異體CIK聯(lián)合血漿置換干預(yù)晚期原發(fā)性肝癌的臨床研究

侯俊杰，楊 影，李孝男，倪志強(qiáng)，周 穎，江顯卓，譚 巖，方艷秋

(吉林省人民醫(yī)院 醫(yī)學(xué)診治實(shí)驗(yàn)中心，吉林 長(zhǎng)春130021)

異體CIK聯(lián)合血漿置換干預(yù)晚期原發(fā)性肝癌的臨床研究

侯俊杰，楊 影，李孝男，倪志強(qiáng)，周 穎，江顯卓，譚 巖，方艷秋*

(吉林省人民醫(yī)院 醫(yī)學(xué)診治實(shí)驗(yàn)中心，吉林 長(zhǎng)春130021)

目的 研究異體CIK聯(lián)合血漿置換臨床治療肝癌的效應(yīng)和機(jī)制。方法 分離健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，加入細(xì)胞因子誘導(dǎo)成CIK細(xì)胞，體外培養(yǎng)擴(kuò)增。病例均給予內(nèi)科綜合支持治療情況下，隨機(jī)分為異體CIK細(xì)胞治療組和異體CIK+血漿置換治療組。應(yīng)用ELISA法比較二組治療前后血漿中IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β、VEGF的濃度變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)二組治療前后患者外周血中CD3+和CD4+細(xì)胞比例、CD4+/CD8+比值、CD8+細(xì)胞比例；比較二組患者的生存質(zhì)量、無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)、總生存期(OS)。結(jié)果 二組異體CIK的抗腫瘤免疫效應(yīng)均上調(diào)，異體CIK+血漿置換治療組免疫上調(diào)顯著，與同時(shí)下調(diào)IL-4、IL-10和TGF-β、VEGF的血漿濃度有關(guān)(P<0.05)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，治療后的患者外周血中CD3+、CD4+細(xì)胞比例和CD4+/CD8+比值明顯上升，CD8+細(xì)胞比例下降，以異體CIK+血漿置換治療組更為顯著(P<0.05)；PFS長(zhǎng)于單純異體CIK細(xì)胞治療組(P<0.05)，OS無(wú)延長(zhǎng)(P>0.05)；生活質(zhì)量顯著優(yōu)于異體CIK細(xì)胞治療組(P<0.01)。結(jié)論 通過(guò)應(yīng)用異體CIK細(xì)胞過(guò)繼免疫治療+血漿置換方案，可抑制和清除免疫抑制性細(xì)胞和免疫抑制因子，上調(diào)CIK細(xì)胞免疫效應(yīng)及數(shù)量，可抑制原發(fā)性肝癌進(jìn)展，改善患者生活質(zhì)量。

CIK；肝癌；血漿置換；細(xì)胞因子

(ChinJLabDiagn,2017,21:0050)

肝癌是世界上第五大常見(jiàn)實(shí)質(zhì)性惡性腫瘤和第三大癌癥致死原因，每年超過(guò)60萬(wàn)人因疾病進(jìn)展而死于該病[1]。目前傳統(tǒng)的化學(xué)治療和放射治療效果不佳，手術(shù)是有效治療的手段，然而只有小部分患者獲益，靶向治療單純應(yīng)用獲益有限[2]，由于治療手段有限，因此總體預(yù)后極差。

