蟾酥水提取物對(duì)小鼠免疫功能的影響

梁正敏,何家康,2,安寶聚,徐楊峰,聶海英,韋英益

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530005； 2.廣西獸藥制劑工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530003)

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蟾酥水提取物對(duì)小鼠免疫功能的影響

梁正敏1,何家康1,2,安寶聚1,徐楊峰1,聶海英1,韋英益1

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530005； 2.廣西獸藥制劑工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530003)

研究新提取的蟾酥水提取中試產(chǎn)品體內(nèi)外對(duì)小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)設(shè)蟾酥水提取物的高(2 mg/kg)、中(1 mg/kg)、低(0.5 mg/kg)劑量組、左旋咪唑組和生理鹽水組，連續(xù)腹腔注射給藥3 d后分別測(cè)定小鼠脾臟和胸腺指數(shù)、血液白細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)、血清中IL-2、IL-4、IL-12和IFN-γ濃度和脾淋巴細(xì)胞體外增殖能力；無(wú)菌分離健康小鼠的脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，加入不同質(zhì)量濃度的蟾酥水提取物(20、10、5 μg/ml)，協(xié)同LPS或Con A共同孵育48 h后，采用MTT法測(cè)定脾淋巴細(xì)胞增殖能力和ELISA法測(cè)定脾淋巴細(xì)胞上清液中的IL-2、IL-12、IL-4和IFN-γ含量。該蟾酥水提取物能協(xié)同Con A和LPS促進(jìn)脾T、B淋巴細(xì)胞的體外增殖能力(P<0.01)，促進(jìn)免疫器官生長(zhǎng)。明顯提高小鼠血清和脾淋巴細(xì)胞上清液中IL-2、IL-4、IL-12和IFN-γ水平(P<0.01)。該蟾酥水提取物中試產(chǎn)品通過(guò)促進(jìn)小鼠免疫細(xì)胞的增殖活性和細(xì)胞因子的分泌水平而發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用。

蟾酥水提取物；小鼠；免疫；器官指數(shù)；細(xì)胞因子；增殖

蟾酥為蟾賒科中華大蟾賒或黑眶蟾賒等的耳后腺及皮膚分泌的白色漿液,經(jīng)加工干燥制成，性味甘辛、溫、有毒[1]。蟾酥的化學(xué)成分主要有蟾蜍毒素類(lèi)、蟾毒配基類(lèi)、蟾毒色胺類(lèi)等[2]。蟾酥具有較好的強(qiáng)心、升壓、興奮中樞、抗炎、抗腫瘤、局部麻醉、提高機(jī)體免疫水平等作用[2]。有研究報(bào)道蟾酥注射液和華蟾毒精能夠顯著增強(qiáng)小鼠脾淋巴細(xì)胞體外對(duì)非特異性免疫刺激原的反應(yīng)，同時(shí)能夠?qū)φ{(diào)節(jié)Th1/Th2型細(xì)胞因子動(dòng)態(tài)平衡起作用[3-4]，宋宇等[5]發(fā)現(xiàn)蟾酥的成分之一華蟾毒精能夠明顯改善由環(huán)磷酰胺所引起的免疫低下作用。我們研究新改進(jìn)工藝提取的蟾酥水提取中試產(chǎn)品對(duì)體內(nèi)外小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用，為該蟾酥制劑的臨床推廣應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)和提供科學(xué)的根據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)昆明小鼠60只，體重(20±2)g，雌雄各半，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后用于實(shí)驗(yàn)，自由飲水飲食，溫度(24±1)℃，相對(duì)濕度為40%～60%。

1.2 藥物與試劑

蟾酥水提取物的制備：將蟾酥粉碎，用10倍量注射用水浸泡，研磨，加乙醇使含醇量達(dá)80%，攪勻，靜置，冷藏，濾過(guò)，濾液回收乙醇至無(wú)醇味；加適量注射用水，攪勻，靜置，冷藏，濾過(guò)，濾液即為蟾酥水提取物，經(jīng)檢測(cè)每1 ml含吲哚類(lèi)總生物堿以5-羥色胺計(jì)為200.2 μg。本研究所選蟾酥水提取物的劑量是基于先前本課題組對(duì)蟾酥水提取物體外抗炎的研究，參考文獻(xiàn)[6]。

