糧食中真菌毒素快速定量檢測(cè)方法應(yīng)用比較研究

李小明，銀堯明，羅 穎，王 霞張 華

（1.遂寧市糧食質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站，四川遂寧 629000；2.重慶市糧油質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站重慶 400037；3.四川巴中國(guó)家糧食質(zhì)量檢測(cè)站，四川巴中 636000）

糧食中真菌毒素快速定量檢測(cè)方法應(yīng)用比較研究

李小明1，銀堯明1，羅 穎1，王 霞2張 華3

（1.遂寧市糧食質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站，四川遂寧 629000；2.重慶市糧油質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站重慶 400037；3.四川巴中國(guó)家糧食質(zhì)量檢測(cè)站，四川巴中 636000）

采用便攜式真菌毒素快速定量檢測(cè)儀對(duì)玉米中黃曲霉毒素B1和嘔吐毒素進(jìn)行定量檢測(cè)，同時(shí)與酶聯(lián)免疫法對(duì)比檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果顯示黃曲霉毒素B1快速定量檢測(cè)卡檢出限為1.75 μg／kg；準(zhǔn)確性與所采用酶聯(lián)免疫法無(wú)顯著差異；檢測(cè)結(jié)果變異系數(shù)范圍在7%～11.2%之間，平均變異系數(shù)為8. 7%；定量檢測(cè)儀臺(tái)間無(wú)顯著差異。嘔吐毒素快速定量檢測(cè)卡檢測(cè)限為0.078 mg／kg；定量檢測(cè)儀臺(tái)間無(wú)顯著差異；采用便攜式定量檢測(cè)儀具有簡(jiǎn)單、快速、成本低、能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)操作且實(shí)時(shí)上傳數(shù)據(jù)并記錄監(jiān)測(cè)地點(diǎn)位置等優(yōu)勢(shì)，具有較好的推廣使用價(jià)值，特別適用于衛(wèi)生調(diào)查、研究、篩查等現(xiàn)場(chǎng)使用。

膠體金；黃曲霉毒素B1；嘔吐毒素；玉米；快速定量

真菌毒素是一種由霉菌或真菌產(chǎn)生的次生代謝物，廣泛存在于糧油食品和飼料中［1］，主要有黃曲霉毒素B1、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素、赭曲霉毒素等。根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食農(nóng)業(yè)組織統(tǒng)計(jì)，全世界每年約25%的谷物被霉菌所污染［2］。真菌毒素是一類(lèi)具有致癌、致畸、致突變性的毒性極強(qiáng)的化合物，人們攝入被污染的食品后，會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生極大損害。針對(duì)糧食質(zhì)量安全問(wèn)題，《糧食管理流通條例》和糧食衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)都明確規(guī)定糧食收購(gòu)要對(duì)真菌毒素進(jìn)行檢驗(yàn)，但中國(guó)糧油種植區(qū)分布廣泛，糧食收購(gòu)多集中在縣以下單位的收儲(chǔ)庫(kù)點(diǎn)，時(shí)間短，收購(gòu)量大，無(wú)法及時(shí)利用現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法檢測(cè)糧食中真菌毒素含量［3］。

現(xiàn)有真菌毒素的定量分析一般采用薄層色譜法（TLC）、酶聯(lián)免疫法（ELISA）和高效液相色譜法（HPLC）。3種方法均須在實(shí)驗(yàn)室條件下嚴(yán)格控制條件，進(jìn)行復(fù)雜的樣品前處理，才能出具結(jié)果，無(wú)法適應(yīng)現(xiàn)場(chǎng)收購(gòu)快速檢驗(yàn)的需要。因此，建立簡(jiǎn)便、高效、低成本的現(xiàn)場(chǎng)快速篩選檢測(cè)方法迫在眉睫［4］。近幾年，隨著生物技術(shù)應(yīng)用的不斷突破，一種基于酶聯(lián)免疫反應(yīng)原理的快速檢測(cè)方法——膠體金檢測(cè)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，這項(xiàng)技術(shù)產(chǎn)品能在一定范圍內(nèi)準(zhǔn)確、快速檢測(cè)真菌毒素的含量，適用于現(xiàn)場(chǎng)操作［5］。

