灌木柳無性系莖段組織培養(yǎng)快速繁殖試驗

陳智敏，張 敏，王保松，黃利斌，施士爭，張 玨

（1.河南省水利勘測設計研究有限公司，河南 鄭州 450000；2.江蘇省林業(yè)科學研究院，江蘇 南京 211153）

灌木柳無性系莖段組織培養(yǎng)快速繁殖試驗

陳智敏1，張 敏2*，王保松2，黃利斌2，施士爭2，張 玨2

（1.河南省水利勘測設計研究有限公司，河南 鄭州 450000；2.江蘇省林業(yè)科學研究院，江蘇 南京 211153）

以灌木柳無性系2345、2367的嫩枝為外植體，進行組織培養(yǎng)快速繁殖技術的研究。結果表明：2種灌木柳芽苗誘導最適培養(yǎng)基為WPM＋6-BA 0.4 mg／L＋GA30.1 mg／L＋CH 500 mg／L＋活性炭1 g／L＋蔗糖30 g／L＋卡拉膠6.3 g／L；最適增殖及生根培養(yǎng)基為WPM＋6-BA 0.6 mg／L＋NAA 0.05 mg／L＋CH 500 mg／L＋活性炭1 g／L＋蔗糖30 g／L＋卡拉膠6.3 g／L。將健壯生根苗移栽到含有泥炭和黃心土的基質(zhì)中，其中泥炭與黃心土的體積比為1∶1，成活率大于98%。

灌木柳；組織培養(yǎng)；莖段

柳樹是楊柳科（Salicaceae）柳屬（Salix）植物的通稱，全世界共有526種，主要分布在北半球溫帶地區(qū)。中國有257種，120個變種和33個變型，其中絕大多數(shù)為灌木柳。灌木柳分布廣、生長快、產(chǎn)量高、熱值高、抗逆性強、易于更新以及木材用途廣泛，是防護林、水土保持林、風景林及用材林的重要組成樹種，也是備受關注的能源樹種［1－2］。柳樹種間及其雜交子代的家系、無性系間都存在著非常豐富的遺傳變異，因此進行速生、高生物量、耐鹽堿、抗病蟲害良種選育具有豐富的遺傳基礎［3］。

灌木柳的常規(guī)繁殖以扦插為主，不同種柳樹插條生根能力除了由遺傳因素決定以外，還受到插條年齡、粗度、木質(zhì)化程度、有無生長葉或活動芽等指標的影響，特別是繁殖時間有嚴格的季節(jié)限制。灌木柳還可用播種育苗進行繁殖，但其種子較小，宜隨采隨播，且不能保持良種原有的優(yōu)良特性。組織培養(yǎng)技術是目前林業(yè)生物技術的主要內(nèi)容之一，其主要用途是林木的大規(guī)模繁殖和分子育種［4］。灌木柳高效組織培養(yǎng)再生體系的成功建立，對其生物學研究、遺傳改良和多目標分子育種等工作的開展均具有重要意義。

本試驗以2種灌木柳無性系的莖段為初始外植體，通過分析其離體再生的影響因素，探討最佳組織培養(yǎng)條件，建立高效離體再生體系，為柳樹遺傳轉化研究和分子育種的離體誘導奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所用材料為江蘇省林業(yè)科學研究院遺傳育種研究所雜交培育的2個高生物量灌木柳無性系2345、2367，其來源見表1。

表1 2種灌木柳無性系及其來源

取生長健壯、無病蟲害的1～2年生柳樹枝條，摘除老葉，置于室溫下水培7 d，每天換水1次，以新長出的嫩莖作為外植體。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 將新生嫩莖去葉，剪成長4 cm的小段，用洗衣粉水浸泡20 min，自來水沖洗5次，備用。

1.2.2 接種 將沖洗干凈的外植體轉到超凈工作臺上，用70%（體積百分數(shù)）乙醇和0.1%（質(zhì)量百分數(shù)）HgCl2作為消毒劑，酒精處理時間相同都為40 s，升汞的處理時間分別為2.5，3，4，5 min及6 min，再用無菌水沖洗5～7次。

將消毒處理后的外植體剪去接觸消毒液的傷口部位，留1～2 cm帶芽莖段接種在含有誘導培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中。每處理接種20瓶，每瓶5個外植體。14 d后觀察其污染及成活情況，并統(tǒng)計污染率。

1.2.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 誘導培養(yǎng)基：以WPM為基本培養(yǎng)基，其中均添加CH 500 mg／L，活性炭1 g／L，蔗糖30 g／L和卡拉膠6.3 g／L，在GA3質(zhì)量濃度相同的情況下，添加不同質(zhì)量濃度的6-BA，在6-BA質(zhì)量濃度相同的情況下添加不同質(zhì)量濃度的GA3，探索適合灌木柳叢芽誘導的激素質(zhì)量濃度篩選出合適的培養(yǎng)基配方。