刀豆蛋白A(Con A)、脂多糖(LPS)、MTT和臺(tái)盼藍(lán)均為Sigma產(chǎn)品；胎牛血清、RPMI-1640 完全培養(yǎng)液為Gibco產(chǎn)品；IL-2、IL-4、IL-12和IFN-γ ELISA檢測(cè)試劑盒為欣博盛產(chǎn)品。

1.3 蟾酥水提取物對(duì)小鼠免疫功能影響實(shí)驗(yàn)

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組與處理

將50只小鼠隨機(jī)分成5個(gè)組，即高(4 mg/kg)、中(1 mg/kg)、低(0.5 mg/kg)劑量的蟾酥水提取物組、左旋咪唑陽(yáng)性對(duì)照組(25 mg/kg)、空白對(duì)照組。連續(xù)3 d腹腔注射蟾酥水提取物、左旋咪唑，空白對(duì)照組注射等量生理鹽水。第4天，小鼠稱重后眼球采血，瑞士吉姆薩染色血涂片做白細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)，分離血清置于-80℃保存用于細(xì)胞因子的測(cè)定，分離脾臟和胸腺，稱重，用于計(jì)算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。

1.3.2 脾臟、胸腺指數(shù)測(cè)定

按以下公式計(jì)算小鼠器官指數(shù)：

1.3.3 血液白細(xì)胞計(jì)數(shù)

取小鼠新鮮血液10 μl于490 μl的3%的冰乙酸中，取一滴于血球計(jì)數(shù)板上，顯微鏡下計(jì)血液白細(xì)胞總數(shù)。另取少量血液均勻涂片，瑞士吉姆薩染色，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器在顯微鏡下進(jìn)行白細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)。每張玻片至少計(jì)數(shù)300個(gè)白細(xì)胞。

1.3.4 血清中IL-2、IL-4、IL-12、IFN-γ含量測(cè)定

小鼠眼球采血，4℃斜面放置過(guò)夜，3 000 r/min離心10 min，取血清置于-80℃冰箱內(nèi)保存，用于測(cè)定IL-2、IL-4、IL-12和IFN-γ水平。按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3.5 MTT法測(cè)定小鼠脾淋巴細(xì)胞體外增殖能力[4]

1.3.5.1 小鼠脾淋巴細(xì)胞混懸液的制備

無(wú)菌取小鼠脾臟至于滅菌平皿中，PBS清洗表面血漬，用玻璃注射器內(nèi)芯進(jìn)行研磨。經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，收集脾細(xì)胞濾液，1 500 r/min離心5 min，收集細(xì)胞沉淀。加入Tris-NH4Cl裂解液，室溫放置10 min后1 500 r/min離心5 min，棄上清液；沉淀的細(xì)胞用PBS液洗2次，用RPMI-1640完全培養(yǎng)液洗滌2次后重懸。臺(tái)盼藍(lán)染色，活細(xì)胞數(shù)大于95%，計(jì)數(shù)，備用。

1.3.5.2 小鼠脾T、B淋巴細(xì)胞增殖能力實(shí)驗(yàn)

調(diào)小鼠脾淋巴細(xì)胞為1×106個(gè)/ml，每孔加入100 μl，接種于96孔培養(yǎng)板，設(shè)Con A刺激組、LPS刺激組和空白對(duì)照組，Con A刺激組加入100 μl的終質(zhì)量濃度為5 μg/ml的Con A，LPS刺激組加入100 μl的終質(zhì)量濃度為20 μg/ml的LPS，空白對(duì)照組加入等量培養(yǎng)液，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)6個(gè)重復(fù)孔。37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)44 h，加入20 μl的MTT (質(zhì)量濃度5 mg/ml)，37℃孵育4 h，平板離心機(jī)1 800g離心10 min，吸棄細(xì)胞上清液，每孔加入100 μl DMSO，搖勻后靜置10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD490 nm。脾淋巴細(xì)胞增殖能力以刺激指數(shù)(SI)表示：

1.4 蟾酥水提取物對(duì)小鼠體外培養(yǎng)脾淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)

1.4.1 制備小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液

制備健康小鼠的脾淋巴細(xì)胞懸液，方法同1.3.5.1。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)分組與處理