為了驗(yàn)證黃曲霉毒素B1（AFB1）與嘔吐毒素（DON）膠體金快速定量檢測(cè)卡在糧食中的適用性，本實(shí)驗(yàn)對(duì)真菌毒素快速定量檢測(cè)系統(tǒng)與ELISA方法進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證。旨在開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確，尤其前處理簡(jiǎn)單，適用于現(xiàn)場(chǎng)快速的真菌毒素分析方法。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

參考糧食衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，確定本驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)糧種為玉米，考慮到加標(biāo)樣品的毒素分布、均勻性等影響，本驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)全部采用射洪縣潼射鎮(zhèn)的樣品進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證毒素為AFB1和DON，供AFB1檢測(cè)用樣品為94份，供DON檢測(cè)用樣品為91份。

1.2 材料與設(shè)備

AFB1和DON膠體金快速定量測(cè)試卡：成都盛泰爾生物醫(yī)藥科技有限公司；Elisa試劑盒：美國(guó)Romer公司。

1.3 樣品處理

驗(yàn)證用樣品為陽(yáng)性玉米樣品，經(jīng)粗碎與連續(xù)多次用四分法縮減至0.5～1kg，然后全部粉碎全部通過(guò)20目篩，混勻。

稱(chēng)取2 g樣品于提取瓶中，加入4 mL提取劑A，振搖5 min，靜置3 min，使用注射器和微孔濾膜過(guò)濾，收集1～1.5 mL樣液于1.5 mL塑料管中備用。取100 μL樣液加入樣品緩沖液400 μL混勻，待檢。

同時(shí)按照Elisa測(cè)試方法進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。

1.4 樣品檢測(cè)

從檢測(cè)卡袋中取出檢測(cè)卡，在卡上做好樣品編號(hào)標(biāo)記；用移液器吸取120 μL待檢樣液，滴入加樣孔中，加樣后開(kāi)始計(jì)時(shí)，15 min放入手持式讀卡儀讀取結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃曲霉毒素B1

使用真菌毒素快速定量檢測(cè)系統(tǒng)和Elisa試劑盒共檢測(cè)94個(gè)樣品，其中有55個(gè)樣品AFB1含量小于2 μg／kg，39個(gè)樣品AFB1含量超過(guò)2 μg／kg。

2.1.1 方法的檢出限（LOD）

按照《糧油檢驗(yàn)糧食中黃曲霉毒素B1測(cè)定膠體金快速定量法》（LS／T 6111—2015），用真菌毒素快速定量檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定7個(gè)低含量樣品中的AFB1檢測(cè)值，通過(guò)公式ˉX＋3×SD（ˉX為樣品的算術(shù)平均值，SD為樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差）計(jì)算出方法檢出限為1.75 μg／kg，見(jiàn)表1。

表1 AFB1快速定量檢測(cè)系統(tǒng)檢出限測(cè)試結(jié)果 μg／kg

2.1.2 準(zhǔn)確性

用真菌毒素快速定量檢測(cè)系統(tǒng)分別測(cè)定39個(gè)不同AFB1含量樣品，測(cè)定結(jié)果與國(guó)標(biāo)GB／T 5009. 22—2003第二法酶聯(lián)免疫法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)比較2種方法是否存在顯著性差異，經(jīng)計(jì)算t＝1.32，t雙尾臨界（0.05，39）＝2.02，t＜t雙尾臨界（0.05，39），說(shuō)明AFB1快速定量檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果與國(guó)標(biāo)GB／T 5009.22—2003酶聯(lián)免疫結(jié)果無(wú)顯著性差異，見(jiàn)表2。