選取相同條件下生長良好的水培得到的嫩莖作為外植體，用篩選出的適宜消毒時間進行消毒，消毒后將其切成長1～2 cm的莖段接種到添加不同質(zhì)量濃度激素的WPM培養(yǎng)基中（培養(yǎng)基中激素配比見表3），將其置于光照度為1 500～2 000 lx，每日光照時間為16 h，溫度（26±2）℃，相對濕度65%～75%的條件培養(yǎng)；重復3次。培養(yǎng)15 d后統(tǒng)計萌芽率。

增殖培養(yǎng)基：將誘導產(chǎn)生的試管苗，剪切成1.5～2.0 cm帶有1～2個腋芽的節(jié)段，轉接于以WPM為基本培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度激素的培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)（培養(yǎng)基中激素配比見表4）。培養(yǎng)環(huán)境同初代培養(yǎng)，培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計增殖系數(shù)。

1.2.4 煉苗 將增殖培養(yǎng)獲得的健壯再生植株開瓶培養(yǎng)2 d進行煉苗，取出試管苗，洗凈，移栽到含有泥炭和黃心土的基質(zhì)中進行煉苗，其中泥炭與黃心土的體積比為1∶1。

1.2.5 結果評測指標 材料接種后，定期觀察記錄生長情況，主要統(tǒng)計指標及計算公式如下［5］：

死亡率／%＝死亡的外植體數(shù)／接種的外植體總數(shù)×100；

污染率／%＝污染的外植體數(shù)／接種的外植體總數(shù)×100；

誘導率／%＝萌發(fā)出葉片的外植體數(shù)／接種的外植體總數(shù)×100；

增殖系數(shù)／%＝增殖后的芽苗數(shù)／接種的外植體總數(shù)×100；

生根率／%＝生根的外植體數(shù)／接種的外植體總數(shù)×100；

移栽成活率%＝移栽成活的植株數(shù)／移栽的植株總數(shù)×100。

2 結果與分析

2.1 不同消毒處理對誘導培養(yǎng)的影響

由結果（見表2）可知，不同滅菌處理對2種灌木柳無性系的死亡率和污染率影響不盡相同。使用質(zhì)量分數(shù)為0.1%的HgCl2消毒5 min，2個品種的成活率均最高，分別為98%和99%，滅菌效果明顯。隨著HgCl2消毒時間的延長，污染率均降低，但對外植體造成了傷害，致使死亡率升高。綜合分析死亡率、污染率的測定結果，2種試驗材料均以體積分數(shù)為75%的乙醇40 s結合質(zhì)量分數(shù)為0.1%的HgCl2處理5 min為最佳消毒方案。

表2 不同方式的滅菌效果

2.2 不同激素質(zhì)量濃度配比對誘導培養(yǎng)的影響

灌木柳2345及2367均在接種后7 d即開始萌芽，從結果（見表3）可以看出，2個品種在各個培養(yǎng)基間的差異均極顯著，在GA3質(zhì)量濃度相同的情況下，誘導率隨著6-BA質(zhì)量濃度的增加均呈現(xiàn)先高后低的趨勢，在6-BA質(zhì)量濃度為0.4 mg／L時，誘導率達96%和95%。在6-BA質(zhì)量濃度相同的情況下，誘導率隨著GA3質(zhì)量濃度的增加而增加，且在各個培養(yǎng)基中均有根產(chǎn)生。

2.3 繼代與增殖培養(yǎng)

組織培養(yǎng)苗的增殖指在無性條件下芽的生長與分化，最后繁殖成完整植株［6－7］。本研究中，2個品種在不同激素組合間的差異均極顯著。生長調(diào)節(jié)物質(zhì)配比對莖芽增殖的影響見表4，在GA3質(zhì)量濃度相同時，隨著6-BA質(zhì)量濃度的增加，增殖系數(shù)呈現(xiàn)先降后增的趨勢。在6-BA質(zhì)量濃度相同時，隨著NAA質(zhì)量濃度的增大增殖系數(shù)逐漸降低。在各個培養(yǎng)基中均有大量根系產(chǎn)生，其中在培養(yǎng)基WPM＋6-BA 0.6 mg／L＋NAA 0.05 mg／L＋CH 500 mg／L＋活性炭1 g／L＋蔗糖30 g／L＋卡拉膠中6.3 g／L的增殖系數(shù)可達4～6倍，生根率高達100%。

表3不同激素組合對灌木柳帶芽莖段萌發(fā)的影響

2.4 馴化移栽

將試管苗株高6～8 cm、根系發(fā)達，根長且葉片展開的再生植株開瓶培養(yǎng)2 d進行煉苗，取出試管苗，洗凈，移栽到含有泥炭和黃心土的基質(zhì)中，其中泥炭與黃心土的體積比為1∶1，然后澆透水，用塑料薄膜覆蓋容器口，保持溫度24～28℃，相對濕度75%～85%，適當遮蔭，培養(yǎng)15～20 d至長出的新葉完全展開后，去掉覆蓋的塑料薄膜，獲得灌木柳苗木，成活率98%以上（見圖1）。