肝癌的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移與血液及腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子上調(diào)具有直接相關(guān)性，如IL-10、IL-4、TGF-β、VEGF等，實(shí)驗(yàn)證明，在肝癌患者的腫瘤細(xì)胞、血漿和尿液中可檢測(cè)到上述因子的水平明顯升高，由于體內(nèi)血漿量最大，其內(nèi)細(xì)胞因子水平最高[3]。腫瘤細(xì)胞可通過(guò)多種途徑逃避機(jī)體免疫監(jiān)視系統(tǒng)，包括腫瘤對(duì)T淋巴細(xì)胞的功能抑制，誘導(dǎo)分化出免疫抑制細(xì)胞如髓源性抑制細(xì)胞調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等，同時(shí)腫瘤可導(dǎo)致免疫抑制因子如IL-10、IL-4、TGF-β、VEGF的上調(diào)等，諸多前臨床實(shí)驗(yàn)已證明抑制或清除髓源性抑制細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和免疫抑制因子等，同時(shí)提高CIK細(xì)胞免疫效應(yīng)及數(shù)量，可提高CIK細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)[4]。血漿置換(PE)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于臨床，它通過(guò)暫時(shí)替代肝臟的功能，分離血細(xì)胞和血漿，從而將血液中的免疫抑制因子、內(nèi)毒素、膽紅素等有害物質(zhì)清除，改善機(jī)體內(nèi)環(huán)境，在重癥肝病的治療中得到應(yīng)用[5]。因此，通過(guò)輸注異體CIK細(xì)胞聯(lián)合血漿置換(PE)技術(shù)，清除血漿中的免疫抑制因子，同時(shí)提高CIK細(xì)胞免疫效應(yīng)及數(shù)量，改變了腫瘤的微環(huán)境，有可能成為晚期肝癌免疫治療的有效輔助手段，為臨床治療晚期原發(fā)性肝癌提供新策略。收集2014年5月-2015年5月間在本院就診的60例原發(fā)性肝癌患者，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2014年5月-2015年5月間在本院就診的60例原發(fā)性肝癌患者，符合2009 年發(fā)布的《原發(fā)性肝癌規(guī)范化診治專(zhuān)家共識(shí)》的標(biāo)準(zhǔn)。年齡>18歲，肝功能為Child-Pugh B級(jí)或C級(jí)，預(yù)計(jì)生存期超過(guò)2個(gè)月；無(wú)生物制品過(guò)敏史，無(wú)嚴(yán)重細(xì)菌、病毒感染，非妊娠及哺乳期患者；自愿入組，患者或授權(quán)家屬簽署治療知情同意書(shū)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：出現(xiàn)肝性腦病、消化道出血等嚴(yán)重并發(fā)癥，其他病毒感染，酒精性、藥物性肝損傷，嚴(yán)重凝血機(jī)制障礙，合并心、肝、腎、造血及代謝系統(tǒng)嚴(yán)重原發(fā)性疾病或嚴(yán)重全身感染者。

在60例原發(fā)性肝癌患者中，男性56例，女性4例；年齡28-79歲，平均年齡(53.3±10.2)歲。按隨機(jī)自愿原則，分為異體CIK治療組(CIK group)30 例、異體CIK+血漿置換治療組(CIK+ Plasma exchange group，CIK-PE)30例。二組臨床特征均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.2 方法

1.2.1 CIK細(xì)胞的培養(yǎng)和治療方法 采集健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞，F(xiàn)icoll淋巴細(xì)胞分離液梯度離心，收集白膜層的單個(gè)核細(xì)胞，以生理鹽水洗滌3次后懸浮于RPMI 1640(Gibco公司，美國(guó))中，5% CO2、37℃孵箱中放置2小時(shí)，調(diào)整非貼壁細(xì)胞密度為2×106/毫升，用含10%胎牛血清(EXCELL?公司，上海)的初始培養(yǎng)基在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，并在培養(yǎng)基中添加 IFN-γ 1 000 U/ml 和rhIL-2 1 000 U/ml(均購(gòu)自北京雙鷺?biāo)帢I(yè)有限公司，北京)以及50 ng/ml抗人CD3單克隆抗體(T&L生物公司，北京)。每2 d按照細(xì)胞濃度添加新鮮培養(yǎng)基及rhIL-2(1 000 U/ml)，培養(yǎng)至7 d后收集細(xì)胞。收集的CIK細(xì)胞約1×109-1×1010/ml，細(xì)胞存活率在95%以上。在符合GLP標(biāo)準(zhǔn)的無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)配制成CIK細(xì)胞懸液，采血后培養(yǎng)每天抽取培養(yǎng)上清，檢測(cè)細(xì)菌、真菌、支原體、解脲及內(nèi)毒素等，所有樣本檢測(cè)結(jié)果為陰性后回輸，直至疾病進(jìn)展。

1.2.2 血漿置換治療方法 應(yīng)用日產(chǎn)KURARAY-KM8800型血漿置換儀，股靜脈常規(guī)消毒穿刺后，置入雙腔導(dǎo)管并固定，建立血液通路，每次置換2 500-3 000 mL的同型血漿，每周1 次。

1.2.3 細(xì)胞因子檢測(cè) ELISA法檢測(cè)兩組治療前后細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、IL-1O、TGF-β及VEGF的濃度。

1.2.4 免疫功能檢測(cè) 收集患者治療前后外周血細(xì)胞，配成1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，每孔2 ml，每組3復(fù)孔，按照說(shuō)明書(shū)，加入相應(yīng)的流式抗體，經(jīng)流式細(xì)胞儀(FACS)檢測(cè)CD3+細(xì)胞、CD4+細(xì)胞、CD4+/CD8+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞比例，Cell Quest軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 治療前后細(xì)胞因子水平的比較

