野生動物結(jié)核病檢測技術(shù)研究進(jìn)展

植廣林 平曉坤 陳絢姣 趙 琰 梁玉珍 黃 勉 賈 坤*

(1.廣州動物園，廣州，510070；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州，510642；3.廣東省獸醫(yī)臨床重大疾病綜合防控重點(diǎn)實驗室，廣州，510642)

野生動物結(jié)核病檢測技術(shù)研究進(jìn)展

植廣林1平曉坤2，3陳絢姣1趙 琰2，3梁玉珍1黃 勉1賈 坤2，3*

(1.廣州動物園，廣州，510070；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州，510642；3.廣東省獸醫(yī)臨床重大疾病綜合防控重點(diǎn)實驗室，廣州，510642)

稿件運(yùn)行過程

野生動物； 結(jié)核??； 分枝桿菌； 檢測方法

現(xiàn)今國內(nèi)外關(guān)于野生動物結(jié)核病的檢測方法大致上可歸為3類：第一類是細(xì)菌學(xué)檢測，如涂片鏡檢、細(xì)菌培養(yǎng)、動物實驗等；第二類為免疫學(xué)檢測，常見的有皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)等；第三類是分子生物學(xué)診斷技術(shù)，常見的有PCR、核酸探針技術(shù)、LAMP等檢測技術(shù)。

中國城市化的進(jìn)程讓更多的人進(jìn)入城市，人們接觸野生動物的機(jī)會更多是在動物園里，這使得一旦在動物群體中爆發(fā)結(jié)核病，如果不能及時檢測出來，就有可能爆發(fā)大規(guī)模的感染。對于結(jié)核病的危害在集約化養(yǎng)殖的牧場中每年都會產(chǎn)生巨額的損失，野生動物帶菌狀況更是無法精確統(tǒng)計，所產(chǎn)生的損失和危害無法估計[1]。野生動物活動范圍廣，對人類的警惕性也更強(qiáng)，且具有一定的攻擊性，現(xiàn)行的檢測方法有著其本身的實際使用優(yōu)勢，但同時由于檢測方法本身的限制，例如野生動物區(qū)別于集約化養(yǎng)殖動物，難以保定，采樣困難等，傳統(tǒng)的檢測技術(shù)在實際檢測過程中有一定難度。傳統(tǒng)的檢測手段以及現(xiàn)行的先進(jìn)的實驗室檢測方法雖然都有著各種的限制條件及其本身的不足，但對于建立新的檢測方法具有重要的借鑒意義，同時提供了理論基礎(chǔ)。因此準(zhǔn)確了解各種檢測方法的優(yōu)缺點(diǎn)是很有必要的，本文就現(xiàn)行的對于動物結(jié)核病的檢測方法作一簡單的綜述，望能為新的檢測方法提供幫助。

1 細(xì)菌學(xué)檢測

1.1 抗酸染色法

由于分枝桿菌(Mycobacteriumspp.)的細(xì)胞壁內(nèi)含有大量的脂質(zhì)包圍在肽聚糖的外面，所以分枝桿菌一般不易著色，經(jīng)過加熱和延長染色時間可使其固定著色。在分枝桿菌中的分枝菌酸與染料結(jié)合后，就可以不被酸性脫色劑脫色而呈現(xiàn)出肉眼可見的紅色，從而達(dá)到對病料進(jìn)行染色的目的[2]。在普通光學(xué)顯微鏡油鏡下可檢出抗酸性桿菌?？顾崛旧椒ǔＳ幂履岫先旧ǎ部捎脽晒饪顾崛旧?。如果鏡檢組織內(nèi)有抗酸性染色的微生物，并且動物組織具有典型的組織學(xué)病變，就可以做出初步診斷。雖然抗酸染色法陽性檢出率比較低，但它作為一種傳統(tǒng)的檢測方法，具有假陽性率低、成本低廉、操作簡便快捷等特點(diǎn)[3]。在對于圈養(yǎng)野生動物的檢測上，筆者通過對疑似結(jié)核病感染動物進(jìn)行采樣之后，進(jìn)行涂片觀察，就可快速做出初步判斷，不需要其他復(fù)雜的檢測手段，此法在野生珍稀動物的結(jié)核病快速檢測和及時治療上尤為重要，所以該方法在實際應(yīng)用中具有一定的實用價值。缺點(diǎn)是對于致病性分枝桿菌和非致病性分枝桿菌難以區(qū)分，對于菌株的種屬特異性也難以進(jìn)行區(qū)分。