表2 AFB1快速定量檢測(cè)系統(tǒng)準(zhǔn)確性對(duì)比結(jié)果 μg／kg

序號(hào) 樣品編號(hào)AFB1快速定量檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果 酶聯(lián)免疫結(jié)果17 SN340 10 11 18 SN327 44 46.9 19 SN343 52 55 20 SN256 28 28 21 SN275 18 22.7 22 SN331 21 21.2 23 SN250 15 13.7 24 SN336 61 65 25 SN322 35 32.7 26 SN310 10 9.8 27 SN298 2.3 3.9 28 SN305 40 39.8 29 SN329 30 31.1 30 SN267 40 35.9 31 SN213 6.7 6.9 32 SN342 5 5.6 33 SN26 33 27.3 34 SN247 60 68 35 SN164 16 12.9 36 SN173 19 23 37 SN272 58 58 38 SN130 61 67 39 SN323 39 41.6

2.1.3 重復(fù)性

用真菌毒素快速定量檢測(cè)系統(tǒng)在相同實(shí)驗(yàn)條件下，使用不同檢測(cè)卡檢測(cè)相同樣本，重復(fù)測(cè)定玉米高、中、低三種樣品，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)6次，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3，重復(fù)測(cè)定的變異系數(shù)范圍在7%～11.2%之間，平均變異系數(shù)為8.7%。

表3 AFB1快速定量檢測(cè)系統(tǒng)重復(fù)性結(jié)果

2.1.4 臺(tái)間差

分別用2臺(tái)真菌毒素快速定量檢測(cè)系統(tǒng)儀器同時(shí)對(duì)39個(gè)不同AFB1含量樣品進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果采用配對(duì)t檢驗(yàn)來(lái)比較2臺(tái)儀器間是否存在顯著性差異，經(jīng)計(jì)算t＝0.26，t雙尾臨界（0.05，39）＝2.02，t＜t雙尾臨界（0.05，39），說(shuō)明不同AFB1快速定量檢測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果無(wú)差異，見(jiàn)表4。

表4 AFB1快速定量檢測(cè)系統(tǒng)臺(tái)間對(duì)比結(jié)果 μg／kg

2.2 嘔吐毒素

使用真菌毒素快速定量檢測(cè)系統(tǒng)和Elisa試劑盒共檢測(cè)91樣品，其中有87個(gè)樣品DON含量小于0.25 mg／kg，4個(gè)樣品DON含量超過(guò)0.25 mg／kg。2.2.1 方法的檢出限（LOD）

按照《糧油檢驗(yàn)糧食中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇測(cè)定膠體金快速定量法》（LS／T 6113—2015），用真菌毒素快速定量檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定7個(gè)低含量樣品中的DON含量，通過(guò)公式ˉX＋3×SD（ˉX為樣品的算術(shù)平均值，SD為樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差）計(jì)算出其檢出限為0.078 mg／kg，見(jiàn)表5。

表5 DON快速定量檢測(cè)系統(tǒng)檢出限測(cè)試結(jié)果 mg／kg

2.2.2 準(zhǔn)確性

用真菌毒素快速定量檢測(cè)系統(tǒng)分別測(cè)定4個(gè)不同DON含量樣品，測(cè)定結(jié)果與國(guó)標(biāo)GB／T 5009. 22—2003第二法酶聯(lián)免疫法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)比較2種方法是否存在顯著性差異，經(jīng)計(jì)算t＝0.44，t雙尾臨界（0.05，4）＝2.78，t＜t雙尾臨界（0.05，4），說(shuō)明DON快速定量檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果與國(guó)標(biāo)GB／T 5009.22—2003酶聯(lián)免疫結(jié)果無(wú)顯著性差異，見(jiàn)表6。

表6 DON快速定量檢測(cè)系統(tǒng)準(zhǔn)確性對(duì)比結(jié)果 mg／kg

但是由于樣品收集太少且沒(méi)有超標(biāo)（國(guó)標(biāo)為1 mg／kg）和高值樣品，因此需要更多陽(yáng)性樣品對(duì)準(zhǔn)確性進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.2.3 臺(tái)間差