實(shí)驗(yàn)設(shè)單藥組、Con A刺激組、LPS刺激組。單藥組設(shè)高(20 μg/ml)、中(10 μg/ml)、低(5 μg/ml)劑量蟾酥水提取物組和空白對(duì)照組，Con A刺激組設(shè)蟾酥水提取物協(xié)同Con A組和Con A對(duì)照組，LPS刺激組設(shè)蟾酥水提取物組協(xié)同LPS組和LPS對(duì)照組；Con A刺激組加入的終質(zhì)量濃度為5 μg/ml的Con A，LPS刺激組加入終質(zhì)量濃度為20 μg/ml的LPS，空白對(duì)照組加入等量完全培養(yǎng)基，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)6個(gè)重復(fù)孔，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 MTT法檢測(cè)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖影響

調(diào)整小鼠脾淋巴細(xì)胞為5×106個(gè)/ml，每孔加入100 μl接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入100 μl用培養(yǎng)液稀釋的不同質(zhì)量濃度蟾酥水提取物，加入10 μl終質(zhì)量濃度為5 μg/ml的Con A或20 μg/ml的LPS，37℃，5% CO2培養(yǎng)44 h，加入20 μl的MTT (質(zhì)量濃度5 mg/ml)，孵育4 h，MTT檢測(cè)方法同1.3.5.2。

1.4.4 ELISA法測(cè)細(xì)胞上清中IL-2、IL-4、IL-12和IFN-γ水平

每孔加入400 μl已制備好的小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，加入400 μl不同質(zhì)量濃度蟾酥水提取物，再加入50 μl終質(zhì)量濃度為5 μg/ml的Con A，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，3 000 r/min離心5 min，收集上清液凍存于-80℃用于IL-2、IL-4、IL-12和IFN-γ濃度檢測(cè)。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)注誤”表示，組間比較采用單因素ANOVA分析及t檢驗(yàn)。以“P<0.05”代表差異性顯著，“P<0.01”代表差異性極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟾酥水提取物對(duì)脾臟、胸腺指數(shù)的影響

蟾酥水提取物對(duì)脾臟、胸腺指數(shù)的影響見(jiàn)圖1。

圖1 蟾酥水提取物對(duì)脾臟、胸腺指數(shù)的影響

注：“*”和“**”分別表示與空白對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。

由圖1可知，與空白對(duì)照組相比，低劑量組的脾臟指數(shù)和中劑量組的胸腺指數(shù)顯著提高(P<0.05)；且中劑量組的脾臟指數(shù)和高劑量組的脾臟、胸腺指數(shù)極顯著提高(P<0.01)。結(jié)果表明，該蟾酥水提取物有可能通過(guò)促進(jìn)免疫器官的發(fā)育而發(fā)揮機(jī)體免疫調(diào)節(jié)作用。

2.2 蟾酥水提取物對(duì)血液中白細(xì)胞的影響

血液中白細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，高、中劑量的蟾酥水提取物組能顯著增加血液中白細(xì)胞總數(shù)，與空白對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)，見(jiàn)圖2。高、中劑量組極顯著促進(jìn)血液中淋巴細(xì)胞的增殖(P<0.01)，見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，該蟾酥水提取物能促進(jìn)白細(xì)胞增殖，其中以淋巴細(xì)胞的增殖最為明顯。

圖2 蟾酥水提取物對(duì)白細(xì)胞總數(shù)的影響

圖3 蟾酥水提取物對(duì)白細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)影響

2.3 蟾酥水提取物體內(nèi)對(duì)小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-12和IFN-γ的影響

蟾酥水提取物對(duì)小鼠血清中細(xì)胞因子的影響見(jiàn)圖4。

圖4 蟾酥水提取物對(duì)小鼠血清中細(xì)胞因子的影響

由圖4可見(jiàn)，高、中劑量組的蟾酥水提取物明顯提高小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-12和IFN-γ水平。與空白對(duì)照組比較，高劑量蟾酥水提取物極顯著升高血清中IL-2、IL-4、IL-12和IFN-γ水平(P<0.01)；中劑量蟾酥水提取物極顯著提高血清中IL-4和IL-12水平(P<0.01)，顯著增加IL-2和IFN-γ濃度(P<0.05)；低劑量蟾酥水提取物極顯著上調(diào)IL-2水平(P<0.01)，但對(duì)IL-4、IL-12和IFN-γ水平無(wú)顯著影響。結(jié)果表明，該蟾酥水提取物能通過(guò)上調(diào)血清中IL-2、IL-4、IL-12和IFN-γ分泌水平發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用。

2.4 蟾酥水提取物對(duì)體內(nèi)脾淋巴細(xì)胞增殖能力的影響

蟾酥水提取物對(duì)體內(nèi)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力的影響見(jiàn)圖5。

