降解黃曲霉毒素B1芽孢桿菌的篩選與鑒定

王明清　張初署　于麗娜　畢潔　孫杰　趙紅軍　楊慶利　陳明學(xué)

摘要：本研究以香豆素為唯一碳源進(jìn)行黃曲霉毒素B1（AFB1）降解菌的篩選，從花生地土壤中分離出高效降解AFB1的菌株A3042。研究該菌的上清液、菌懸液、胞內(nèi)液對(duì)AFB1降解特性。結(jié)果表明，菌株A3042能高效降解AFB1，其胞外上清液、菌懸液和胞內(nèi)液分別降解91.7%、11.4%和7.6%的AFB1，表明起降解的活性物質(zhì)主要位于胞外液。綜合其形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征和16S rRNA基因分析，鑒定菌株A3042為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），命名為Bacillus cereus A3042。本研究為食品和飼料中AFB1的生物降解提供菌種資源。

關(guān)鍵詞：黃曲霉毒素B1；降解；蠟樣芽孢桿菌；鑒定

中圖分類號(hào)：S182 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2018）11-0071-05

Abstract In this study， the bacterial strain A3042 was isolated from the soil in Qingdao by screening with coumarin as the only carbon source. It could efficiently degrade aflatoxin B1（AFB1）.The degradation characteristics were studied in the supernatant， suspension and intracellular fluid. The results showed that the extracellular supernatant， bacterial suspension and intracellular fluid of the strain A3042 could respectively degrade 91.7%， 11.4% and 7.6% of AFB1， indicating that the main biodegradable active substance was in extracellular fluid. The strain A3042 was identified as Bacillus cereus and named as Bacillus cereus A3042 using morphological， physiological and biochemical features and 16S rRNA gene analysis. This study provided strain resource for the biodegradation of AFB1 in food and feed.

Keywords Aflatoxin B1； Degradation； Bacillus cereus； Identification

黃曲霉毒素（aflatoxin， AFT）是一類由黃曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（A. parasiticus）等曲霉產(chǎn)生的一類毒素，其主體結(jié)構(gòu)為二呋喃環(huán)和香豆素[1， 2]。黃曲霉毒素種類主要分為B族、G族和M族等，其中B族的黃曲霉毒素B1（AFB1）分布最廣、危害最大，具有強(qiáng)烈的致毒性、致癌性、致突變性[3]。世界衛(wèi)生組織人類致癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)組將AFB1列為IA級(jí)危險(xiǎn)物和I類致癌物[4]。AFB1主要污染花生、玉米等農(nóng)產(chǎn)品，不僅對(duì)糧食和畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，也對(duì)人類和動(dòng)物健康構(gòu)成巨大威脅，嚴(yán)重危害人類食品安全和動(dòng)物飼料安全。因而，去除花生、玉米等農(nóng)產(chǎn)品中AFB1的污染，降低其在農(nóng)產(chǎn)品中的殘留，從而保障食品和飼料安全，對(duì)人和動(dòng)物健康具有重要意義。

國內(nèi)外眾多研究人員致力于尋求有效去除AFB1的技術(shù)，目前去除方法主要分為化學(xué)法、物理法和生物法[5]?；瘜W(xué)去除法主要通過化學(xué)反應(yīng)如堿化、水解、氧化、還原等方法破壞AFB1的化學(xué)結(jié)構(gòu)達(dá)到去除的目的，化學(xué)去除的方法有一定效果，但是存在去除不完全、容易造成營養(yǎng)物質(zhì)損失等缺點(diǎn)[6]。物理法主要包括吸附劑吸附法、水洗法、挑選剔除法、加熱去除法、紫外線去除法等[7， 8]，這些方法耗費(fèi)大量人力物力，效率不高，并且會(huì)破壞農(nóng)產(chǎn)品的營養(yǎng)成分。生物法主要分為生物吸附法和生物降解法。生物吸附法主要通過微生物細(xì)胞壁吸附AFB1[9， 10]，但是該方法是一個(gè)可逆的過程，吸附的毒素會(huì)再次釋放出來；生物降解法主要將AFB1的分子結(jié)構(gòu)破壞，產(chǎn)生降解產(chǎn)物，該過程是一種生物化學(xué)反應(yīng)，不同于生物吸附[11]。近年來，生物降解AFB1引起了越來越多的關(guān)注，原因是生物降解法既避免了物理和化學(xué)方法破壞農(nóng)產(chǎn)品和食品的營養(yǎng)，又具有降解條件溫和、特異性強(qiáng)和脫毒效率高等優(yōu)點(diǎn)[12]。本研究通過初篩和復(fù)篩從花生地土壤中分離了一株高效降解AFB1的菌株A3042，并進(jìn)一步分析了各組分降解AFB1的效率，通過細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征以及16S rRNA基因分析鑒定菌株A3042。本研究為去除食品和飼料中AFB1的生物降解提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

土壤樣品采集自山東省青島市黃島區(qū)花生地，香豆素購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，AFB1標(biāo)品購自Fermentek公司，色譜級(jí)甲醇購自Merck公司，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，黃曲霉毒素免疫親和柱購自北京華安麥科生物技術(shù)有限公司，Super GelRed熒光染色試劑購自US Everbright Inc，pMD18-T載體購自大連寶生物公司。

1.2 培養(yǎng)基

初篩培養(yǎng)基[13]（g/L）：0.25 g KH2PO4，0.25 g MgSO4·7H2O，0.5 g KNO3，0.5 g （NH4）2SO4，0.005 g CaCl2，0.003 g FeCl3·6H2O，1.0 g香豆素，2.0 g瓊脂，pH 7.0，121℃高壓滅菌15 min。