三種甘薯病毒多重RT-PCR檢測(cè)技術(shù)的建立

蔣素華, 程喜梅, 宋彩霞, 許申平, 梁 芳, 崔 波*

(1.鄭州師范學(xué)院生物工程研究所, 鄭州 450044; 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 鄭州 450002; 3.鄭州拓洋實(shí)業(yè)有限公司, 鄭州 450001)

實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)
ExperimentalMethod&Technology

三種甘薯病毒多重RT-PCR檢測(cè)技術(shù)的建立

蔣素華1, 程喜梅3, 宋彩霞2, 許申平1, 梁 芳1, 崔 波1*

(1.鄭州師范學(xué)院生物工程研究所, 鄭州 450044; 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 鄭州 450002; 3.鄭州拓洋實(shí)業(yè)有限公司, 鄭州 450001)

本文根據(jù)GenBank中甘薯G病毒(SPVG)、甘薯卷葉病毒(SPLCV)和甘薯羽狀斑駁病毒(SPFMV)外殼蛋白(CP)基因序列設(shè)計(jì)特異引物,對(duì)多重RT-PCR退火溫度、延伸溫度、模板濃度、引物濃度進(jìn)行改良優(yōu)化,建立能同時(shí)檢測(cè)3種甘薯病毒的多重RT-PCR方法。該方法能同時(shí)擴(kuò)增出SPVG、SPLCV和SPFMV特異片段,其大小分別是800、276和570 bp。測(cè)序結(jié)果表明,擴(kuò)增出的3種病毒序列與相應(yīng)參考序列相似性達(dá)到98%以上。靈敏度分析結(jié)果表明,多重RT-PCR方法能夠檢測(cè)cDNA的量為0.1 ng。應(yīng)用建立的多重RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)田間樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示該方法可以特異、快速、靈敏地同時(shí)檢測(cè)3種甘薯病毒。這些研究結(jié)果可為甘薯病毒檢測(cè)提供參考。

甘薯; 病毒; 多重RT-PCR

甘薯病毒病存在于世界各個(gè)甘薯產(chǎn)區(qū)[1]。甘薯作為無(wú)性繁殖的作物,主要通過(guò)薯塊和秧蔓進(jìn)行繁殖,因此極易感染病毒并且代代相傳。甘薯受到病毒侵染后,正常的生理機(jī)能受到嚴(yán)重的干擾和破壞,造成種性退化與產(chǎn)量的降低[2]。

病毒的檢測(cè)是防治甘薯病毒病的關(guān)鍵,建立高效的病毒檢測(cè)技術(shù)是抗病性早期鑒定、種苗檢疫、確保甘薯無(wú)毒化栽培的前提[3-4]?，F(xiàn)在常用的以病毒侵染特性為基礎(chǔ)的檢測(cè)有多種方法如目測(cè)法、指示植物法、電鏡觀察法、血清學(xué)檢測(cè)法及分子生物學(xué)方法。分子生物學(xué)法既適用于DNA和 RNA 病毒,又適用于類病毒,具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、適用面廣、快速簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。PCR技術(shù)目前已成為甘薯病毒檢測(cè)最常用和最主要的方法之一。近年來(lái),研究者將多重RT-PCR技術(shù)運(yùn)用到甘薯病毒檢測(cè)之中,與普通PCR檢測(cè)方法相比,多重RT-PCR檢測(cè)技術(shù)能夠在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)多種病毒,縮短了檢測(cè)時(shí)間,降低了試驗(yàn)成本,提高了檢測(cè)效率,簡(jiǎn)化了試驗(yàn)步驟[5-6]。目前能夠檢測(cè)包含甘薯卷葉病毒Sweetpotatoleafcurlvirus(SPLCV)、甘薯G病毒SweetpotatovirusG(SPVG)和甘薯羽狀斑駁病毒Sweetpotatofeatherymottlevirus(SPFMV)的多重RT-PCR 反應(yīng)體系少有報(bào)道。本研究建立并優(yōu)化了檢測(cè)3種病毒的多重RT-PCR技術(shù),旨在為甘薯病毒田間檢測(cè)和脫毒苗診斷打下良好的基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 材料

