北美楓香“秋霞紅”組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)研究

何海燕，何小弟，董筱昀

（1.揚(yáng)州綠地生態(tài)農(nóng)林建設(shè)咨詢有限公司，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州大學(xué)，江蘇 揚(yáng)州 225009；3.江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院，江蘇 南京 211153）

北美楓香“秋霞紅”組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)研究

何海燕1，何小弟2，董筱昀3

（1.揚(yáng)州綠地生態(tài)農(nóng)林建設(shè)咨詢有限公司，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州大學(xué)，江蘇 揚(yáng)州 225009；3.江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院，江蘇 南京 211153）

通過正交試驗(yàn)等方法對北美楓香“秋霞紅”組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：在江蘇揚(yáng)州最佳取材時(shí)間為4月下旬，選取外植體，經(jīng)過0.1%HgCl2消毒12 min滅菌，成活率為78.7%；添加VC35 mg／L能有效預(yù)防試管苗褐變的發(fā)生，增加培養(yǎng)容器的透氣性可減少試管苗玻璃化發(fā)生；2／3MS附加TDZ、BA、NAA等植物生長調(diào)節(jié)劑可促進(jìn)試管苗增殖和生長，其中TDZ 0.2 mg／L＋BA 1.0 mg／L＋I(xiàn)BA 0.1 mg／L＋VC35 mg／L組合最適宜增殖與生長培養(yǎng)，增殖倍數(shù)達(dá)4.5，生長高度為3.8 cm；適宜的生根培養(yǎng)基為1／3 MS＋I(xiàn)BA 0.5 mg／L＋NAA 0.3 mg／L＋AC 3 000 mg／L＋S 2%，生根率可達(dá)92%；經(jīng)生根的試管苗移栽于泥炭、黃心土為7∶3（V∶V）的混合基質(zhì)，控制溫度23～30℃，相對濕度90%，保濕12～18 d，其間適當(dāng)遮蔭，30 d后成活率達(dá)90.8%。

北美楓香“秋霞紅”；組織培養(yǎng)；褐變苗；玻璃苗；快速繁殖

北美楓香（Liquidambar styraciflua），為金縷梅科楓香屬落葉大喬木，樹高15 m以上。樹冠廣卵形，干性挺直。葉互生，掌狀5裂；春、夏色綠，10月上旬葉色始紅，漸靚艷醉人。喜溫暖濕潤氣候，喜光照、耐少量蔽陰；土壤適應(yīng)性強(qiáng)，耐干旱，但在潮濕的中性土壤上生長較好。株形偉岸，孤植、叢植、群植均相宜，可作景觀林、用材林和防護(hù)林。純林者，霜侵紅葉，層林盡染。行道樹培育，枝下高度宜控制為2.8～3.0 m；景觀樹培育，枝下高度宜控制在0.8～1.0 m，以增強(qiáng)植株效果。

北美楓香又稱膠皮楓香樹，原產(chǎn)于北美洲，在美國東南部有大量分布，2004年經(jīng)由美克爾國際集團(tuán)引進(jìn)，種源地為阿拉巴馬州。實(shí)生播種繁殖后選育植株生長健壯、主要觀賞形狀優(yōu)良的區(qū)系，經(jīng)連續(xù)3 a對，秋色葉性狀觀察，初選出變異單株，經(jīng)嫁接繁殖培育，逐步形成區(qū)試群體。北美楓香“秋霞紅”2013年通過江蘇省林木品種審定委員會(huì)認(rèn)定，林木良種編號蘇R-SV-LS-010-2013。

北美楓香以傳統(tǒng)的繁殖方法如播種、扦插等繁殖為主［1－5］。北美楓香“秋霞紅”系選育的林木新品種，數(shù)量少，為保持新品種的優(yōu)良性狀，并在短期內(nèi)獲得大量植株，本文對該新品種組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了探索，試圖加快繁殖，滿足園林綠化市場、美麗中國建設(shè)需求。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選擇經(jīng)過篩選優(yōu)良單株生長健壯的當(dāng)年生枝條新稍。

