長(zhǎng)鏈非編碼RNABANCR在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)上調(diào)及其對(duì)患者疾病預(yù)后價(jià)值探討

趙 冀，周 超，李宏敏，楊洪吉

(四川省人民醫(yī)院：1.器官移植中心；2.消化內(nèi)科；3.腫瘤科，成都 610000)

長(zhǎng)鏈非編碼RNABANCR在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)上調(diào)及其對(duì)患者疾病預(yù)后價(jià)值探討

趙 冀1，周 超2，李宏敏3，楊洪吉1

(四川省人民醫(yī)院：1.器官移植中心；2.消化內(nèi)科；3.腫瘤科，成都 610000)

目的 探討B(tài)RAF激活的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(BANCR)在肝細(xì)胞癌(HCC)組織中表達(dá)上調(diào)及其對(duì)患者疾病預(yù)后價(jià)值。方法 采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)HCC組織和細(xì)胞系中BANCR表達(dá)情況，分析BANCR表達(dá)水平與患者臨床病理學(xué)特征關(guān)系，采用四甲基噻唑藍(lán)(MTT)、流式分析和腫瘤細(xì)胞體外侵入遷移分析探討B(tài)ANCR在HCC細(xì)胞中的生物學(xué)功能。結(jié)果 與臨近非腫瘤組織相比，HCC組織標(biāo)本中BANCR表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.01)，且HCC細(xì)胞系中BANCR表達(dá)水平也明顯上調(diào)(P<0.05)。臨床病理學(xué)特征分析結(jié)果提示BANCR表達(dá)升高與較高的腫瘤分級(jí)、腫瘤直徑、靜脈侵入及較高的TNM分期密切相關(guān)(P<0.05)。BANCR過(guò)表達(dá)HCC患者總生存期明顯短于低表達(dá)患者(P<0.01)。多重變量Cox回歸分析提示BANCR表達(dá)(RR=4.245，P=0.015)、腫瘤直徑(RR=2.655，P=0.039)、靜脈侵入(RR=3.278，P=0.022)和TNM分期(RR=6.379，P=0.006)是HCC患者總生存期獨(dú)立預(yù)后因素。此外，Hep3B細(xì)胞中BANCR表達(dá)下調(diào)能明顯抑制細(xì)胞侵入和轉(zhuǎn)移，同時(shí)導(dǎo)致波形蛋白下調(diào)和E-鈣黏蛋白上調(diào)。結(jié)論 本研究結(jié)果表明BANCR可能參與HCC的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，可以作為HCC患者疾病預(yù)后標(biāo)志物和臨床治療靶標(biāo)。

RNA；肝腫瘤；癌，肝細(xì)胞；長(zhǎng)鏈非編碼RNA，BANCR；預(yù)后

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)在全球常見(jiàn)腫瘤中排第5，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，在中國(guó)也是如此[1]。盡管臨床和實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)不斷取得進(jìn)展，但由于患者大多在腫瘤晚期確診，缺乏有效治療和介入方法，因此臨床長(zhǎng)期預(yù)后較差。早期研究揭示了多種與HCC相關(guān)的調(diào)節(jié)基因和信號(hào)通路[2-3]，然而HCC發(fā)生和發(fā)展?jié)撛诘母叨葟?fù)雜的分子機(jī)制目前仍所知甚少。因此，臨床急需一種HCC早期診斷，有效治療和預(yù)后的分子標(biāo)志物。BRAF激活的非編碼RNA(BANCR)為693 bp的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)，由Flockhart等[4]在黑色素瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。隨后，甲狀腺乳頭狀癌[5]、視網(wǎng)膜母細(xì)胞癌[6]、肺癌[7-8]、胃癌和結(jié)直腸癌[9]中均發(fā)現(xiàn)lncRNA BANCR表達(dá)異常。上述腫瘤中BANCR均參與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵入，然而其在HCC中表達(dá)的研究較少。本研究檢測(cè)BANCR在HCC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)，同時(shí)分析其表達(dá)與HCC患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，此外，本研究還初步探討了BANCR對(duì)HCC細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 HCC組織和相應(yīng)臨近非腫瘤組織均采集于2009～2011年本院治療的109例HCC患者，均在術(shù)中采集并置于液氮中保存。所有患者均為原發(fā)病例，患者臨床病理學(xué)特征從病歷中獲取，入組前均未接受任何治療，并將所取組織分為HCC組織組和非腫瘤組織組。本研究通過(guò)本院倫理委員會(huì)審批。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與RNA干擾 HCC細(xì)胞系(HuH-7，Hep3B，HepG2和H2-M)及健康人肝細(xì)胞CL-48均購(gòu)自ATCC(美國(guó))，采用高糖(4.5 g/L)DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為5% CO237 ℃。青、鏈霉素終濃度為100 U/mL，此外還添加10%胎牛血清。lncRNA BANCR干擾RNA(si-BANCR)和對(duì)照干擾RNA(siRNA)均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，采用Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h收集細(xì)胞。