圖5 蟾酥水提取物對(duì)體內(nèi)小鼠脾淋巴 細(xì)胞增殖能力的影響

由圖5可見(jiàn)，高、中劑量組的蟾酥水提取物能促進(jìn)Con A或LPS誘導(dǎo)的小鼠脾T、B淋巴細(xì)胞體外增殖能力，與空白對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)或顯著(P<0.05)。另外，蟾酥水提取物對(duì)正常小鼠T、B淋巴細(xì)胞體外增殖能力無(wú)顯著影響。結(jié)果表明了該蟾酥水提取物可通過(guò)增強(qiáng)小鼠體內(nèi)脾淋巴細(xì)胞增殖能力，從而參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用。

2.5 蟾酥水提取物體外對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)增殖的影響

蟾酥水提取物體外對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響見(jiàn)圖6。

圖6 蟾酥水提取物體外對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠 脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

由圖6可見(jiàn)，與空白對(duì)照組比較，單藥組的高劑量蟾酥水提取物極顯著促進(jìn)體外培養(yǎng)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力(P<0.01)，中劑量顯著促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖(P<0.05)。與Con A對(duì)照組比較，高、中劑量蟾酥水提取物對(duì)脾T淋巴細(xì)胞的增殖有極顯著促進(jìn)作用(P<0.01)。與LPS對(duì)照組比較，高、中劑量極顯著促進(jìn)脾B淋巴細(xì)胞增殖(P<0.01)。結(jié)果表明，蟾酥水提取物能顯著提高體外培養(yǎng)的脾淋巴細(xì)胞增殖能力，并具有一定量效關(guān)系，隨著蟾酥水提取物質(zhì)量濃度的升高，刺激指數(shù)也隨著升高。

2.6 蟾酥水提取物對(duì)體外培養(yǎng)的脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2、IL-4、IL-12和IFN-γ的影響

蟾酥水提取物可促進(jìn)無(wú)Con A刺激的脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2、IL-4、IL-12和IFN-γ，但與空白對(duì)照比相比差異不顯著，見(jiàn)圖7。在Con A協(xié)同作用下，高、中劑量蟾酥水提取物極顯著促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞分泌IL-12(P<0.01)，高劑量蟾酥水提取物顯著增加IL-2、IL-4和IFN-γ分泌(P<0.05)，中、低劑量蟾酥水提取物對(duì)IL-2、IL-4和IFN-γ分泌有促進(jìn)作用，但與空白對(duì)照組比差異不顯著，見(jiàn)圖8。

圖7 蟾酥水提取物對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠脾 淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響

圖8 蟾酥水提取物對(duì)Con A誘導(dǎo)的小鼠脾 淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響

3 討論

動(dòng)物機(jī)體免疫器官狀態(tài)在一定程度上能反映免疫細(xì)胞的增殖情況。胸腺屬于中樞免疫器官，是T淋巴細(xì)胞分化、成熟的場(chǎng)所，其功能狀態(tài)直接或間接地決定機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫水平。脾臟屬于最大的外周免疫器官。胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)在一定程度上可作為衡量機(jī)內(nèi)內(nèi)免疫功能的觀察指標(biāo)[7]。在本研究中，蟾酥水提取物高、中劑量組能顯著升高小鼠的胸腺和脾臟指數(shù)，表明了蟾酥水提取物能通過(guò)升高免疫器官指數(shù)而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

動(dòng)物機(jī)體中各種白細(xì)胞是機(jī)體防御體系的重要組成部分，具有吞噬異物、產(chǎn)生抗體、治愈機(jī)體傷病、抵抗病原體的入侵等作用，是機(jī)體防御系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分[8]。淋巴細(xì)胞是主要的免疫活性細(xì)胞，受抗原刺激后能分化增殖，產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，參與體液免疫和細(xì)胞免疫。單核細(xì)胞可通過(guò)吞噬、調(diào)理抗原而產(chǎn)生抗體等方式，抵御和消滅入侵機(jī)體的病原微生物，或者誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)[9]。本研究結(jié)果顯示，蟾酥水提取物能增加小鼠血液總白細(xì)胞總數(shù)，促進(jìn)對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖作用尤為明顯。另外，蟾酥水提取物能與Con A與LPS的協(xié)同作用促進(jìn)淋巴細(xì)胞的體外增殖能力。