1.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)法

細(xì)菌分離培養(yǎng)常用選擇性培養(yǎng)如羅氏培養(yǎng)基，改良羅氏培養(yǎng)基用來分離分枝桿菌，再通過培養(yǎng)所得菌落性狀和生化試驗來鑒定，也可結(jié)合核酸探針和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法進(jìn)行鑒定，同時上述抗酸染色同樣可適用于分離培養(yǎng)后的細(xì)菌鑒定，本研究目前也建立了結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)的PCR檢測技術(shù)，在對臨床樣品的檢測中發(fā)揮了重要的作用。但如果存在培養(yǎng)物污染或其他的特殊原因，也可通過接種豚鼠，再通過分離鑒定來檢出病原菌。不足之處是在上述培養(yǎng)基中，結(jié)核分枝桿菌需經(jīng)過14～15 h才能分裂擴(kuò)增一次，這使得整個病原學(xué)檢測所需時間較長，一般需10～30 d才能在培養(yǎng)基看到較為清楚的菌落[2]，對于病原菌的檢出陽性率也較低。且在細(xì)菌分離培養(yǎng)過程中，出于公共衛(wèi)生安全以及對實驗人員的保護(hù)，一般都需要在生物安全柜中進(jìn)行接種菌株操作，且需要專業(yè)人員在生物安全三級實驗室中進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)菌。該檢測方法所需的較長的檢測時間對于快速檢出病原菌的需要存在著先天條件上的不足。由于該方法在檢測時效性以及所需的較高的實驗條件等種種原因的限制，在對于野生動物結(jié)核病的檢測上有多種不足，所以在實際工作中很少被采用。

2 免疫學(xué)檢測

這類方法的原理主要是通過檢測特異性的抗原抗體免疫反應(yīng)。通過檢測抗原特異性的T淋巴細(xì)胞在體外接受相應(yīng)抗原刺激活化后分泌的T淋巴細(xì)胞活化標(biāo)記分子，可以判斷機(jī)體對某種病原的致敏情況，從而間接反映是否被該病原感染。它是一種快速、簡便的檢查技術(shù)，并且在多種疾病的診斷中得到廣泛應(yīng)用。目前，報道研究最多的免疫學(xué)診斷技術(shù)主要有γ-干擾素(IFN-γ)診斷法、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附劑測定)法，ELISPOT(酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測)法，白細(xì)胞介素診斷法等。與PPD皮內(nèi)試驗相比，上述具有出現(xiàn)反應(yīng)早相比于PPD皮內(nèi)試驗所需要的20 d以上的要求，利用類似于γ-干擾素診斷等方法在動物被感染后2～3周即可得到陽性結(jié)果，具有快速、靈敏的優(yōu)點(diǎn)。

2.1 結(jié)核菌素(PPD)皮內(nèi)試驗

結(jié)核菌素皮內(nèi)反應(yīng)屬于遲發(fā)型細(xì)胞過敏反應(yīng)。結(jié)核菌或卡介苗進(jìn)入機(jī)體使機(jī)體的免疫T淋巴細(xì)胞致敏，并在機(jī)體內(nèi)大量分化增殖。當(dāng)已致敏的機(jī)體再次遭受到抗原入侵時，已致敏的淋巴細(xì)胞就會與之結(jié)合，引起機(jī)體被注射部位出現(xiàn)硬塊甚至發(fā)生水泡、壞死等變態(tài)反應(yīng)性炎癥。通過對動物注射結(jié)核菌素后所出現(xiàn)的一系列炎癥反應(yīng)來判斷機(jī)體是否感染結(jié)核桿菌。