供試甘薯樣品為采自河南地區(qū)帶有典型病毒病癥狀的樣品；陽(yáng)性對(duì)照為經(jīng)PCR驗(yàn)證含有SPVG、SPLCV和SPFMV的樣品;陰性對(duì)照是無(wú)毒組培甘薯苗。樣品經(jīng)液氮速凍后置于-80℃冰箱保存。

1.2 主要試劑

大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、LB固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。TaqDNA聚合酶、dNTPs、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自TaKaRa(大連)公司;克隆載體pGEM-Teasy、多重PCR擴(kuò)增試劑盒、植物總RNA抽提試劑盒、普通瓊脂糖DNA回收試劑盒、IPTG、X-Gal購(gòu)自天根生化科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中報(bào)道的甘薯G病毒(SPVG)、甘薯卷葉病毒(SPLCV)、甘薯羽狀斑駁病毒(SPFMV)[7]的外殼蛋白(CP)基因的保守區(qū)域,應(yīng)用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析,并應(yīng)用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件分別設(shè)計(jì)病毒的特異性引物(表1),引物由上海英濰捷基生物技術(shù)公司合成。

1.4 單一RT-PCR檢測(cè)

參照Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)的說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA,并于-20℃保存。以cDNA為模板,分別利用SPVG、SPLCV、SPFMV的特異引物對(duì)甘薯樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。單一RT-PCR反應(yīng)體系為:10×PCR buffer 2.0 μL,dNTPs(2.5 μmol/L)2.0 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL,TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL,模板cDNA 1.0 μL,補(bǔ)足ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min;94℃變性40 s,53℃退火40 s,72℃延伸40 s,35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min,4℃保存。 PCR反應(yīng)結(jié)束后,用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物,利用凝膠成像儀觀察并拍照記錄。

表1 甘薯病毒的特異性引物

Table 1 Specific primers for sweet potato viruses

病毒Virus引物Primer引物序列(5'→3')Primersequences擴(kuò)增長(zhǎng)度/bpFragmentlengthSPVGG-FG-RGCAGGAAAAACAGGAAACACTGTAGACCATACCTCGGCA800SPLCVLCV-FLCV-RTCCAGGACTATGAGTTCAAGATGCAGTAGTGGGCTCATTGTCGTA276SPFMVFMV-FFMV-RGCGTGATACGAGCAAAGAAAAGGCCAAAAGGGGCATTTACAGCACC570

1.5 多重RT-PCR檢測(cè)體系優(yōu)化和建立

在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中加入3對(duì)引物同時(shí)進(jìn)行PCR,對(duì)多重RT-PCR體系中模板濃度(12、20和28 ng/μL)、退火溫度(51、53和55℃)、延伸溫度(68、70 和72℃)、引物濃度(2.0、6.0和10 μmol/L)等因素進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。在設(shè)定某一影響因素時(shí),其他因素保持不變。

1.6 靈敏度檢測(cè)

取1 μL濃度為1 021 ng/μL的總cDNA按10倍梯度依次稀釋100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6,得到cDNA濃度依次為1 000、100、10、1、0.1、0.01、0.001 ng/μL,取1 μL cDNA為模板分別進(jìn)行單一RT-PCR和多重RT-PCR擴(kuò)增,觀察電泳結(jié)果,分析單一PCR和多重RT-PCR檢測(cè)的靈敏度。

1.7 PCR產(chǎn)物的克隆與序列分析

多重RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用普通瓊脂糖DNA回收試劑盒進(jìn)行回收與純化,純化后的PCR產(chǎn)物與pGEM-Teasy載體進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌,經(jīng)藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定后獲得陽(yáng)性克隆,獲得的陽(yáng)性克隆送上海英濰捷基生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序。利用NCBI上的BLAST和DNAMAN軟件對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.8 多重 RT-PCR的初步應(yīng)用

從田間采集7份感病甘薯樣品,采用優(yōu)化的多重RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

用SPVG、SPLCV、SPFMV特異引物分別對(duì)相應(yīng)病毒的RNA模板進(jìn)行單一RT-PCR擴(kuò)增,分別能夠擴(kuò)增出800、276和570 bp特異性條帶,符合設(shè)計(jì)病毒目的條帶大小(圖1)。

