阿昔替尼聯(lián)合塞來(lái)昔布體外抗胃癌細(xì)胞BGC-823和SNU-5增殖及抗血管生成作用觀察

黃照茹，張連峰，周 琳

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 鄭州 450052

阿昔替尼聯(lián)合塞來(lái)昔布體外抗胃癌細(xì)胞BGC-823和SNU-5增殖及抗血管生成作用觀察

黃照茹，張連峰，周 琳#

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 鄭州 450052

#通信作者，女，1977年7月生，博士，副主任醫(yī)師，副教授，研究方向：胰腺疾病的基礎(chǔ)與臨床，E-mail：ZL372@126.com

塞來(lái)昔布；阿昔替尼；胃癌；聯(lián)合用藥；BGC-823細(xì)胞;SNU-5細(xì)胞

目的：探索阿昔替尼(Ax)和塞來(lái)昔布(Cel)在胃癌細(xì)胞株BGC-823和SNU-5的聯(lián)合效應(yīng)及對(duì)新生血管形成的影響。方法：SRB法測(cè)定10 nmol/L Cel和1 nmol/L Ax以及聯(lián)合用藥對(duì)BGC-823細(xì)胞增殖的抑制作用，CCK-8法檢測(cè)Cel和Ax以及聯(lián)合用藥對(duì)SNU-5細(xì)胞增殖的抑制作用，Matrial膠體外管腔形成法檢測(cè)藥物對(duì)于新生血管的影響。結(jié)果：在BGC-823和SNU-5細(xì)胞株中，Cel和Ax單藥均可抑制BGC-823和SNU-5細(xì)胞的增殖，聯(lián)合用藥組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率高于Cel和Ax單藥組，聯(lián)合用藥指數(shù)<1。Cel和Ax單藥組對(duì)HUVEC細(xì)胞的管腔形成系數(shù)分別為(0.86±0.03)和(0.83±0.01)，聯(lián)合這2種藥物之后，管腔形成系數(shù)下降為(0.67±0.02)(P<0.05)。結(jié)論：Cel和Ax的聯(lián)合用藥方案不僅比單一用藥有更高的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，并且還具有協(xié)同抑制新生血管形成的作用。

胃癌在所有惡性腫瘤中的致死率排第2，其5 a生存率不到25%[1]，新診斷的患者中有70%都有局部的侵襲或者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后很差[2]。VEGFR在腫瘤組織中的高表達(dá)逐漸被人們認(rèn)識(shí)到，于是針對(duì)VEGF/VEGFR這個(gè)通路的抑制劑不斷地被用于腫瘤的治療,例如，阿昔替尼(axitinib，Ax)作為2012年上市的新藥，在臨床上被用于晚期腎癌的治療。環(huán)氧合酶-2(COX-2)是一種可誘導(dǎo)的酶，它參與了腫瘤的形成，并且它上調(diào)的程度是決定腫瘤預(yù)后的重要因素[3]。除此之外，COX-2還通過(guò)多種途徑參與胃腸系統(tǒng)腫瘤的形成[4]。最近還有研究[5]發(fā)現(xiàn)COX-2和多重耐藥(MDR)有關(guān)，它的拮抗劑可以逆轉(zhuǎn)MDR現(xiàn)象。塞來(lái)昔布(celecoxib，Cel)是一種新型的COX-2選擇性抑制劑，其臨床常用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療。Cel和各種常用化療藥合用于胃癌也被證實(shí)是有效的[6]。作者將Ax與Cel聯(lián)合用于胃癌細(xì)胞株，在體外獲得了很好的協(xié)同抑制作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑 人胃癌細(xì)胞株BGC-823和SNU-5保存于鄭州大學(xué)腫瘤中心實(shí)驗(yàn)室；Ax和Cel購(gòu)于上海藍(lán)木化工有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)液、IMDM培養(yǎng)基及胎牛血清為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；磺酰羅丹明B(SRB)為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；CCK-8(日本Dojindo公司)；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)及其培養(yǎng)液購(gòu)于德國(guó)PromoCell公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、10 nmol/L Cel組、1 nmol/L Ax組和10 nmol/L Cel+1 nmol/L Ax組。