通過接種結(jié)核菌素一方面可以檢測機(jī)體是否感染分枝桿菌。另一方面，通過結(jié)核菌素試驗可以判斷接種卡介苗是否接種成功。此方法在長期的生產(chǎn)實踐中被證明是檢測動物結(jié)核病的可靠的篩選試驗，在實際的生產(chǎn)生活中被廣泛采用。但該方法的不足之處在于，對因感染其他非致病性分枝桿菌而致敏的動物檢測結(jié)果同樣呈陽性，無法通過所出現(xiàn)的免疫反應(yīng)來判斷為何種致病菌，且在那些因病情嚴(yán)重而導(dǎo)致免疫反應(yīng)低下的動物易出現(xiàn)假陰性。此外，結(jié)核菌素皮內(nèi)試驗需要消耗大量人力，檢驗周期較長，所以有一定的滯后性。由于DTH(遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng))的滯后效應(yīng)，此方法不能在30 d內(nèi)重復(fù)進(jìn)行。在對已經(jīng)進(jìn)行BCG(卡介苗)免疫的動物群體，由于BCG疫苗中含有與PPD相同的抗原成分，因而PPD皮內(nèi)試驗不能鑒別免疫動物與感染動物[4]。同時對于野生動物來說，野生動物的不穩(wěn)定性對動物的保定、注射結(jié)核菌素以及后期的對注射部位的觀測以確定是否有分枝桿菌感染都是需要顧及到的因素，PPD的質(zhì)量和劑量，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)及操作方法等因素均能影響檢測結(jié)果，故需嚴(yán)格進(jìn)行質(zhì)量控制。在一些國家，使用比較結(jié)核菌素試驗，即比較皮內(nèi)試驗(SICTT)，在動物頸部一側(cè)的不同部位，同時注射兩種PPD，根據(jù)出現(xiàn)的不同反應(yīng)，能夠提示被檢動物是結(jié)核桿菌感染還是非特異的DTH反應(yīng)[4]。

2.2 γ-干擾素(IFN-γ)檢測

該檢測方法由Wood等人于1990年建立，其原理為致敏的外周血淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)的條件下，接受特異抗原(如PPD)刺激后被活化，表達(dá)并分泌IFN-γ，通過一定的技術(shù)手段對培養(yǎng)上清中的IFN-γ進(jìn)行檢測(如ELISA)，或者對IFN-γ mRNA的表達(dá)進(jìn)行定量或者半定量(如RT-PCR)檢測，還可通過ELISPOT技術(shù)對分泌IFN-γ的淋巴細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)(形成的斑點(diǎn)數(shù))及對單個細(xì)胞分泌的IFN-γ進(jìn)行定量(形成的斑點(diǎn)大小)檢測，其結(jié)果與淋巴細(xì)胞增生試驗具有很好的相關(guān)性[5]。具體操作，將1mL的肝素抗凝血液和PPD在37℃培養(yǎng)過夜，第二天收集血漿樣品并以夾心ELISA檢測IFN-γ[6]。用作全血培養(yǎng)刺激物的抗原是Mycobacteriumbovis的PPD和Mycobacteriumavium的PPD(后者用于檢查交叉反應(yīng))。該測定系統(tǒng)簡便、快速，便于用作疫情監(jiān)測時大量樣品的測試。與皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)相比，該方法減少了操作中的主觀性，其敏感性和特異性更高，在皮內(nèi)試驗進(jìn)行后再進(jìn)行IFN-γ試驗，其靈敏度和特異性未有顯著影響(分別為85%和93%)，因此可以作為皮內(nèi)試驗理想的補(bǔ)充試驗[7]。γ-干擾素釋放對淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗的主要技術(shù)障礙是在采血后需盡快處理血液樣品，且實驗費(fèi)用高昂，限制了該方法從研究到臨床的實際應(yīng)用。