1.2 外植體滅菌

采用經(jīng)選育的北美楓香‘秋霞紅’春季萌發(fā)的新稍為外植體，然后將選取的外植體剪切成長3～5 cm的小段，經(jīng)70%酒精消毒35 s，然后置于消毒液中。消毒液分別采用A1：17%的H2O2；A2：0.1% HgCl2；A3：10%Ca（ClO）2；消毒時(shí)間分別采用B1：10 min；B2：12 min；B3：14 min，隨機(jī)區(qū)組排列，表面消毒后用無菌水沖洗3～5次，瀝干水后迅速將帶腋芽的莖段接到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接1個(gè)，每次20瓶，每組重復(fù)3次，30 d后統(tǒng)計(jì)污染率、死亡率和成活率。

1.3 植物生長調(diào)節(jié)劑正交培養(yǎng)試驗(yàn)

誘導(dǎo)的無菌芽長至1 cm左右時(shí)，切下接入增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。以2／3 MS為基本培養(yǎng)基，選定TDZ 0.1，0.2，0.4 mg／L、BA 0.5，1.0，2.0 mg／L、IBA0.05，0.1，0.2 mg／L 3種植物生長調(diào)節(jié)劑進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，接種培養(yǎng)30 d時(shí)觀測試管苗增殖倍數(shù)和生長高度。

1.4 VC質(zhì)量濃度與封口材料處理試驗(yàn)

在不同質(zhì)量濃度的VC處理減輕試管苗褐變試驗(yàn)中，采用15，25，35，45 mg／L 4個(gè)質(zhì)量濃度梯度，不加VC為對照（CK）；透氣性對試管苗玻璃苗影響的試驗(yàn)中，采用透氣封口膜，規(guī)格為4孔（12 cm×12 cm）與封閉封口膜為材料進(jìn)行培養(yǎng)，具體試驗(yàn)為：處理Ⅰ：培養(yǎng)瓶封閉式封口材料；處理Ⅱ：培養(yǎng)瓶透氣式封口材料。上述試驗(yàn)培養(yǎng)基均為2／3 MS＋TDZ 0.2 mg／＋BA 1.0 mg／L＋I(xiàn)BA 0.1 mg／L，瓊脂用量0.7%，pH5.8。

1.5 生根培養(yǎng)

試管苗生根培養(yǎng)基試驗(yàn)是將生長健壯的北美楓香‘秋霞紅’試管苗，接種在1／3MS附加不同質(zhì)量濃度的生長素NAA，IBA以及不同質(zhì)量濃度的活性炭（AC）配比的培養(yǎng)基上，進(jìn)行生根培養(yǎng)。采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9（34）的方案［5］，觀察根的分化過程，調(diào)查生根數(shù)、根長、生根率等指標(biāo)，選擇最佳生根培養(yǎng)基。每處理20瓶，每瓶5個(gè)芽苗。

1.6 組織培養(yǎng)苗移栽管理

試管苗移栽試驗(yàn)是將已生根的試管小苗，移栽于泥炭：黃心土為6∶4，5∶5，7∶3（V∶V）3種混合基質(zhì)中，控制環(huán)境溫度25～30℃，相對濕度85%～90%，保濕、遮蔭20，35 d后統(tǒng)計(jì)成活率。

上述除有說明外，所有培養(yǎng)基均加入3%的蔗糖和0.7%卡拉膠，pH值5.8，培養(yǎng)室溫度為26～28℃，光照度2 000 lx左右，光照時(shí)間13 h／d。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒方法對北美楓香‘秋霞紅’外植體消毒效果的影響

消毒藥劑和消毒時(shí)間對外植體滅菌效果試驗(yàn)結(jié)果（見表1）表明：處理間、消毒劑、消毒時(shí)間及消毒藥劑與消毒時(shí)間的滅菌效果差異顯著。說明北美楓香‘秋霞紅’外植體滅菌應(yīng)考慮消毒時(shí)間和消毒藥劑才有助于提高成活率。本試驗(yàn)以A2B3處理效果最好，即0.1%HgCl2消毒12 min的成活率達(dá)78.7%。