在正常生理情況條件下，細(xì)胞因子具有免疫調(diào)節(jié)，具有促進(jìn)造血、抗病毒等作用，在某些刺激條件或因子作用可介導(dǎo)病理性反應(yīng)，導(dǎo)致某些病理過(guò)程的發(fā)生。在不同細(xì)胞因子作用下，Th細(xì)胞可以分為T(mén)hl細(xì)胞和Th2細(xì)胞亞群[10]。通常情況下，Th1/Th2型細(xì)胞因子處于動(dòng)態(tài)平衡。而IFN-γ和IL-4的含量變化可反映Thl細(xì)胞和Th2細(xì)胞的功能，反映機(jī)體的免疫的平衡狀態(tài)[11]。本研究結(jié)果表明，該蟾酥水提取物能促進(jìn)免疫細(xì)胞增值能力，促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2、IL-4、IL-12和IFN-γ，升高小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-12和IFN-γ細(xì)胞因子水平，這種上調(diào)作用可能是蟾酥水提取物發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵因素之一。

于洋等[4]曾用蟾酥注射液(批號(hào)為20080501)對(duì)小鼠進(jìn)行免疫影響方面的實(shí)驗(yàn)，而本實(shí)驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化后的蟾酥水提取(批號(hào)為20130625)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)小鼠免疫功能方面影響的研究，結(jié)果表明了該蟾酥水提取物能明顯促進(jìn)免疫器官脾臟和胸腺的生長(zhǎng)，無(wú)論是體內(nèi)還是體外實(shí)驗(yàn)，蟾酥水提取物都能明顯促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖，上調(diào)細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-12和IFN-γ的表達(dá)，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與于洋等研究結(jié)果相一致[4]。由此可推測(cè)，經(jīng)過(guò)優(yōu)化提取工藝后的蟾酥水提取物并未改變其免疫調(diào)節(jié)的作用。雖然蟾酥具有很大的潛在藥用價(jià)值，但因其本身具有一定的毒性作用而使其在應(yīng)用上受到一定的限制，最近有文獻(xiàn)報(bào)道蟾酥可能誘導(dǎo)心肌損傷[12]以及通過(guò)激活NF-κB(核轉(zhuǎn)錄因子κB)信號(hào)通路和抑制BDNF(腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子)的表達(dá)引發(fā)神經(jīng)毒性[13],使得蟾酥的提取工藝及其臨床應(yīng)用上還需要更深入的研究。

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(責(zé)任編輯：梅 竹)

Effects of water extract of bufonid on immune functions of mouse

LIANG Zheng-ming1,HE Jia-kang1,2,AN Bao-ju1,XU Yang-feng1,NIE Hang-ying1,WEI Ying-yi1

(1.College of Animal Science and Technology,Guangxi University, Nanning 530005，China; 2.Engineering Research Center for Veterinary Medicine Preparations in Guangxi,Nanning 530005, China)

The effects of trial production of water extract of bufonid on immune function in mouse in vivo and in vitro were studied.The mice were randomly divided into five group：high (2 mg/kg),middle (1 mg/kg),low (0.5 mg/kg) dosage group of water extract of bufonid,levamisole control group and normal control group in vivo.Mice were given intraperitoneally water extract of bufonid,levamisole and saline for three days.The effects of water extract of bufonid on mice immunocytes were evaluated, the immune organ index,differential leukocyte count,the secretion of IL-2,IL-4,IL-12 and IFN-γ in serum.The spleen lymphocytes of healthy mice were cultured,added different concentrations of water extract of bufonid(20,10,5 μg/ml) and incubated for 48 h,MTT method was used to assess the proliferation ability of spleen lymphocytes,and the concentrations of IL-2,IL-12,IL-4 and IFN-γ in the supernatant of cell culture were measured by ELISA.The experiment results showed that water extract of bufonid markedly enhanced the growth of immune organs,increased the proliferation of spleen lymphocyte and the IL-2,IL-12,IL-4,and IFN-γ secretion.The results indicated that the pilot products of water extract of bufonid could improve immune function by promoting the proliferation of immune cells and immune cytokine secretion.

water extract of bufonid;mouse;immune;organ index;cytokine;proliferation

2016-10-08；

2016-11-07

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360624)；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014GXNSFAA118115)；廣西大學(xué)基金(XBZ120918)。

梁正敏(1992-)，女，碩士生，主要從事中獸醫(yī)藥研究。

韋英益(1973-)，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物病理學(xué)與免疫病理研究 。

10.7633/j.issn.1003-6202.2017.01.011

S816.7

A

1003-6202(2017)01-0043-05