1.2.2 RNA提取和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) 組織miRNA采用mirVana miRNA提取試劑盒(AB公司，美國(guó))提取，通過(guò)SPECTRAmax微孔板紫外分光光度計(jì)(Molecular devices corp，美國(guó))測(cè)定微RNA(miRNA)濃度，參考文獻(xiàn)[6]合成BANCR和內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)擴(kuò)增引物。通過(guò)2-ΔΔCt方法，根據(jù)內(nèi)參含量計(jì)算miRNA-21的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3 細(xì)胞增殖、凋亡分析 采用四甲基噻唑藍(lán)(MTT)方法進(jìn)行細(xì)胞增殖分析，步驟如下：鋪96孔板，每孔細(xì)胞1×103，連續(xù)培養(yǎng)。兩組都加入20 μL MTT(5 mg/mL)，孵育4 h后移去上清液，DMSO每孔150 μL，測(cè)定光密度(OD) 490 nm值。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌、重旋后，采用碘化丙啶(10 μg/mL)和鈣磷脂結(jié)合蛋白Ⅴ(50 μg/mL)處理細(xì)胞，黑暗環(huán)境下室溫孵育15 min后，進(jìn)行流式分析。

1.2.4 細(xì)胞侵入和轉(zhuǎn)移分析 采用6孔transwell小室(直徑8 μm)進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的侵入和轉(zhuǎn)移分析，進(jìn)行轉(zhuǎn)移分析時(shí)，將轉(zhuǎn)染后的1×105的HCC細(xì)胞加入不含血清培養(yǎng)基的上室中，下室為含20%胎牛血清的全培養(yǎng)基，刺激細(xì)胞轉(zhuǎn)移，孵育48 h，取出下室置于95%的乙醇中，固定 10 min，0.1%的結(jié)晶紫染色20 min，顯微計(jì)數(shù)。進(jìn)行腫瘤細(xì)胞侵入分析時(shí)，上室中加入5 mg/mL的基質(zhì)膠，其他步驟與轉(zhuǎn)移分析相同。

1.2.5 Western blot分析 采用含蛋白酶的RIPA溶液裂解細(xì)胞，并抑制內(nèi)源性磷酸酶活性，采用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進(jìn)行電泳后轉(zhuǎn)印蛋白至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，常規(guī)封閉后，孵育一抗(Cell signal，美國(guó))，之后采用H辣根過(guò)氧化酶(HRP)標(biāo)記的二抗進(jìn)行孵育，加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)Plus進(jìn)行發(fā)光， GAPDH作為內(nèi)參蛋白。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件處理，BANCR表達(dá)水平與其他因素的相關(guān)性采用卡方檢驗(yàn)和Fisher′s精準(zhǔn)檢驗(yàn)或獨(dú)立t檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier方法計(jì)算患者生存期，根據(jù)術(shù)后隨訪結(jié)果計(jì)算患者總生存期。組間生存期比較則采用秩和檢驗(yàn)，對(duì)于單一變量檢測(cè)影響HCC患者總生存期的顯著性因素進(jìn)行多重變量分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HCC組織和細(xì)胞系中BANCR表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)HCC組織和細(xì)胞系中BANCR表達(dá)水平。與臨近非腫瘤組織相比，HCC組織中BANCR表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)，且4株HCC細(xì)胞系中BANCR表達(dá)也顯著上調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖1。其中Hep3B細(xì)胞系中BANCR表達(dá)升高水平高于其他3株細(xì)胞，因此選擇其進(jìn)行后續(xù)體外實(shí)驗(yàn)。