2.3 白細(xì)胞介素檢測

感染分枝桿菌后的機(jī)體多呈現(xiàn)以細(xì)胞免疫為主的免疫反應(yīng)，IL-2主要由刺激活化后的T淋巴細(xì)胞分泌，可以作為T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的指標(biāo)。由于IL-2具有刺激成淋巴細(xì)胞增生的特性，通過測定牛外周血淋巴細(xì)胞(PBL)經(jīng)抗原刺激培養(yǎng)后的上清中IL-2的生物活性，以重組人IL-2建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線作對照，可以IL-2活性進(jìn)行半定量測定。以此來檢測機(jī)體是否感染結(jié)核分枝桿菌。結(jié)核分枝桿菌能夠通過刺激機(jī)體單核巨噬細(xì)胞來合成并釋放IL-6[8]。結(jié)核分枝桿菌的內(nèi)毒素脂多糖(LPS)可刺激單核細(xì)胞釋放IL-6增多[9]。IL-6的水平與結(jié)核病的感染有重要關(guān)系，是結(jié)核病診斷的潛在標(biāo)志物，IL-6水平檢測可輔助診斷結(jié)核病。對于IL-6的檢測常用方法如ELISA法，放射免疫檢測法，酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法等方法[10]。IL-6的最低檢測量可達(dá)3pg/mL[11]，靈敏度較高。聯(lián)合IL-2，IL-6，IFN-γ不但可以更加準(zhǔn)確的檢測出機(jī)體感染分枝桿菌的情況，而且還可以在檢測活動性結(jié)核病與潛伏性結(jié)核感染鑒別診斷中提供有力依據(jù)[12]。

2.4 ELISA檢測技術(shù)

ELISA技術(shù)是利用抗原抗體專一性鍵結(jié)合的特性進(jìn)行抗原或抗體檢測。在多種動物疾病診斷中發(fā)揮著重要作用，近年來深受動物疫病篩查工作者的喜愛。結(jié)核分枝桿菌感染后由于細(xì)胞免疫起決定作用，因此對于結(jié)核桿菌感染后所產(chǎn)生的血清抗體有限，如何發(fā)現(xiàn)這些抗體并建立有效的ELISA檢測技術(shù)，給科研工作者帶來了挑戰(zhàn)，目前本項目篩選了多個基因片段，開展ELISA檢測技術(shù)的研究，以期獲得特異性好、靈敏度高的ELISA檢測技術(shù)來提高結(jié)核病的檢出率。

3 分子生物學(xué)診斷

3.1 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)

PCR技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域經(jīng)過數(shù)年的努力積累了大量的資料和經(jīng)驗，使這一方法不斷完善，其反應(yīng)靈敏、特異、快速的特性在多數(shù)報告中得到肯定[13]。該檢測方法首先要選擇合適的DNA片段，其次引物設(shè)計要符合一定的原則，這直接關(guān)系到臨床樣本檢測的敏感性和特異性，通過對不同的特異區(qū)段設(shè)計相應(yīng)引物，能夠鑒別各種分枝桿菌。再者要注意結(jié)核桿菌DNA的處理。結(jié)核桿菌的細(xì)胞壁具有特殊性，能否有效的破裂其細(xì)胞壁而使DNA釋放，是提高臨床樣品中結(jié)核桿菌檢出率的關(guān)鍵，可以采用經(jīng)典法、煮沸法、超聲粉碎法等。PCR自20世紀(jì)80年代問世以來，被大量用于結(jié)核病實驗室研究及臨床診斷，但由于很多問題如易污染、假陽性高、使用致癌物(溴化乙啶)、操作繁瑣等曾一度被質(zhì)疑，為此研究人員正在不斷開發(fā)出新的高靈敏度和高特異性的PCR方法，如反轉(zhuǎn)錄PCR法、套式PCR法、單管套式反轉(zhuǎn)錄PCR法、實時熒光PCR、酶聯(lián)PCR等[14-15]，本實驗室根據(jù)不同類型分枝桿菌的特異片段，建立了結(jié)核分支桿菌的PCR分類鑒定技術(shù)，在對臨床病例的檢測中，能夠準(zhǔn)確區(qū)分結(jié)核分支桿菌、牛分支桿菌及非結(jié)核分枝桿菌。

