不同運(yùn)動間歇時間對2型糖尿病大鼠股四頭肌GLUT4含量的影響

宗克強(qiáng) 王耀光

1.齊齊哈爾大學(xué)體育學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.遼寧師范大學(xué)，遼寧 大連 116029

不同運(yùn)動間歇時間對2型糖尿病大鼠股四頭肌GLUT4含量的影響

宗克強(qiáng)1王耀光2

1.齊齊哈爾大學(xué)體育學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.遼寧師范大學(xué)，遼寧 大連 116029

目的:分析不同運(yùn)動間歇時間對2型糖尿病大鼠股四頭肌GLUT4含量的影響。方法:選擇60只健康大鼠，隨機(jī)選擇10只大鼠作為正常對照組(C組)，其余為實(shí)驗(yàn)組，制成2型糖尿病模型。將44只糖尿病大鼠分為糖尿病對照組(T組)、運(yùn)動間隔24h組(T1組)、運(yùn)動間歇48h組(T2組)、運(yùn)動間歇72h組(T3組)。實(shí)驗(yàn)時，各組實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行60min的一次性中等強(qiáng)度的運(yùn)動，分別在各組大鼠休息24h、48h和72h后，取大鼠骨骼四頭肌測定GLUT4的含量。結(jié)果:一次性中等強(qiáng)度的運(yùn)動之后，經(jīng)過不同時間長度的休息后，2型糖尿病各運(yùn)動組(T1組、T2組、T3組)的大鼠股四頭肌內(nèi)GLUT4的量均出現(xiàn)明顯的增加。其中，以T2組的效果最明顯。結(jié)論:一次性中等強(qiáng)度的運(yùn)動后，休息48h組的糖尿病大鼠股四頭肌內(nèi)GLUT4含量的升高最明顯。

2型糖尿?。灰淮涡赃\(yùn)動；GLUT4；胰島素抵抗

人類與大鼠GLUT4的核苷酸序列相似度很高，大約在95%左右。其中，GLUT4可以影響骨骼肌細(xì)胞對葡萄糖的吸收和利用，而葡萄糖在骨骼肌中的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)也同樣受到GLUT4結(jié)構(gòu)的影響。機(jī)體脂肪組織和骨骼肌、心肌細(xì)胞胞漿中的GLUT4具有很強(qiáng)的胰島素敏感性，但一般不會表現(xiàn)出來。只有在胰島素的作用下，才能夠激活GLUT4的活性，并將其轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上，從而促進(jìn)機(jī)體組織中細(xì)胞儲存與吸收的葡萄糖。

人體中的骨骼肌是代謝葡萄糖的主要場所，正常情況下可以消耗機(jī)體20%的葡萄糖，而在高胰島素刺激下可以消耗全身70%-85%的葡萄糖。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞的功能障礙是引起2型糖尿病的罪魁禍?zhǔn)譡1]。胰島素抵抗致使GLUT4表達(dá)失常。胰島素抵抗是誘發(fā)機(jī)體患上2型糖尿病的主要因素[2]，胰島素抵抗嚴(yán)重影響了糖尿病的治療。而葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT4)的轉(zhuǎn)運(yùn)異常是誘發(fā)胰島素抵抗的最主要的原因。

GLUT4需要在激活的情況下才可以轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖，否則它是不可自己發(fā)生功效。運(yùn)動鍛煉與肌肉的收縮可以影響葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT4)的活性，這和胰島素干擾葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)有著相似的效果。目前對運(yùn)動訓(xùn)練與2型糖尿病的主要集中在不同運(yùn)動時間與強(qiáng)度[3-4]、有氧運(yùn)動與抗組訓(xùn)練[5-6]、運(yùn)動干預(yù)[7]等方面。而不同間歇時間的運(yùn)動對2型糖尿病血糖的影響尚不多見，因此本文試圖探討中等強(qiáng)度運(yùn)動時不同間歇時間的運(yùn)動對2型糖尿病GLUT4含量的影響。

一、對象與方法

(一)研究對象

實(shí)驗(yàn)動物是購自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心的60只10(±2)周的SD(Sprague-Dawley)雄性大鼠，飼養(yǎng)許可證號為SCXK(遼)2008-0002。將60只健康的雄性SD大鼠，在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，以常規(guī)飼料飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)選取10只大鼠作為正常對照組(C組)，繼續(xù)以正常飼料喂養(yǎng)，其余為實(shí)驗(yàn)組，以高糖高脂飼料喂養(yǎng)一個月，制成2型糖尿病模型，隨機(jī)選取40只造模成功的糖尿病大鼠，平均分為4組，分別為糖尿病對照組(T組)、運(yùn)動間隔時間為24h組(T1組)、運(yùn)動間歇時間為48h組(T2組)、運(yùn)動間歇時間為72h組(T3組)，剩余的備用。

