腺苷A2A受體對(duì)新生小鼠離體延髓腦片基本節(jié)律性呼吸放電的調(diào)節(jié)作用*

閆思涵，劉友才，千智斌

1)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)室 河南新鄉(xiāng) 453003 2)新鄉(xiāng)市結(jié)核病防治所 河南新鄉(xiāng) 453000 3)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院 河南新鄉(xiāng) 453003

腺苷A2A受體對(duì)新生小鼠離體延髓腦片基本節(jié)律性呼吸放電的調(diào)節(jié)作用*

閆思涵1,2)，劉友才3)，千智斌1)#

1)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)室 河南新鄉(xiāng) 453003 2)新鄉(xiāng)市結(jié)核病防治所 河南新鄉(xiāng) 453000 3)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院 河南新鄉(xiāng) 453003

#通信作者，男，1974年7月生，博士，教授，研究方向：延髓呼吸中樞病變機(jī)制,E-mail：qianzhibin@126.com

腺苷A2A受體；新生小鼠；延髓腦片；基本節(jié)律性呼吸放電

目的：探討腺苷A2A受體對(duì)新生小鼠離體延髓腦片基本節(jié)律性呼吸放電(RRDA)的調(diào)節(jié)作用。方法：制備新生小鼠離體延髓腦片，分別使用含0.0、2.5、5.0、10.0、20.0 nmol/L腺苷A2A受體激動(dòng)劑CGS21680或拮抗劑SCH58261的人工腦脊液(ACSF)灌流腦片，每個(gè)濃度灌流10 min，在每個(gè)濃度灌流第6 min時(shí)，使用吸附電極記錄腦片RRDA，分析吸氣時(shí)程(TI)、放電積分幅度(IA)和呼吸周期(RC)。結(jié)果：CGS21680可以縮短RC，增加TI和IA(P<0.001),對(duì)RRDA有興奮作用。SCH58261則可以延長(zhǎng)RC，減小TI和IA(P<0.001),對(duì)RRDA有抑制作用。結(jié)論：腺苷A2A受體參與調(diào)節(jié)新生小鼠延髓RRDA，激活腺苷A2A受體對(duì)RRDA有興奮作用。

基本節(jié)律性呼吸放電(rhythmic respiratory discharge activity,RRDA)源自延髓呼吸中樞，是呼吸運(yùn)動(dòng)的前提和基礎(chǔ)，對(duì)機(jī)體的存活起著至關(guān)重要的作用[1]。大量研究[2-3]表明延髓面神經(jīng)后核內(nèi)側(cè)區(qū)(medial region of the nucleus fetrofacialis，mNRF)在RRDA的發(fā)生中起關(guān)鍵作用，可能是其產(chǎn)生部位。腺苷全稱腺嘌呤核苷酸，由腺嘌呤和戊糖結(jié)合而成，是一種內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)，通過與細(xì)胞膜上的腺苷受體結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞的突觸后功能。目前已發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物的腺苷受體有A1、A2A、A2B和A3等4種亞型[4]，均為G蛋白偶聯(lián)受體，廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)等，被激活后通過調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶、離子通道、磷脂酶等物質(zhì)活性產(chǎn)生生物效應(yīng)[5]。有研究[6]發(fā)現(xiàn)延髓頭端腹外側(cè)區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞膜上存在腺苷A2A受體。為明確腺苷A2A受體是否參與對(duì)新生小鼠延髓RRDA的調(diào)節(jié)，作者設(shè)計(jì)并完成了該實(shí)驗(yàn)，為新生動(dòng)物延髓呼吸中樞發(fā)育和相關(guān)疾病的預(yù)防、治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6小鼠購(gòu)自上海史萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,常規(guī)飼養(yǎng)，自然光照，選取2 d新生小鼠用于實(shí)驗(yàn)，雌雄不拘。

1.2 試劑 腺苷A2A受體特異性激動(dòng)劑CGS21680和特異性阻斷劑SCH58261購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。配制人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid,ACSF)所用試劑(NaCl 126 mmol/L,KCl 5 mmol/L,MgSO41.3 mmol/L,KH2PO41.2 mmol/L,CaCl22 mmol/L,NaHCO326 mmol/L,葡萄糖30 mmol/L)為國(guó)產(chǎn)分析純。體積分?jǐn)?shù)95%O2+體積分?jǐn)?shù)5%CO2混合氣體購(gòu)自河南源正科技公司。