2.2 多重RT-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化分析

分別對(duì)3種病毒的模板濃度、退火溫度、延伸溫度、引物濃度進(jìn)行優(yōu)化(圖2)。模板濃度為12、20、28 ng/μL時(shí),3種病毒都能擴(kuò)增出目的條帶且較亮,綜合考慮,模板濃度可選擇20 ng/μL。3種病毒引物濃度優(yōu)化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)3種(SPVG、SPLCV、SPFMV)引物混合濃度為10.0 μmol/L時(shí),結(jié)果顯示SPFMV片段較強(qiáng),3種引物混合濃度分別為2.0和6.0 μmol/L時(shí),3種病毒擴(kuò)增條帶均較亮,為了節(jié)約成本,選擇引物濃度為2.0 μmol/L。

圖1 單一PCR檢測(cè)三種甘薯病毒Fig.1 Detection of three sweet potato viruses by single PCR

圖2 多重RT-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化Fig.2 Optimization of multiplex RT-PCR reaction system

退火溫度試驗(yàn)結(jié)果顯示,退火溫度為53℃時(shí),3種病毒的目的條帶均較亮,條帶單一;退火溫度為51和55℃時(shí),SPVG目的條帶亮度較暗,綜上分析可知,53℃為最適退火溫度。延伸溫度試驗(yàn)表明,3個(gè)延伸溫度均能擴(kuò)增出3種病毒清晰目的條帶,但是延伸溫度為72℃時(shí)目的條帶最亮,所以選擇72℃作為最佳延伸溫度。

2.3 多重RT-PCR反應(yīng)體系的確立

根據(jù)2.2的結(jié)果,多重RT-PCR反應(yīng)的最佳體系為:10×Primer mix (2.0 μmol/L) 1.2 μL,10×Multi buffer 2.5 μL,Super pure dNTPs (2.5 μmol/L) 2.0 μL,Multi HotStart DNA polymerase 1 μL, cDNA (20 ng/μL) 1 μL,補(bǔ)ddH2O至25 μL。最佳反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性15 min;94℃變性30 s,53℃退火90 s,72℃延伸90 s,40個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。利用建立的反應(yīng)體系對(duì)SPVG、SPLCV、SPFMV進(jìn)行多重RT-PCR擴(kuò)增,3種病毒的目的條帶均清晰分明。

2.4 靈敏度檢測(cè)

將甘薯cDNA模板按照10倍梯度依次稀釋，并分別取1 μL在相同反應(yīng)體系及反應(yīng)條件下進(jìn)行單一RT-PCR和多重RT-PCR，結(jié)果表明，采用單一RT-PCR檢測(cè)SPLCV、SPFMV和SPVG，其cDNA的最低檢測(cè)量分別為0.001、0.01、10 ng(圖3a～c)；而采用多重RT-PCR檢測(cè)，在模板量為0.1 ng時(shí)能檢測(cè)到3種病毒，且條帶清晰(圖3d)，綜上多重RT-PCR檢測(cè)靈敏度為0.1 ng。多重RT-PCR較單一RT-PCR檢測(cè)靈敏度高。

圖3 單一和多重RT-PCR 靈敏度的檢測(cè)Fig.3 Sensitivities analysis of the single and multiplex RT-PCR

2.5 RT-PCR 產(chǎn)物的克隆及測(cè)序

分別切膠回收SPVG、SPLCV、SPFMV的 RT-PCR 產(chǎn)物,與PGEM-Teasy連接后轉(zhuǎn)化DH5α,經(jīng)藍(lán)白斑的篩選和PCR鑒定后獲得陽(yáng)性克隆。將測(cè)序結(jié)果與NCBI上報(bào)道的病毒基因序列對(duì)比,SPFMV擴(kuò)增產(chǎn)物與NCBI上報(bào)道的EU021058.1,EU021062.1的序列同源性達(dá)到98%,SPVG的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與NCBI上報(bào)道的KC771335.1, JQ775879.1序列同源性達(dá)到99%,SPLCV的擴(kuò)增產(chǎn)物與NCBI上報(bào)道的KP069469.1,KJ013566.1的序列同源性達(dá)到99%。

2.6 田間樣品檢測(cè)