(二)研究方法

首先，要嚴(yán)格控制大鼠的飼養(yǎng)溫度，飼養(yǎng)溫度在18℃至24℃，高脂高糖飼料飼養(yǎng)一個月，對大鼠進(jìn)行糖耐量實(shí)驗(yàn)，往大鼠腹內(nèi)注射30mg/kg的經(jīng)過處理的藥品STZ，STZ溶于pH值為4.4，濃度為0.1mmol/L的檸檬酸緩沖液當(dāng)中。

實(shí)驗(yàn)組分為2型糖尿病對照組(T組)和運(yùn)動訓(xùn)練組(T1組、T2組、T3組)；對照組采用自由活動，而T1至T3組大鼠進(jìn)行60min一次性中等強(qiáng)度的運(yùn)動(約50% VO2max，15m/min)，運(yùn)動可以在跑臺上進(jìn)行，T1組的間歇時間為24h，T2組的間歇時間為48h，T3的間歇時間為72h。

1.大鼠血糖、體質(zhì)量以及胰島素的測量

安靜狀態(tài)下，測量大鼠的體質(zhì)量并記錄，斷尾取血測試大鼠血糖及胰島素的含量，在測試血糖與胰島素時應(yīng)該嚴(yán)格的按照試劑盒上的標(biāo)注進(jìn)行操作。

2.GLUT4含量的測量

(1)樣品制備與蛋白定量。提取蛋白質(zhì)：研磨組織，加入RIPA組織裂解液，轉(zhuǎn)EP管勻漿，反復(fù)離心，離心后提取上清液，加入到小Tube管中，在-20℃的溫度下保存，待用。

蛋白質(zhì)的定量：用Bradfold方法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)定量曲線采用1mg/ml BSA的方法進(jìn)行制作。本次試驗(yàn)我們利用酶標(biāo)儀檢測595nm環(huán)境中實(shí)驗(yàn)樣品的吸光值，收集測試數(shù)據(jù)，用excel表格整理數(shù)據(jù)，列出一個一元線性回歸方程(其中方程的表現(xiàn)形式就是y=kx+b)，規(guī)定表格，x值為實(shí)驗(yàn)樣本上清液濃度數(shù)值，y為上清液在595nm的環(huán)境中的吸光值。通過這個方程式就可得出樣本的濃度數(shù)值。

(2)SDS-PAGE。制備凝膠，準(zhǔn)備樣本，上樣、電泳本實(shí)驗(yàn)用刀片在膠片上切一個小孔做標(biāo)記，標(biāo)記位置在左上角，這樣可以方便我們辨認(rèn)和識別，標(biāo)記方法是，當(dāng)用刀切掉濃縮膠片的時候，記下順序。

(3)Western Blot。平衡，轉(zhuǎn)膜，封閉，免疫結(jié)合、顯色等環(huán)節(jié)觀察蛋白變化。

(三)統(tǒng)計(jì)方法

首先，本文采用SPSS21.0、EXCEL等統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理與分析；其次，對組間顯著性差異的比較采用單因素方差分析(One-Way ANOTA)，顯著性水平α=0.05；最后對結(jié)果進(jìn)行研究。

二、結(jié)果

(一)不同運(yùn)動間歇時間對各組大鼠GLUT4含量的影響

由表1可知，實(shí)驗(yàn)組(T1、T2、T3組)GLUT4的相對含量高于T、C組。并且C組與T組的GLUT4含量比其他糖尿病實(shí)驗(yàn)組的含量要低。對比糖尿病實(shí)驗(yàn)組，GLUT4含量最高的是T2組。糖尿病實(shí)驗(yàn)組(T1、T2、T3組)大鼠股四頭肌GLUT4相對含量均呈現(xiàn)出上升的趨勢。對比IRI指數(shù)可知，糖尿病大鼠高于C組大鼠。通過上述分析可知，糖尿病組的大鼠表現(xiàn)出明顯的胰島素抵抗。而在運(yùn)動之后，糖尿病實(shí)驗(yàn)組(T1、T2、T3組)在IRI指數(shù)上都有了明顯的下降。這表明運(yùn)動有抑制糖尿病大鼠胰島素抵抗的作用，還可以提高胰島素的敏感性。其中，正常組(C組)和糖尿病對照組(T組)都沒有出現(xiàn)明顯的GLUT4含量的變化。通過以上研究可知，GLUT4轉(zhuǎn)位缺陷能夠直接影響骨骼肌對葡萄糖吸收與利用。