由于PCR方法檢測的是核酸，故一般PCR方法無法鑒定死菌和活菌，不能區(qū)別活動型和靜止型結(jié)核病，更不能給臨床治療提供有效的監(jiān)測手段。反轉(zhuǎn)錄PCR雖然能檢測活菌，但其對樣本處理要求較高而目前仍難以在臨床上推廣應(yīng)用。綜上所述，PCR方法在結(jié)核病分子診斷中己展現(xiàn)了巨大的應(yīng)用價值。但臨床實驗室必須在充分了解PCR測定具有不確定性基礎(chǔ)上，采取相應(yīng)質(zhì)控措施，才能確保試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，而不致出現(xiàn)重大判斷失誤。因為PCR擴(kuò)增可得到極大的檢測靈敏度，但同時其對檢測中的錯誤也有極大的放大作用。因此，對于PCR檢測結(jié)果的報告必須慎重。必須有相應(yīng)嚴(yán)格質(zhì)量控制措施，如內(nèi)質(zhì)控、陰性和陽性質(zhì)控的情況下重復(fù)測定，才可報告檢測結(jié)果，并對檢測做出實事求是的解釋[16]。

3.2 核酸探針技術(shù)

PCR-熒光探針技術(shù)是采用雙重PCR技術(shù)和Taqman探針技術(shù)相結(jié)合，通過在臨床患病動物的痰標(biāo)本中提取分枝桿菌核酸進(jìn)行定性檢測，分別針對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的特異性序列設(shè)計引物和探針，探針分別標(biāo)記不同的熒光發(fā)光基團(tuán)，通過監(jiān)測不同熒光通道的熒光信號變化，檢測結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌感染，該技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡便易行等優(yōu)點(diǎn)[17]。應(yīng)用PCR-熒光探針法在臨床標(biāo)本中進(jìn)行大樣本快速檢測和鑒別結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌，這一點(diǎn)對于群居性動物的結(jié)核病快速檢測具有很高的應(yīng)用價值，目前國內(nèi)的博奧生物有限公司生產(chǎn)的分枝桿菌核酸檢測試劑盒可以快速檢測和區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌，1 d可以完成診斷檢測，國內(nèi)已經(jīng)有研究報道這一技術(shù)[18]，這一技術(shù)對于快速分檢出結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌，為臨床治療提供了有力的幫助。

4 小結(jié)

綜上所述，現(xiàn)行的對于結(jié)核病原菌的檢測方法都有著自己本身的優(yōu)缺點(diǎn)，細(xì)菌分離培養(yǎng)方法雖然實驗方法簡單且可以準(zhǔn)確進(jìn)行結(jié)核病的診斷及病原的分析，但是由于在傳統(tǒng)培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)核桿菌方法中對于培養(yǎng)過程中的實驗條件要求過高，出于生物安全方面的考慮所需要的條件并不適合于野生動物的結(jié)核病菌檢測，且培養(yǎng)過程中結(jié)核桿菌生長緩慢，不利于對疑似感染動物進(jìn)行快速處置及采取相應(yīng)防控措施，隨著科研方面的發(fā)展近年來出現(xiàn)了一系列的快速培養(yǎng)系統(tǒng)，這些快培系統(tǒng)的共同點(diǎn)是均使用液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)過程中細(xì)菌生長于一個相對密閉安全的環(huán)境中，在這些培養(yǎng)基中由于培養(yǎng)基內(nèi)所添加的營養(yǎng)物質(zhì)，分枝桿菌在培養(yǎng)基中初代分離率高于L-J法，得到檢測結(jié)果所需要的時間也少于L-J法[15]，隨著培養(yǎng)方法的進(jìn)步，結(jié)合PCR技術(shù)極大的檢測靈敏度，兩者結(jié)合會是一個適合快速準(zhǔn)確判斷機(jī)體是否感染結(jié)核桿菌的檢測方法。