A:HCC組織和臨近非腫瘤組織BANCR表達(dá)檢測(cè)；B:4株HCC細(xì)胞系中BANCR表達(dá)檢測(cè)。

圖1 HCC組織和細(xì)胞系中BANCR表達(dá)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)

2.2 BANCR表達(dá)與HCC患者臨床病理學(xué)特征關(guān)系分析 本研究進(jìn)一步探討B(tài)ANCR表達(dá)與HCC患者臨床病理學(xué)特征關(guān)系，根據(jù)109例患者HCC組織標(biāo)本BANCR表達(dá)檢測(cè)的平均值將其分成低表達(dá)組(55例)和高表達(dá)組(54例)。結(jié)果表明BANCR表達(dá)與較高腫瘤分級(jí)(P=0.007)、較大腫瘤直徑(P=0.003)、靜脈侵入(P=0.001)和較高的TNM分期(P=0.002)密切相關(guān)，而與患者的年齡、性別、肝硬化、血清AFP水平和實(shí)體瘤數(shù)量無(wú)關(guān)，見(jiàn)表1。

2.3 BANCR表達(dá)與HCC患者疾病預(yù)后 為探討B(tài)ANCR表達(dá)升高對(duì)HCC患者總生存期預(yù)后的價(jià)值，本研究采用Kaplan-Meier方法和秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果提示BANCR過(guò)表達(dá)HCC患者總生存期顯著短于低表達(dá)患者(P<0.01)，見(jiàn)圖2。此外，僅在較小腫瘤直徑(P=0.025)、分化良好腫瘤(P=0.037)、靜脈侵入陰性(P=0.008)和TNM早期(P<0.01)患者中觀察到生存效益，見(jiàn)表2。多重變量Cox回歸分析提示BANCR表達(dá)(RR=4.245，P=0.015)、腫瘤直徑(RR=2.655，P=0.039)、靜脈侵入(RR=3.278，P=0.022)和TNM分期(RR=6.379，P=0.006)是HCC患者總生存期獨(dú)立預(yù)后因素。

表1 BANCR表達(dá)與HCC患者臨床病理學(xué)特征關(guān)系分析

續(xù)表1 BANCR表達(dá)與HCC患者臨床病理學(xué)特征關(guān)系分析

圖2 HCC患者BANCR表達(dá)的Kaplan-Meier分析

相關(guān)因素單一變量分析RRP多重變量分析RRP性別0.7210.455--年齡0.7850.323--腫瘤直徑3.2520.0252.6550.039實(shí)體瘤數(shù)量0.8680.156--血清AFP0.8160.194--肝硬化0.9040.092--腫瘤分級(jí)2.3870.0370.7950.146TNM分期6.225<0.016.3790.006靜脈侵入5.1530.0083.2780.022BANCR表達(dá)5.983<0.014.2450.015

-:無(wú)數(shù)據(jù)。

2.4 BANCR表達(dá)下調(diào)對(duì)Hep3B細(xì)胞生物學(xué)行為影響 本研究進(jìn)一步探討B(tài)ANCR表達(dá)下調(diào)對(duì)Hep3B細(xì)胞生物學(xué)行為影響，采用si-BANCR轉(zhuǎn)染Hep3B細(xì)胞。與對(duì)照組(Si-NC)相比，BANCR表達(dá)下調(diào)能顯著抑制Hep3B細(xì)胞增殖，并能促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，Hep3B細(xì)胞的侵入和轉(zhuǎn)移能力也顯著下降，見(jiàn)圖3。