通過對表1的數(shù)據(jù)進(jìn)一步的分析可知，首先，運(yùn)動是提高尿病大鼠的GLUT4的含量和胰島素的敏感性的重要方法，也可以提高對葡萄糖的有效吸收及消耗，從而實(shí)現(xiàn)血糖的動態(tài)平衡。其次，T2組的變化最為明顯，由此可以證明，間歇48h后再進(jìn)行鍛煉，降低血糖水平的效果最為明顯。第三，降低血糖水平的效應(yīng)在運(yùn)動48h后達(dá)到最高值，之后開始出現(xiàn)下降。通過上述分析可知，在中強(qiáng)度訓(xùn)練過程中，其兩次運(yùn)動的間隔不能超過兩天。而當(dāng)超過后就會加大血糖的波動幅度，導(dǎo)致AGES(晚期糖基化終末產(chǎn)物)堆積的出現(xiàn)，致使血管平滑肌細(xì)胞的增生，從而導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥。

表1 各組大鼠GLUT4的相對含量

注：與C組相比*P<0.01，與T組相比，○P<0.01?！蚺cT1及T3比，P<0.01。

(二)GLUT4的轉(zhuǎn)位

綜合所有實(shí)驗(yàn)可知，不同強(qiáng)度、不同方式、不同運(yùn)動時間的運(yùn)動刺激，會使糖尿病大鼠細(xì)胞中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT4)含量升高，綜合現(xiàn)有的研究來看，有氧運(yùn)動與抗阻運(yùn)動是增加機(jī)體內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT4)含量，提高葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖能力的兩個最主要的途徑。目前，關(guān)于有氧運(yùn)動與阻抗運(yùn)動能否達(dá)到胰島素降低血糖效果的研究，還不系統(tǒng)。但大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)：降低血糖的主要方法有胰島素和有氧運(yùn)動以及抗阻運(yùn)動兩種。

葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT4)活性被胰島素激活到一定活性的時候，可以把AMPK信號傳導(dǎo)給激活，而當(dāng)機(jī)體內(nèi)血糖水平升高時，會刺激胰島，使胰島分泌的胰島素增加，從而增加機(jī)體內(nèi)胰島素的濃度，細(xì)胞膜上的胰島素受體活性會因?yàn)橐葝u素濃度的增加而被激活，胰島素受體的濃度也會因此增加。胰島素與胰島素受體結(jié)合的能力得到增強(qiáng)，胰島素受體1(IRS-1)作為胰島素與胰島素受體結(jié)合后的介導(dǎo)，胰島素受體1和胰島素受體1的β亞單位被磷酸化，反應(yīng)結(jié)束后，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)的轉(zhuǎn)運(yùn)能力得到提升。

通過有氧運(yùn)動與抗阻運(yùn)動的影響，也可以實(shí)現(xiàn)將葡萄糖由細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜外的目的，這就是運(yùn)動降低血糖水平的生理學(xué)原理。人體的細(xì)胞中有兩種不同功能的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)，都會受到有氧運(yùn)動、抗阻運(yùn)動和胰島素的影響，敏感性會得到一定的提升，都可以促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞膜外。研究結(jié)果顯示：患有肥胖癥、糖尿病的人和健康人相比，可以發(fā)現(xiàn)前者的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)活性下降，這是機(jī)體轉(zhuǎn)運(yùn)葡糖糖異常的主要原因[4]。而目前關(guān)于GLUT4影響葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的研究頗多，并多次提到了骨骼肌上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)轉(zhuǎn)運(yùn)異常，GLUT4的含量的增加會提高葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，現(xiàn)如治療糖尿病急需解決的問題是如何高效的提高機(jī)體細(xì)胞內(nèi)GLUT4的含量。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，運(yùn)動能夠明顯降低糖尿病大鼠的血糖，提高胰島素的敏感性。現(xiàn)如今運(yùn)動療法已經(jīng)被人們認(rèn)為是康復(fù)與預(yù)防2型糖尿病的最科學(xué)有效的方法，而最佳的運(yùn)動間歇時間能夠使骨骼肌細(xì)胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的能力達(dá)到最佳效果。

通過對表3分析可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過一次中等強(qiáng)度的運(yùn)動后，經(jīng)過不同時間的休息后，糖尿病實(shí)驗(yàn)組大鼠股四頭肌中的GLUT4的含量比正常對照組有了一定程度的增加，其中，T2組大鼠GLUT4的含量增加的幅度最大，這也在一定程度上顯示出GLUT4的轉(zhuǎn)位在糖尿病大鼠休息48h小時后，會達(dá)到高峰。

三、討論

對糖尿病大鼠施加一定時間的中等強(qiáng)度耐力運(yùn)動后，不同間歇時間能夠增加糖尿病大鼠骨骼肌中GLUT4含量，其中以間歇時間為48h組的大鼠的GLUT4含量的升高最明顯。

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