在治療前，兩組患者的IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β及VEGF水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在治療2療程后，兩組患者的IFN-γ無(wú)明顯下降，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而IL-4、IL-10、TGF-β及VEGF水平均有不同程度的下降，其中聯(lián)合治療組患者的下降程度明顯高于單純異體CIK組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 治療前后細(xì)胞因子水平的比較

注：*P<0.05 (治療前 vs 治療后)；#P<0.05 (CIK vs CIK-PE)

2.2 治療前后免疫功能比較

治療后兩組患者CD3+和CD4+細(xì)胞比例和CD4+/CD8+比值明顯上升，CD8+細(xì)胞比例下降，CIK治療前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與單純異體CIK治療組比較，異體CIK聯(lián)合血漿置換治療更能改善患者的免疫功能，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 生存期比較

聯(lián)合治療組腫瘤無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)長(zhǎng)于單線(xiàn)異體CIK細(xì)胞治療組，差異顯著(P<0.05)；聯(lián)合治療組總生存期優(yōu)于單純異體CIK細(xì)胞治療組，但兩者差異不顯著。見(jiàn)表3。組內(nèi)比較，兩組患者治療后的KPS評(píng)分均顯著高于治療前(P<0.05)；組間比較，治療前兩組患者的KPS評(píng)分之間的差異均不顯著(P>0.05)，治療后，聯(lián)合治療組KPS評(píng)分顯著高于異體CIK細(xì)胞治療組(P<0.01)，見(jiàn)表4。

表2 兩組患者治療前后的免疫功能變化情況比較

注：*P<0.05 (治療前 vs 治療后)；#P<0.05 (CIK vs CIK-PE)

表3 兩組患者的

注：*P<0.05 (治療前 vs 治療后)；#P<0.05 (CIK vs CIK-PE)

表4 兩組患者治療前后的KPS評(píng)分變化情況比較

注：*P<0.05 (治療前 vs 治療后)；#P<0.05 (CIK vs CIK-PE)

3 討論

隨著腫瘤治療學(xué)的不斷發(fā)展及進(jìn)步，腫瘤免疫治療備受關(guān)注，于2013年被Science評(píng)選為10項(xiàng)重大突破之首。其中細(xì)胞免疫治療異軍突起，通過(guò)改善患者的免疫系統(tǒng)功能，達(dá)到間接治療腫瘤的目的，成為腫瘤免疫治療的主要方案。細(xì)胞免疫治療主要包括細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷(CIK)細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)、自然殺傷(NK)細(xì)胞、淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)、腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞(TIL)等[6]。目前臨床容易制備且應(yīng)用廣泛的就是CIK細(xì)胞，其具有腫瘤細(xì)胞殺傷活性的NK樣T細(xì)胞作用，臨床應(yīng)用安全，能夠更廣泛的適合臨床治療需求[7，8]，但在CIK細(xì)胞治療腫瘤的療效仍受多種因素限制，如腫瘤患者體內(nèi)存在大量細(xì)胞免疫抑制因子IL-4、IL-10及促腫瘤生長(zhǎng)因子TGF-β及VEGF等，影響CIK細(xì)胞治療療效[9]。

IL-10主要是一種免疫抑制因子，通過(guò)多種途徑抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫效應(yīng)[10]。VEGF具有促腫瘤血管新生作用，同時(shí)干擾樹(shù)突細(xì)胞、B細(xì)胞和T細(xì)胞的抗原呈遞作用，引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸。腫瘤細(xì)胞同時(shí)又具有分泌的IL-10、VEGF和TGF-B等功能，能刺激巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞分化，反過(guò)來(lái)分化形成的M2型巨噬細(xì)胞于腫瘤細(xì)胞相互作用，共同分泌大量的IL-10、VEGF和TGF-β因子，抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫效應(yīng)[11]。IL-4為另一種免疫抑制因子，其主要通過(guò)3種負(fù)向調(diào)節(jié)方式抑制γδT細(xì)胞的免疫應(yīng)答作用:①抑制γδT細(xì)胞的活化作用；②促使γδ T細(xì)胞向Vδ1 T細(xì)胞偏倚，產(chǎn)生的Vδ1 T細(xì)胞能夠大量分泌IL-10，間接抑制具有強(qiáng)細(xì)胞毒活性的Vδ2 T細(xì)胞的增殖，從而抑制γδT細(xì)胞的抗腫瘤活性[12]；③IL-4還抑制Vδ1T細(xì)胞表達(dá)殺傷性受體NKG2D[8]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)回輸CIK細(xì)胞治療、血漿置換等治療，觀察發(fā)現(xiàn)，患者CIK治療前后，CD3+和CD4+細(xì)胞比例和CD4+/CD8+比值明顯上升，CD8+細(xì)胞比例下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與單純異體CIK治療組比較，異體CIK聯(lián)合血漿置換治療免疫功能改善更為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以上結(jié)果說(shuō)明CIK細(xì)胞治療可以改善患者免疫功能，在清除免疫抑制因子和促瘤因子的條件下，CIK細(xì)胞治療更能發(fā)揮其抗腫瘤的免疫效應(yīng)。在治療2療程后，兩組患者的IFN-γ無(wú)明顯下降，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示血漿置換后雖然下調(diào)了IFN-γ量，但CIK細(xì)胞輸注后能彌補(bǔ)細(xì)胞因子IFN-γ量的不足，一定程度上上調(diào)了免疫功能，而IL-4、IL-10、TGF-β及VEGF水平均有不同程度的下降，其中聯(lián)合治療組患者的下降程度明顯高于單純異體CIK組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明了在清除免疫抑制因子和促瘤因子的條件下，血漿置換有利于放大CIK細(xì)胞生物治療療效。