2.5 BANCR介導(dǎo)的EMT表型分析 Western blot提示BANCR下調(diào)導(dǎo)致波形蛋白(Vimentin)表達(dá)下調(diào)和E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達(dá)上調(diào)，見(jiàn)圖4。

A:BANCR表達(dá)水平實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)；B:Hep3B細(xì)胞MTT分析；C:Hep3B細(xì)胞流式分析；D、E:Hep3B細(xì)胞腫瘤細(xì)胞體外侵入遷移分析。

圖3 BANCR表達(dá)下調(diào)對(duì)Hep3B細(xì)胞生物學(xué)行為影響分析

圖4 Western blot方法檢測(cè)波形蛋白和E-cadherin表達(dá)情況

3 討 論

對(duì)調(diào)節(jié)HCC形成和發(fā)展的新型分子進(jìn)行鑒定有利于疾病的預(yù)防，并對(duì)其診斷和治療具有重要意義，lncRNAs與腫瘤之間的關(guān)系成為當(dāng)前腫瘤研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域，目前研究報(bào)道了幾種HCC組織中表達(dá)異常的lncRNAs，例如HCC細(xì)胞系中l(wèi)ncRNA AOC4P過(guò)表達(dá)可以通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)化(EMT)，進(jìn)而抑制細(xì)胞增生、遷移和侵入[10-11]。lncRNA UCA1在HCC組織中表達(dá)異常升高，且與患者TNM分期、轉(zhuǎn)移和術(shù)后生存期密切相關(guān)[12]，體內(nèi)/體外敲除UCA1后HCC細(xì)胞生長(zhǎng)均受到抑制。血清lncRNA-AF085935可以用于鑒別診斷非乙型肝炎病毒(HBV)感染的HCC患者和HBV感染的HCC患者[13]。負(fù)荷HCC腫瘤小鼠注射lncRNA PTENP1表達(dá)質(zhì)粒后能有效控制腫瘤生長(zhǎng)，抑制瘤內(nèi)細(xì)胞增殖、引發(fā)凋亡、自噬和抑制腫瘤的血管生成[14]。上述研究表明lncRNAs在HCC的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，且具備較好的臨床運(yùn)用潛力。

本研究中結(jié)果表明HCC組織和細(xì)胞系中BANCR表達(dá)明顯升高，提示BANCR過(guò)表達(dá)與HCC的發(fā)生密切相關(guān)。其次，BANCR表達(dá)增加與患者HCC的侵襲性臨床病理學(xué)特征相關(guān)。下調(diào)BANCR 在Hep3B細(xì)胞中表達(dá)水平能降低細(xì)胞增生，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和減弱細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。這些發(fā)現(xiàn)提示BANCR可能參與HCC發(fā)展，可能作為腫瘤治療的靶分子。最后，本研究發(fā)現(xiàn)BANCR高表達(dá)的HCC患者的總生存期顯著短于低表達(dá)患者。多重變量Cox回歸分析表明，BANCR過(guò)表達(dá)是HCC患者疾病預(yù)后不良的獨(dú)立因素。

研究報(bào)道表明BANCR是多種人類(lèi)腫瘤的癌基因，BANCR在人類(lèi)惡性黑色素瘤組織中表達(dá)增加與腫瘤晚期相關(guān)，且敲除BANCR可以通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖和遷移[4,15]。在結(jié)直腸癌中BANCR過(guò)表達(dá)與患者腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且可以通過(guò)EMT機(jī)制促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。與臨床非腫瘤組織相比，胃癌組織中BANCR表達(dá)顯著升高，且BANCR表達(dá)水平與胃癌患者臨床分期、腫瘤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良呈正相關(guān)[9]。體外研究表明，BANCR可以調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵入，且BANCR過(guò)表達(dá)與腫瘤直徑、脈絡(luò)膜侵入和視神經(jīng)侵入密切相關(guān)[6]。

