。一般認(rèn)為顱腦創(chuàng)傷引起神經(jīng)功能損傷的機(jī)制主要有2種，即原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。繼發(fā)性顱腦損傷是指急性創(chuàng)傷后發(fā)生的一系列病理生理改變，包括受傷局部發(fā)生微血管損傷，血管破裂出血、痙攣或血栓形成，繼而發(fā)生組織缺血、缺氧、炎癥反應(yīng)和組織水腫，從而激活細(xì)胞內(nèi)酶原，破壞組織中各種膜結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、壞死[6]。因此，掌握顱腦創(chuàng)傷后變化和修復(fù)機(jī)制、有效抑制細(xì)胞死亡是保護(hù)神經(jīng)元、促進(jìn)神經(jīng)功能損傷修復(fù)與重建的首要目標(biāo)。

自噬是一種細(xì)胞通過溶酶體降解途徑調(diào)控的細(xì)胞器和蛋白循環(huán)過程，其激活的主要特征是由雙層膜結(jié)構(gòu)包裹的自噬體或自噬空泡的大量堆積。細(xì)胞自噬已被證實(shí)與衰老、免疫、細(xì)胞死亡和分化有關(guān)，且在神經(jīng)退行性疾病、惡性腫瘤的發(fā)病過程中具有重要意義[7]。細(xì)胞自噬空泡或自噬體結(jié)構(gòu)的增加預(yù)示2種結(jié)果：（1）自噬作為一種早期的自我適應(yīng)性機(jī)制，清除受損的細(xì)胞器和蛋白，通過溶酶體降解途徑提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量來恢復(fù)組織的穩(wěn)態(tài)；（2）過度激活或功能受損的自噬過程會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，即自噬性細(xì)胞死亡，從而加速疾病的發(fā)展和惡化[8]。值得注意的是，近期研究表明神經(jīng)功能損傷過程與細(xì)胞自噬密切相關(guān)[9]，即在受壓迫性損傷的腦組織中，自噬標(biāo)志蛋白LC3明顯增加；在顱腦創(chuàng)傷早期、蛛網(wǎng)膜下腔出血模型中均亦發(fā)現(xiàn)自噬對(duì)腦功能的保護(hù)作用。在神經(jīng)功能損傷后的繼發(fā)性損傷（炎癥、缺血、缺氧等）過程中都存在細(xì)胞自噬過程的激活，但具體機(jī)制和作用存在明顯差異，目前仍未明確[10-11]。

LC3是酵母中自噬相關(guān)基因8在哺乳動(dòng)物中的同源體，能靶向定位于自噬體膜，并始終保留在膜上，是自噬過程中膜動(dòng)力學(xué)很好的標(biāo)志物，也是目前確認(rèn)的唯一可信的自噬體標(biāo)志物。LC3有2種細(xì)胞形式，即LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。細(xì)胞中合成的LC3前體在胞質(zhì)內(nèi)被加工成可溶型LC3-Ⅰ，經(jīng)泛素樣蛋白修飾加工，與自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合成自噬相關(guān)蛋白8-磷脂酰乙醇胺復(fù)合體即LC3-Ⅱ，從而促使自噬泡的形成。LC3-Ⅱ表達(dá)水平、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值大小均可估算自噬水平的高低[12]。p62是特異性經(jīng)自噬途徑降解的一種蛋白，通常情況下其表達(dá)水平與自噬激活程度成反比[13]。渥曼青霉素是一種自繩狀青霉中分離出來的抗真菌類抗生素，可通過抑制PI3KⅢ型的活性，從而抑制自噬[14]。本研究發(fā)現(xiàn)與B組比較，C組大鼠顱腦創(chuàng)傷后LC3-Ⅱ表達(dá)水平、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明顯降低，p62表達(dá)水平有所增加，提示側(cè)腦室預(yù)注入渥曼青霉素能抑制創(chuàng)傷引起的自噬。腦水腫是臨床上常見的繼發(fā)性顱腦損傷，本研究結(jié)果顯示B組大鼠腦組織含水量較A組明顯增高，C組較B組明顯減少。從大鼠行為學(xué)評(píng)分來看，在顱腦創(chuàng)傷后48、72h，C組大鼠的行為學(xué)評(píng)分明顯優(yōu)于B組，說明渥曼青霉素能有效緩解腦水腫，改善預(yù)后。

在不同疾病的不同發(fā)生、發(fā)展階段，細(xì)胞自噬作用具有雙重角色，或保護(hù)作用，或加劇損傷。本研究表明側(cè)腦室預(yù)注入渥曼青霉素能明顯抑制大鼠顱腦創(chuàng)傷后自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平，減輕腦水腫，改善大鼠神經(jīng)功能，為臨床治療腦外傷提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Expression of autophagy-related proteins in brain tissue and neuroprotective effect of wortmannin after traumatic cerebral injury inrats

ObjectiveTo investigate the expression of autophagy-related proteins in brain tissues and the neuroprotective effect of wortmannin after traumatic cerebral injury in rats．MethodsOne hundred and twenty healthy adult male SD rats were randomly divided into 3 groups:the sham operation group(A),the traumatic brain injury group(B)and the wortmannin group (C)with 40 animals in each group．Precision cortical impactor was used to establish medium traumatic brain injury model in group B and C with a hit point of 4mm in diameter．The rats were pretreated with a single intracerebroventricular injection of wortmannin in group C,while with injection of DMSO in group B．The rats in group A received surgery to expose the dura without actual impact,and were injected PBS before the modeling．The expression of microtubule-associated protein 1 light chain3 B(LC3-Ⅱ) and p62 in brain tissues were detected by Western blot．The neurologic function of rats was assessed with behavioral score．Water content was evaluated by dry-wet analysis．ResultsThe expression of LC3-Ⅱwas increased in groups B and C compared with group A at 24h,72h and 168h after injury,the expression of p62 was decreased,and the ratio of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰwas increased(all P＜0．05)．The expression of LC3-Ⅱwas lower in group C than that in group B at 24h,72h and 168h after injury,the expression of p62 was higher(all P＜0．05)in group B and the ratio of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰwas decreased at 72h and 168h (all P＜0．05)compared to group C．At 48h and 72h after injury,the behavioral scores in group C were significantly higher than that in group B(all P＜0．05)．At 72h,the water contents of brain tissue in group B and C were higher than that in group A,while the water content in group C was significantly lower than that in group B(P＜0．05)．ConclusionWortmannin can suppress the excessive autophagy,reduce the brain edema induced by traumatic cerebral injury and improve the neurological function in rats．

Traumatic brain injuryAutophagy related proteinsWortmannin

2016-06-23）

（本文編輯：陳丹）

寧波市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2015A610192）；慈溪市科技計(jì)劃項(xiàng)目（CN2015022）

315300慈溪市人民醫(yī)院神經(jīng)外科

湯崇輝，E-mail：tangegg@163.com