2.2 植物生長調(diào)節(jié)劑正交組合對北美楓香‘秋霞紅’試管苗生長的影響

植物生長調(diào)節(jié)劑正交組合對北美楓香‘秋霞紅’試管苗生長的影響試驗(yàn)結(jié)果（見表2）表明，TDZ與BA質(zhì)量濃度是決定試管苗增殖主要因子，由極差數(shù)據(jù)分析得知，TDZ的作用最大，其極差值最大，其次為BA，影響最小的是IBA。組合5的芽苗增殖與生長效果最好，增殖倍數(shù)達(dá)4.5，生長高度為3.8 cm，且試管苗生長較壯；組合7和組合8，芽苗增殖倍數(shù)雖也較大，但其芽苗生長高度大大下降，芽苗生長弱，葉形不正常，莖細(xì)弱，出現(xiàn)褐變苗。所以，北美楓香‘秋霞紅’芽苗增殖最佳組合為2／3 MS＋BA 1.0 mg／L＋TDZ 0.2 mg／L＋I(xiàn)BA 0.1 mg／L＋蔗糖3.0%。

表1 不同消毒劑種類和不同消毒時(shí)間對外植體消毒的影響

表2 北美楓香‘秋霞紅’增殖的正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析

2.3 VC質(zhì)量濃度與封口材料處理對北美楓香‘秋霞紅’試管苗生長影響

從不同質(zhì)量濃度的VC對北美楓香‘秋霞紅’試管苗褐變及其生長的影響（見表3）可看出，在供試質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，褐變苗發(fā)生率隨VC質(zhì)量濃度的增加顯著降低，且各處理間差異顯著。其中對照（CK）和處理1即VC的質(zhì)量濃度為15 mg／L時(shí)，褐變苗發(fā)生率極顯著高于其他處理，處理2也具有較多的褐變產(chǎn)生。較高質(zhì)量濃度的VC處理可減少褐變的發(fā)生，處理3，4差異不顯著而且生長情況類似，故可選VC35 mg／L作為繼代培養(yǎng)適宜的質(zhì)量濃度，采用處理3較為經(jīng)濟(jì)。

表3 不同VC質(zhì)量濃度對北美楓香‘秋霞紅’組織培養(yǎng)苗褐變及其生長的影響

培養(yǎng)容器內(nèi)的濕度和透光率等因素直接影響試管苗的生長，封口材料透氣性不同造成培養(yǎng)物所處的微環(huán)境差異。通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：處理Ⅰ玻璃苗率為

28.38%，處理Ⅱ?yàn)?2.43%，處理3，4玻璃化苗率較低。說明處于封閉狀態(tài)下，容器內(nèi)部微環(huán)境濕度大，氣體缺乏交換，不利試管苗的健壯生長，容器內(nèi)生長的芽苗細(xì)弱，葉色淺。用透氣膜為封口材料，由于具有良好的透氣性，降低了微環(huán)境中的濕度，利于試管苗呼吸交換，容器內(nèi)生長的芽苗葉色濃綠、健壯。

2.4 北美楓香‘秋霞紅’試管芽苗生根培養(yǎng)基篩選

將經(jīng)壯苗培養(yǎng)長至高為2～3 cm的北美楓香‘秋霞紅’試管芽苗，接入生根培養(yǎng)基試驗(yàn)，生根培養(yǎng)12 d后，基部出現(xiàn)愈傷組織，16 d后可見基部分化出許多根點(diǎn)，20 d后則生長白色小根，30 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果并直觀分析，結(jié)果見表4。

表4 北美楓香‘秋霞紅’生根正交試驗(yàn)結(jié)果的直觀分析

從表4結(jié)果表明，對北美楓香‘秋霞紅’生根影響最大的是IBA，其次是NAA，AC的質(zhì)量濃度。配方5與配方6的生根率分別達(dá)到92%和91%，但從平均根長和平均根數(shù)來看，配方5∶1／3 MS＋I(xiàn)BA 0.5 mg／L＋NAA 0.3 mg／L＋AC 3 000 mg／L為最佳生根培養(yǎng)基。