1.3 SRB比色法檢測(cè)BGC-823細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率 將BGC-823細(xì)胞懸液按每孔3 000個(gè)的密度在96孔板中培養(yǎng)24 h，將稀釋好的化合物加入培養(yǎng)液中，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)72 h。倒掉培養(yǎng)液后，每孔加入100 μL預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸溶液，4 ℃放置2 h固定細(xì)胞。洗去固定液并晾干，然后每孔加入100 μL SRB溶液染色，室溫放置30 min，用體積分?jǐn)?shù)1%的乙酸溶液洗去未結(jié)合染料。晾干96孔板，加入150 μL 非緩沖Tris-Base堿液溶解染料并振蕩后，采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔OD值,計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)復(fù)孔。

1.4 CCK-8比色法檢測(cè)SNU-5細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率

將SNU-5細(xì)胞按每孔5 000個(gè)的密度接種于96孔板中，將稀釋好的化合物加入培養(yǎng)液，培養(yǎng)72 h。向每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)在37 ℃孵育4 h，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于450 nm波長(zhǎng)讀取每孔OD值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)復(fù)孔。

1.5 Matrial膠體外管腔形成法檢測(cè)藥物對(duì)新生血管形成的影響 將70 μL融化了的Matrial膠加于96孔板中，放置于37 ℃培養(yǎng)箱待其凝固。每孔加入含20 000個(gè)HUVEC的懸液，同時(shí)加入稀釋好的藥物。37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下培養(yǎng)4 h后，100倍相差顯微鏡下觀察各組血管腔形成情況，按下列公式計(jì)算管腔系數(shù)：管腔系數(shù)=實(shí)驗(yàn)組管腔數(shù)量/空白對(duì)照組管腔數(shù)量。為了排除細(xì)胞死亡對(duì)管腔形成的影響，同步用SRB法觀察藥物作用于HUVEC 4 h 對(duì)細(xì)胞增殖的影響。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)復(fù)孔。

1.6 Compusyn軟件分析 應(yīng)用Compusyn 軟件計(jì)算協(xié)同效應(yīng)，該軟件應(yīng)用Chou-Talalay聯(lián)合指數(shù)法計(jì)算2種或2種以上的化合物之間的作用。在一定的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率時(shí)，D1和D2分別表示兩者聯(lián)用時(shí)化合物1和化合物2的濃度，DX1和DX2分別表示為了達(dá)到相同的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率單用化合物1和化合物2的濃度。最終聯(lián)合用藥指數(shù)(combination index，CI)通過(guò)以下公式計(jì)算：CI=(D1/DX1)+(D2/DX2)。CI<1表示2種藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用是協(xié)同的，CI>1表示拮抗。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，不同組間體外管腔形成系數(shù)的比較采用2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Ax和Cel聯(lián)合用藥對(duì)胃癌細(xì)胞株的抑制作用

作用于BGC-823細(xì)胞時(shí)，不論細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的變化，CI均<1。而作用于SNU-5細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率≥0.2時(shí)，CI<1；當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=0.1時(shí)，CI>1。

2.2 Ax和Cel單用或聯(lián)合用藥對(duì)Matrial膠體外管腔形成的影響 結(jié)果見(jiàn)表1。同時(shí)，形成管腔的形態(tài)也受到了影響，空白對(duì)照組形成的管腔小而密，單用Cel和Ax時(shí)形成的管腔較大且疏松，聯(lián)合用藥時(shí)管腔最大且疏松(圖1)。

表1 各組管腔形成系數(shù)比較

FCel=15.959，F(xiàn)Ax=4.242，F(xiàn)交互=9.804，P均<0.05。

A：空白對(duì)照組；B:10 nmol/L Cel組；C:1 nmol/L Ax組；D:10 nmol/L Cel+1 nmol/L Ax組。圖1 各組Matrial膠體外管腔形成觀察(×100)