利用優(yōu)化后的多重RT-PCR體系檢測(cè)田間甘薯樣品(圖4)。田間甘薯樣品多為幾種病毒復(fù)合性侵染。檢測(cè)結(jié)果表明,樣品2、5、6和7為SPVG、SPLCV、SPFMV復(fù)合侵染,樣品1、3為SPLCV、SPFMV侵染,樣品4受SPVG侵染嚴(yán)重,受SPLCV和SPFMV侵染較輕。本研究建立的多重RT-PCR方法可快速、高效地檢測(cè)侵染甘薯的3種病毒。

圖4 甘薯田間樣品檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Detection results of field sweet potato samples by multiplex RT-PCR

3 結(jié)論與討論

中國(guó)不僅是甘薯種植大國(guó),也是甘薯種質(zhì)資源保存大國(guó)。無(wú)論是甘薯生產(chǎn)還是種質(zhì)資源的保存,建立高效、靈敏的檢測(cè)技術(shù)將為中國(guó)甘薯抗病毒育種,病毒病害防治,脫毒和無(wú)病毒甘薯種薯生產(chǎn)提供有效的檢測(cè)手段[8]。由于甘薯易受多種病毒復(fù)合性侵染,單一RT-PCR的檢測(cè)技術(shù)只能檢測(cè)一種病毒,并費(fèi)時(shí)費(fèi)力[9]。隨著分子病毒學(xué)的發(fā)展,多重RT-PCR技術(shù)和多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)將成為甘薯病毒檢測(cè)的良好發(fā)展方向。

由于多重RT-PCR是在同一反應(yīng)體系中對(duì)多個(gè)病毒同時(shí)進(jìn)行特異性擴(kuò)增,并不是單一RT-PCR簡(jiǎn)單的混合,其穩(wěn)定性沒(méi)有單一RT-PCR高,需要針對(duì)引物、反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進(jìn)行綜合優(yōu)化和反復(fù)試驗(yàn)才能使多重 RT-PCR檢測(cè)體系達(dá)到穩(wěn)定的狀態(tài)[10-12]。其中,引物選擇對(duì)試驗(yàn)的成敗起至關(guān)重要的作用, 既要使引物具有特異性,又要避免引物之間相互影響[13-15]。本研究對(duì)檢測(cè)甘薯SPVG、SPLCV、SPFMV的多重RT-PCR條件進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果顯示,以模板濃度20 ng/μL,退火溫度53℃,延伸溫度72℃,3種病毒混合引物濃度2.0 μmol/L為最佳。應(yīng)用建立的多重 RT-PCR體系對(duì)7份樣品進(jìn)行檢測(cè),經(jīng)反復(fù)驗(yàn)證,該體系可降低檢測(cè)成本,提高檢測(cè)效率,完全可用于甘薯病害田間檢測(cè)。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Establishment of multiplex RT-PCR system for detection of three viruses in sweet potato

Jiang Suhua1, Cheng Ximei3, Song Caixia2, Xu Shenping1, Liang Fang1, Cui Bo1

(1.InstituteofBiotechnology,ZhengzhouNormalUniversity,Zhengzhou450044,China; 2.CollegeofLifeScience,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450002,China; 3.ZhengzhouTuoyangIndustrialCo.,LTD,Zhengzhou450001,China)

Three pairs of specific primers forSweetpotatovirusG,SweetpotatoleafcurlvirusandSweetpotatofeatherymottleviruswere designed based on the conserved region sequences of the coat protein(CP) gene published in GenBank. The crucial factors of multiplex RT-PCR including annealing temperature, extension temperature, template concentration and primers concentration were optimized and a multiplex RT-PCR detection method for three sweet potato viruses was developed. Three specific fragments could be simultaneously amplified in uniplex PCR reaction, with the lengths of 800, 276 and 570 bp, respectively. Sequence analysis indicated that the fragments of three viruses shared at least 98% homology with those of the other related viruses. Sensitivity analysis demonstrated that cDNA of 0.1 ng could be detected by multiplex RT-PCR. This multiplex RT-PCR protocol can simultaneously detect three sweet potato viruses from field samples with high specificity, rapidity and sensitivity.

sweet potato; virus; multiplex RT-PCR

2016-01-29

2016-03-07

河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目(092102110128);鄭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(112PPTGY250-3);鄭州市科技攻關(guān)項(xiàng)目(20150448)

S 435.31, Q 789

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.01.021

* 通信作者 E-mail: laocuibo@163.com