現(xiàn)行的免疫學(xué)檢測雖然簡單易行，但由于目前試劑昂貴，導(dǎo)致大規(guī)模實施的成本過高，落實推廣尚有待時日。分子生物學(xué)檢測方面，目前應(yīng)用ELISPOT方法檢測細(xì)胞因子(尤其是IFN-γ)，PCR檢測技術(shù)特別是核酸探針技術(shù)已經(jīng)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。這些先進(jìn)的檢測技術(shù)具有傳統(tǒng)檢測方法所不具有的快速性、準(zhǔn)確性。經(jīng)過改良過后在野生動物結(jié)核病檢測上將具有廣闊的應(yīng)用前景。因此，將現(xiàn)行的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)成熟的檢測方法進(jìn)行改良將會成為野生動物結(jié)核病檢測的研究熱點(diǎn)。

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Wild animal； Tuberculosis； Mycobacteria； Testing

結(jié)核病(Tuberculosis，TB)是一種人獸共患的慢性消耗性傳染病，該病感染宿主廣泛，可以交互傳染，很難根絕。近年來野外和圈養(yǎng)野生動物的結(jié)核病疫情呈現(xiàn)增高的趨勢，不但造成重大經(jīng)濟(jì)損失，而且影響到公共衛(wèi)生安全。野生動物的結(jié)核病主要是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)和牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)所引發(fā)，其感染宿主譜很廣，并具有或潛在具有傳播給人類的能力。因此，建立快速準(zhǔn)確的結(jié)核病檢測方法意義重大?，F(xiàn)在較為廣泛使用的結(jié)核病檢測方法主要分為3大類，分別是細(xì)菌學(xué)檢測、免疫學(xué)檢測以及分子生物學(xué)診斷，但是這些檢測方法仍存在許多問題。目前對于野生動物結(jié)核病檢測迫切需要新的快速、靈敏、特異的動物結(jié)核病診斷方法。本文就現(xiàn)行的檢測技術(shù)研究進(jìn)展作一簡要概括。

The Progress in Testing Technology ofTuberculosis in Wild Animal

Zhi Guanglin1Ping Xiaokun2，3Chen Xuanjiao1Zhao Yan2，3Liang Yuzhen1Huang Mian1Jia Kun2，3*

(1.Guangzhou Zoo，Guangzhou，510070，China；2.College of Veterinary Medicine，South China Agriculture University，Guangzhou，510642，China；3.Guangdong Provincial Key Laboratory of Prevention and Control for Server Clinical Animal Diseases，Guangzhou，510642，China)

Tuberculosis(TB)is a progressive wasting disease which is a zoonosis.In recent years，the frequency of TB epidemics in wild and captive wildlife has been increasing due to the infection ofMycobacteriumtuberculosisandMycobacteriumbovis.This disease has caused enormous economic loss and affects human public health over the long-term because of the potential risks of the transmission of the disease to humans.The rapid and accurate detection of TB is important.Based on our literature review，contemporary TB testing technologies include microbiological detection，immunological assay，and molecular biological diagnosis.However，because there are still some problems with these methods，new rapid，sensitive and specific animal TB diagnosis methods are needed.This paper briefly summarizes the progress of TB diagnosis and quarantine technologies.

植廣林，男，37歲，碩士，獸醫(yī)師；從事野生動物疾病研究。E-mail：zhiguanglin@163.com

*通訊作者：賈坤，E-mail：jiakun@scau.edu.cn

2016-08-15

S855.2 S858.9

A

修回日期：2016-08-29

發(fā)表日期：2017-02-10

2310-1490(2017)01-148-05