針對(duì)晚期腫瘤患者，由于目前還不能從根本上治愈，所以為使患者帶瘤長(zhǎng)期生存，應(yīng)選擇不良反應(yīng)少、耐受性良好且能改善生活質(zhì)量的方案，在選擇治療方案時(shí)應(yīng)重視多學(xué)科綜合治療的策略，制定合理的、個(gè)體化綜合治療方案，延長(zhǎng)生存期的同時(shí)，改善患者生活質(zhì)量更為重要[13]。本研究結(jié)果提示：兩組患者OS無(wú)差別，但聯(lián)合治療組PFS長(zhǎng)于單純CIK治療組，且聯(lián)合治療組KPS評(píng)分顯著高于異體CIK細(xì)胞治療組，即聯(lián)合治療組患者獲得了更長(zhǎng)時(shí)間的PFS，達(dá)到了晚期腫瘤患者以改善生活質(zhì)量為主的目的。

綜上，將兩種成熟的醫(yī)療技術(shù)即CIK細(xì)胞治療與血漿置換(PE)技術(shù)有機(jī)的結(jié)合，有可能為臨床治療肝癌提供新策略。

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Clinical study of allogeneic CIK combined with plasma exchange in the treatment of advanced primary liver cancer

HOUJun-jie,YANGYing,LIXiao-nan,etal.

(JilinProvincePeople’sHospital,Changchun130021,China)

Objective To study the effect and mechanism of allogeneic CIK combined with plasmapheresis in the treatment of liver cancer.Methods Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated from healthy volunteers and cultured in vitro by culturing the cells into cytokine-induced (CIK) cells.All cases were randomly assigned to allogeneic CIK cell treatment group and allogeneic CIK + plasma replacement therapy group.The levels of IFN-γ,IL-4,IL-10,TGF-β and VEGF in plasma were measured by ELISA.The percentage of CD3+and CD4+cells in the peripheral blood of the two groups before and after treatment were detected by flow cytometry.CD4+/CD8+ratio and CD8+cell ratio,and the quality of life and overall survival of the two groups were compared.Results The anti-tumor immunity effect of allogeneic CIK was up-regulated,and the up-regulation of IL -4,IL-10,TGF-β and VEGF was related to the up- regulation of CIK + plasma replacement therapy group (P<0.05);The percentage of CD3+,CD4+and CD4+/CD8+in peripheral blood in CIK+plasma replacement group were significantly higher than those in allogeneic CIK group(P<0.05),and the percentage of CD8+cells decreased significantly after treatment(P<0.05),PFS has been prolonged(P<0.05) and no OS prolongation(P>0.05),and quality of life was significantly better than that of allogeneic CIK cells treated group(P<0.01).Conclusion Adoptive CIK cell adoptive immunotherapy + plasma exchange program can inhibit and remove immunosuppressive cells and immunosuppressive factors,increase the immune effect and quantity of CIK cells,inhibit the progression of primary liver cancer and improve the quality of life of patients.

Hepatitis；Atorvastatin；Plasma exchange；Liver function

1007-4287(2017)01-0050-04

吉林省科技廳項(xiàng)目(20140520037JH，20140519018JH，20140414043GH)、吉林省人社廳省人才開(kāi)發(fā)資金(2016年度)及吉林省科技廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(20122113)資助

R735.7

A

2016-04-14)

*通訊作者