3 結論與討論

酒精對細胞具有較強的穿透性和殺傷性，容易使被處理的材料受到損傷，因此把握好消毒時間是保持材料活性的關鍵。以灌木柳莖段為外植體進行組織培養(yǎng)時，適宜的消毒條件為以70%（體積分數(shù)）乙醇40 s＋0.1%（質(zhì)量百分數(shù)）升汞5 min。

表4不同激素組合對灌木柳帶芽莖段增殖的影響

圖1 灌木柳離體培養(yǎng)與植株再生

2種灌木柳芽苗誘導最適培養(yǎng)基為WPM基本培養(yǎng)基＋6-BA 0.4 mg／L＋GA30.1 mg／L＋CH 500 mg／L＋活性炭1 g／L＋蔗糖30 g／L＋卡拉膠6.3 g／L。在選擇莖段培養(yǎng)基時，激素搭配應以外植體不愈傷化為基本原則，使其直接發(fā)育長成植株。因為若經(jīng)過愈傷組織分化，植株容易發(fā)生變異，所以倡導以不含生長素的培養(yǎng)基進行莖尖分生組織的誘導［8］。

本研究中最適增殖培養(yǎng)基為WPM基本培養(yǎng)基＋6-BA 0.6 mg／L＋NAA 0.05 mg／L＋CH 500 mg／L＋活性炭1 g／L＋蔗糖30 g／L＋卡拉膠6.3 g／L。在該培養(yǎng)基中同時可獲得健壯的生根苗，無需專門的壯苗培養(yǎng)和生根培養(yǎng)階段?；钚蕴靠纱龠M組織培養(yǎng)苗健壯生長，有利于根的生成［9］。組織培養(yǎng)苗根系有避光生長的特性，活性炭可提供暗環(huán)境，為培養(yǎng)基中光敏性生長素的積累提供合適的環(huán)境［10～11］。由于根頂端能產(chǎn)生利于根生長的IAA，但IAA易受光氧化而被破壞，因此活性炭的作用正是通過減弱光照保護了IAA，從而間接地促進了根的生長。本研究也發(fā)現(xiàn)如果不加活性炭植株會變?nèi)?，且根系減少。

近些年，生物技術的不斷發(fā)展與應用為柳樹遺傳育種開創(chuàng)了新的途徑。柳樹組織培養(yǎng)的難易與基因型、培養(yǎng)基的類型和光照溫度等培養(yǎng)條件密切相關［12］。如何繼續(xù)提高芽的增殖系數(shù)和試管苗的成苗速度，建立高效的遺傳轉化體系，還有待于進一步研究。

［1］ 涂忠虞.柳樹育種與栽培［M］.南京：江蘇科學技術出版社，1982：7-9.

［2］ 施士爭，隋德宗，王紅玲，等.灌木柳速生無性系的耐鹽性選擇研究［J］.西北林學院學報，2010（25）：72-77.

［3］ 涂忠虞.柳樹生物量及其利用［J］.江蘇林業(yè)科技，1988，15（2）：1-5.

［4］ 何禹璇，郭東全，錢雪艷，等.大豆體細胞胚胎組織培養(yǎng)及遺傳轉化研究進展［J］.中國農(nóng)學通報，2013，29（36）：21-27.

［5］ 陳正華.木本植物組織培養(yǎng)及其應用［M］.北京：高等教育出版社，1986：24-74.

［6］ Rao M S and Purohit S D.In vitro shoot bud differentiation and plantlet regeneration in Celastrus paniculatus Willd［J］.Biologia plantarum，2006，50（4）：501-506.

［7］ 谷瑞升，蔣湘寧，郭仲璟.植物離體培養(yǎng)器官發(fā)生調(diào)控和控制的研究進展［J］.植物學通報，1999，16（3）：238-244.

［8］ 張富榮，郝文勝，趙永秀.赤霉素在馬鈴薯組織培養(yǎng)中的應用［J］.中國馬鈴薯，2009，23（4）：235-238.

［9］ 王平紅.活性炭對藍莓組培苗生根的影響［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2010，38（22）：11762-11763.

［10］韓文璞，袁明蓮.活性炭在甜櫻桃組織培養(yǎng)中的應用［J］.落葉果樹，2001（3）：7-8.

［11］劉根林，梁珍海，朱 軍.活性炭在植物組織培養(yǎng)中的作用概述［J］.江蘇林業(yè)科技，2001，28（5）：46-48.

［12］關亞麗，陳 英，黃敏仁.簸箕柳組織培養(yǎng)初步研究［J］.海南師范大學學報，2009，22（2）：204-208.

S792.12；Q943.1

A

10.3969／j.issn.1001－7380.2014.05.007

1001－7380（2014）05－0027－03

2014-07-07

國家自然科學基金“NaCl脅迫下一氧化氮調(diào)控灌木柳液泡膜H＋－ATPase的分子機制”（31300515）；江蘇省自然科學基金“柳樹H＋－ATPase響應NaCl脅迫的分子機制”（BK2011872）

陳智敏（1987－），女，河南商丘人，碩士，主要從事水環(huán)境植物配置研究與設計。

*通信作者：張 敏（1980－），女，內(nèi)蒙古人，副研究員，博士，主要從事植物逆境生物學及林木花卉良種繁育研究。