2.5 北美楓香‘秋霞紅’組織培養(yǎng)苗的移栽

移栽試驗(yàn)結(jié)果表明，在相同條件下，基質(zhì)對北美楓香‘秋霞紅’試管苗移栽成活有影響。成活所需時(shí)間，成活率都有明顯差異。泥炭、黃心土配比為7∶3（V∶V），成活所需時(shí)間30 d，成活率到90.8%，為最佳配比的混合基質(zhì)。

表5 2種基質(zhì)配比對北美楓香‘秋霞紅’試管苗移栽成活的影響

3 小結(jié)與討論

（1）本試驗(yàn)采用0.1%HgCl2消毒12 min的滅菌，成活率達(dá)78.7%，效果較好。

（2）本試驗(yàn)條件下，北美楓香‘秋霞紅’芽苗增殖最佳組合為2／3 MS＋BA 1.0 mg／L＋TDZ 0.2 mg／L＋I(xiàn)BA 0.1 mg／L＋VC35 mg／L＋蔗糖3.0%。

（3）添加不同質(zhì)量濃度的VC試驗(yàn)表明，VC可以減輕試管苗褐變的發(fā)生。褐變是由于植物組織中的多酚氧化酶（PPO）被激活，使細(xì)胞的代謝發(fā)生變化。在褐變過程中，酚類物質(zhì)被氧化后產(chǎn)生醌類物質(zhì)，這些物質(zhì)呈棕褐色，并會(huì)逐漸擴(kuò)散到培養(yǎng)基中，抑制其他酸的活性，毒害培養(yǎng)的材料，使組織和培養(yǎng)基變褐甚至變黑。在減輕褐變發(fā)生時(shí)常采用抗氧化劑如VC及活性炭等處理［6－7］。本試驗(yàn)條件下，VC可減輕北美楓香‘秋霞紅’離體培養(yǎng)中褐變的發(fā)生，在本試驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)，最佳用量為35 mg／L。

（4）通過不同封口材料培養(yǎng)瓶培養(yǎng)試驗(yàn)表明，試管苗生長效果的差異很大程度上是由于透氣狀況不同引起的。其原因與較高質(zhì)量濃度的細(xì)胞分裂素類物質(zhì)導(dǎo)致玻璃化原因類似［8－13］。在封閉狀況下，容器內(nèi)外氣體得不到有效的交換，無法滿足試管苗生長需求，導(dǎo)致玻璃化。采用透氣類型的封口膜，改善了通氣狀況，促進(jìn)了呼吸，使ATP供給較為豐富，滿足了試管苗對ATP以及呼吸代謝產(chǎn)物的要求，試管植株生長健壯。

（5）本試驗(yàn)條件下，IBA對北美楓香‘秋霞紅’生根影響最大，其次是NAA，AC的濃度。平均根長和平均根數(shù)來看，1／3 MS＋I(xiàn)BA 0.5 mg／L＋NAA 0.3 mg／L＋AC 3 000 mg／L為最佳生根培養(yǎng)基。

（6）北美楓香‘秋霞紅’組織培養(yǎng)苗移栽基質(zhì)以泥炭、黃心土為7∶3（V∶V）較好。溫度控制在23～ 30℃之間，濕度在移栽前后5～7 d控制在92%以上，7 d后控制在85%～90%，30 d即可成活，成活率達(dá)90.8%。

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Q949.751.4；Q813.1＋2

A

10.3969／j.issn.1001－7380.2014.05.006

1001－7380（2014）05－0023－04

2014-08-10

江蘇省林業(yè)三新工程項(xiàng)目“北美楓香等新優(yōu)彩色樹種引繁及優(yōu)質(zhì)苗木栽培技術(shù)推廣示范”（LYSX［2013］52）

何海燕（1977－），女，江蘇揚(yáng)州市人，工程師，大學(xué)本科畢業(yè)，主要從事園林綠化工程管理。