EMT是原位腫瘤細(xì)胞獲得遷移能力的關(guān)鍵步驟[16]，Vimentin上調(diào)和E-cadherin下調(diào)與HCC發(fā)展相關(guān)[17-18]，越來(lái)越多研究證實(shí)lncRNAs，包括BANCR，可能參與EMT途徑的調(diào)節(jié)[10,11,19,20]。本研究中BANCR表達(dá)下調(diào)后導(dǎo)致Vimentin下調(diào)和E-cadherin上調(diào)，提示BANCR可能參與HCC的EMT調(diào)節(jié)，進(jìn)而為BANCR相關(guān)的細(xì)胞高轉(zhuǎn)移傾向提供了合理的解釋。

總之，本研究證實(shí)HCC組織和細(xì)胞系中BANCR表達(dá)上調(diào)，且其過(guò)表達(dá)與腫瘤發(fā)展和預(yù)后不良密切相關(guān)，調(diào)控HCC細(xì)胞系中BANCR表達(dá)會(huì)影響細(xì)胞的生物學(xué)特性。上述結(jié)果提示BANCR可能是參與HCC發(fā)生和發(fā)展的癌基因，可以作為HCC預(yù)后的新型標(biāo)志物和潛在的治療靶分子。

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Expression up-regulation of lncRNA BANCR in hepatocellular carcinoma tissue and its prognostic value on patients′ disease

ZhaoJi1，ZhouChao2，LiHongmin3，YangHongji1

(1.OrganTransplantationCenter;2.DepartmentofGastroenterology;3.DepartmentofOncology,SichuanProvincialPeople′sHospital,Chengdu,Sichuan610000,China)

Objective To investigate the expression up-regulation of BRAF activated LncRNA(BANCR) in hepatocellular carcinoma(HCC) tissue and its prognostic value on patients′ disease.Methods The quantitative real-time PCR(qRT-PCR) was used to detect BANCR expression in HCC tissues and cell lines.The association between BANCR expression level and clinicopathological features was also analyzed.3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT),flow cytometry,and transwell invasion and migration assays were used to investigate the biological function of BANCR in the HCC cells.Results Compared with adjacent noncancerous tissues,BANCR expression was remarkably increased in HCC tissue sample (P< 0.01),moreover BANCR expression in HCC cell lines was also significantly up-regulated (P<0.05).The clinicopathologic features analysis revealed that the BANCR expression increase was closely correlated with higher tumor grade,tumor size,venous infiltration and higher TNM staging(P<0.05).The total survival period in HCC patients with BANCR overexpression was significantly shorter than that in the patients with BANCR low expression (P<0.01).The multi-variate Cox regression analysis indicated that the BANCR expression(RR=4.245，P=0.015),tumor diameter(RR=2.655，P=0.039),venous invasion(RR=3.278，P=0.022) and TNM staging(RR=6.379，P=0.006) were the independent prognostic factor of the total survival period in the HCC patients.Moreover,BANCR expression down-regulation in Hep3B cells could significantly inhibit the cellular invasion and transfer,meanwhile led to vimentin down-regulation and E-cadherin up-regulation.Conclusion This research results suggest that BANCR may contribute to HCC initiation and development process and would be used as a marker of the prognosis in HCC patients as well as a therapeutic target.

RNA；liver neoplasms;hepatocellular carcinoma;long non-coding RNA,BANCR;prognosis

趙冀(1980-)，主治醫(yī)師，博士，主要從事器官移植、肝癌方面研究。

? 著·

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.02.002

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A

1671-8348(2017)02-0148-04

2016-07-20

2016-09-09)