分別用2臺(tái)真菌毒素快速定量檢測(cè)系統(tǒng)儀器同時(shí)對(duì)4個(gè)不同DON含量樣品進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果采用配對(duì)t檢驗(yàn)來(lái)比較2臺(tái)儀器間是否存在顯著性差異，經(jīng)計(jì)算t＝ 0.39，t雙尾臨界（0.05，4）＝2.78，t＜t雙尾臨界（0.05，4），說(shuō)明不同DON快速定量檢測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果無(wú)差異，見(jiàn)表7。

表7 DON快速定量檢測(cè)系統(tǒng)臺(tái)間對(duì)比結(jié)果 mg／kg

3 結(jié)論

膠體金快速定量檢測(cè)卡法檢測(cè)玉米中黃曲霉毒素B1、嘔吐毒素含量前處理簡(jiǎn)單，僅有加樣、層析、讀數(shù)這3個(gè)步驟，在25 min之內(nèi)就能完成一個(gè)樣品的測(cè)定，方法要求條件低，操作簡(jiǎn)單，適用于現(xiàn)場(chǎng)快速定量初篩檢測(cè)。其中黃曲霉毒素B1檢測(cè)的檢出限、準(zhǔn)確性、重復(fù)性、臺(tái)間差等參數(shù)分析均能滿足測(cè)定要求；嘔吐毒素由于未收集到足夠的陽(yáng)性樣品，未對(duì)重復(fù)性進(jìn)行考察，準(zhǔn)確性也需要更多陽(yáng)性樣品進(jìn)行確認(rèn)，但是檢出限和臺(tái)間差等參數(shù)均滿足測(cè)定要求。

［1］施兆鵬，朱旗，毛清黎，等.糧食真菌毒素污染的預(yù)防與脫毒［J］.食品科學(xué)，2003（8）：264－268.

［2］段文仲，呂紅英，龐津霞.動(dòng)物源性食品中黃曲霉毒素污染的控制研究［J］，動(dòng)物科學(xué)，2009（7）：206－208.

［3］鞠興榮，萬(wàn)忠民，陳建偉.糧食安全控制體系的建立［J］.糧食儲(chǔ)藏，2009（3）：18－21.

［4］姜翠翠，邱松山，李波，等.糧食中真菌毒素的檢測(cè)及脫毒方法探討［C］.“食品加工與安全”學(xué)術(shù)研討會(huì)暨2010年廣東省食品學(xué)會(huì)年會(huì)會(huì)議論文集，2010.

［5］張道宏，李培武，張奇，等.污染糧油食品的主要真菌毒素及膠體金免疫層析技術(shù)在快速檢測(cè)中的應(yīng)用［J］.中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2010（4）：577－582.

Comparative study on the rapid quantitative detection of mycotoxins in grain

LI Xiaoming1，YIN Yao－ming1，LUO Ying1，Wang Xia2，Zhang Hua3
（1.Suining food quality supervision and inspection station，Suining Sichuan 629000；2.Chongqing grain and oil quality supervision and inspection station，Chongqing 400037；3.Bazhong national food quality monitoring station，Bazhong Sichuan 636000）

The aflatoxin B1and deoxynivalenol in corn was quantitatively detected by portable mycotoxin rapid quantitative detector，the result was compared with that by enzyme linked immunosorbent assay. The results showed that the detection limit of aflatoxin B1was 1.75 μg／kg by rapid quantitative detection card.The accuracy had no significant difference between the two methods；weight measurement range of the coefficient of variation between 7%～11.2%，the average coefficient of variation was 8.7%；no significant difference among the quantitative detectors.The detection limit was 0.078 mg／kg by deoxynivalenol rapid quantitative detection card；no significant difference among the quantitative detectors.The portable quantitative detector has the advantages of simple，fast，low cost，can realize site operation and upload real－time data and recording monitoring site location，which is worth promotion，particularly being used in the health survey，research，screening and other field.

colloidal gold；aflatoxin B1；vomitoxin；maize；rapid quantitative

TS 207.3

A

1007－7561（2017）01－0054－04

2016－06－23

李小明，1974年出生，男，大學(xué)本科，工程師.