3 討論

胃癌在過(guò)去的30 a里發(fā)病率不斷增長(zhǎng)，對(duì)中國(guó)人的健康產(chǎn)生了嚴(yán)重的威脅。臨床上，進(jìn)展期胃癌最常用的聯(lián)合用藥方案是氟尿嘧啶和順鉑，但是仍然得不到滿(mǎn)意的療效[7]。到目前為止，即使酪氨酸激酶在胃癌的動(dòng)物模型中被證實(shí)具有顯著的抗腫瘤活性，但是仍然沒(méi)有被用在人的胃癌治療中。Ax是繼貝伐單抗和索拉菲尼之后的新型血管生成抑制劑，其在胃癌中單用或者聯(lián)合常用化療藥物具有較大的潛在活性。胃癌除了高表達(dá)VEGFR外還高表達(dá)COX-2[8]。Cel是選擇性COX-2抑制劑，目前發(fā)現(xiàn)Cel可以在體外抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖[9]?？紤]到Ax單獨(dú)用或者聯(lián)用其他細(xì)胞毒類(lèi)藥物都具有很好的抗腫瘤活性，而且胃癌確實(shí)需要有效的聯(lián)合用藥方案，于是作者在胃癌的體外研究中聯(lián)合使用了Ax和Cel。

該研究采用了Ax和Cel單藥以及聯(lián)合用藥作用于胃癌BGC-823和SNU-5細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)作用于BGC-823細(xì)胞時(shí)CI<1，表明聯(lián)合用藥在BGC-823細(xì)胞具有協(xié)同作用。而作用于SNU-5細(xì)胞時(shí)，在細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=0.1時(shí)，CI>1，說(shuō)明這2種藥物在較低細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的時(shí)候并不具有協(xié)同作用；在細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率≥0.2時(shí)，CI<1。至于BGC-823和SNU-5有不同的聯(lián)合效應(yīng)有待于進(jìn)一步的探索。當(dāng)用于抑制Matrial膠體外管腔形成時(shí)，單用10 nmol/L的Cel和1 nmol/L的Ax的管腔形成系數(shù)分別為(0.86±0.03)及(0.83±0.01)，而聯(lián)合用藥組的管腔形成系數(shù)為(0.67±0.02)，證明聯(lián)合用藥組的管腔形成抑制明顯增加。作者未來(lái)將在雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn)和裸鼠動(dòng)物模型上進(jìn)一步驗(yàn)證聯(lián)合之后的抗血管生成效益，并探索它的機(jī)制。

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(2016-01-30收稿 責(zé)任編輯姜春霞)

Combination efficacy of axitinib and celecoxib on proliferation of gastric cancer cells BGC-823 and SNU-5 and its antiangiogenesis effect

HUANGZhaoru,ZHANGLianfeng，ZHOULin

DepartmentofGastroenterology，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

celecoxib;axitinib;gastric cancer;combination therapy；BGC-823 cell;SNU-5 cell

Aim: To explore the combination efficacy of axitinib(Ax) and celecoxib(Cel) on the proliferation of gastric cancer cell lines BGC-823 and SNU-5 and antiangiogenesis effect. Methods: SRB and CCK-8 methods were used to assess the effect of 10 nmol/L Cel and 1 nmol/L Ax on the proliferation of BGC-823 and SNU-5,respectively. Capillary formation was detected by Matrial-plug assayinvitro.Results: SRB and CCK-8 assay showed that Cel and Ax inhibited the proliferation of BGC-823 and SNU-5. The inhibitory rate of combined treatment with Cel and Ax was significantly higher than that of Cel or Ax alone,and the combination index was lower than 1. The vascular indexes of HUVEC treated by Cel and Ax were (0.86±0.03) and (0.83±0.01), respectively, while the combined treatment group was (0.67±0.02)(P<0.05). Conclusion: The combination therapy of Ax and Cel reveals synergetic effect not only in the cell proliferation but also in angiogenesis inhibition.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.01.009

R735.2