1.3 離體延髓腦片標(biāo)本的制備和RRDA記錄 2 d新生小鼠使用乙醚深麻醉后在頸4和頸5之間斷頭，將鼠頭迅速置于0 ℃ACSF中清洗并降溫5～10 s后轉(zhuǎn)入解剖盒內(nèi)，盒內(nèi)盛有經(jīng)氮氧混合氣體充分飽和(平衡1 h以上)的冰ACSF，操作過程中持續(xù)通氣。使用眼科剪沿顱骨剪去正中皮膚和肌肉，從頸椎處剪開椎管并向吻端延伸，直至完整剪開顱骨，去除顱骨及腦橋以上的腦組織，用手術(shù)刀片分離顱底腦神經(jīng)至頸2、3段脊髓，游離出延髓、脊髓，完整保留舌下神經(jīng)根。迅速將標(biāo)本頭端向上移至切片槽內(nèi)，腹側(cè)面朝向刀刃，刀刃朝向頭端傾斜20°，在閂前600 μm至閂后100 μm間切下延髓腦片(含舌下神經(jīng)根)，將腦片置于灌流槽內(nèi)，用改良Kreb液以2～4 mL/min持續(xù)灌流，保持pH 7.35～7.45，溫度27～29 ℃。用含銀-氯化銀的吸附電極加以負(fù)壓吸附舌下神經(jīng)根，采用BL-420生物信號(hào)采集和處理系統(tǒng)進(jìn)行RRDA的記錄、分析和處理[7]。分別于灌流10、20、30、40和50 min后測(cè)量RRDA，根據(jù)各時(shí)間點(diǎn)RRDA數(shù)據(jù)有無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異判斷模型是否成立。穩(wěn)定記錄到RRDA后，分別使用含不同濃度(0.0、2.5、5.0、10.0、20.0 nmol/L)CGS21680或SCH58261的ACSF灌流腦片，每個(gè)濃度灌流10 min，在每個(gè)濃度灌流第6 min時(shí)測(cè)量RRDA。

1.4 測(cè)定指標(biāo) 每個(gè)RRDA放電開始至放電結(jié)束的時(shí)間為吸氣時(shí)程(inspiratory time, TI)，反映每次呼吸周期內(nèi)的吸氣持續(xù)時(shí)間；將一次放電的原始圖進(jìn)行積分獲得放電積分幅度(integral amplitude, IA)，反映呼吸的幅度；一次吸氣性放電開始至下一次放電開始的時(shí)間為呼吸周期(respiratory cycle，RC)，反映呼吸的快慢。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，ACSF灌流延髓腦片不同時(shí)間、同一試藥不同濃度作用條件下RRDA的比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 模型穩(wěn)定性 以灌流10 min后測(cè)得的數(shù)據(jù)為100，對(duì)其余數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。用ACSF灌流延髓腦片20、30、40、50 min后TI、IA、RC差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1、表1)，表明ACSF灌流延髓腦片50 min內(nèi)RRDA無衰減，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头€(wěn)定可靠。

圖1 ACSF灌流腦片不同時(shí)間的RRDA

t(灌流)/minTIIARC20101．46±2．37101．33±6．81102．15±3．603099．78±4．31101．26±4．57100．72±5．2440100．63±4．2799．83±6．77100．87±3．265098．76±5．4397．82±4．4199．31±6．03F0．5730．4060．741P0．7070．7990．583

2.2 不同濃度CGS21680對(duì)延髓腦片RRDA的影響 以0 nmol/L 的CGS21680灌流數(shù)據(jù)為100，對(duì)其余數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，結(jié)果見表2。表2顯示，CGS21680可以縮短RC，增加TI和IA,對(duì)RRDA有興奮作用；10 nmol/L的CGS21680對(duì)RRDA的作用達(dá)到最大效果，再提高CGS21680濃度，作用不再增強(qiáng),提示10 nmol/L的CGS21680是興奮RRDA的最適濃度。

表2 不同濃度CGS21680對(duì)RRDA的作用(n=6)

*：與2.5 nmol/L比較，P<0.05；#：與5.0 nmol/L比較，P<0.05。

2.3 不同濃度SCH58261對(duì)延髓腦片RRDA的影響 以0 nmol/L 的SCH58261灌流數(shù)據(jù)為100，對(duì)其余數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，結(jié)果見表3。表3顯示，SCH58261可以延長(zhǎng)RC，減小TI和IA,對(duì)RRDA有抑制作用；10 nmol/L的SCH58261對(duì)RRDA的作用達(dá)到最大效果，再提高SCH58261濃度，作用不再增強(qiáng),提示10 nmol/L的SCH58261是抑制RRDA的最適濃度。

表3 不同濃度SCH58261對(duì)RRDA的作用(n=6)

*：與2.5 nmol/L比較，P<0.05；#：與5.0 nmol/L比較，P<0.05。

3 討論

離體腦片在記憶、發(fā)育和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)功能研究等方面被廣泛應(yīng)用，與在體實(shí)驗(yàn)相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)：首先是可排除高位中樞和外周反饋性輸入對(duì)研究部位的干擾，從而提高研究的精確度[8]；其次離體腦片的機(jī)械穩(wěn)定性在記錄過程中顯著提高，可滿足細(xì)胞內(nèi)記錄、細(xì)胞外和膜片鉗等電生理方法的要求[9]；第三，可以通過在培養(yǎng)液或灌流液中加入遞質(zhì)、藥物、生長(zhǎng)因子等物質(zhì)精確控制細(xì)胞外液成分[10]。

該研究發(fā)現(xiàn)，腺苷A2A受體激動(dòng)劑CGS21680對(duì)離體小鼠延髓腦片的RRDA有興奮作用，腺苷A2A受體拮抗劑SCH58261則對(duì)RRDA有抑制作用。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，生理情況下mNRF神經(jīng)元細(xì)胞膜存在腺苷受體，腺苷和受體結(jié)合可緊張性調(diào)節(jié)呼吸神經(jīng)元電活動(dòng)。腺苷A2A受體是G蛋白偶聯(lián)受體[11]，受體被激活后，進(jìn)一步激活腺苷酸環(huán)化酶[12]，位于胞質(zhì)側(cè)的腺苷酸環(huán)化酶可部分催化細(xì)胞內(nèi)ATP生成環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)，cAMP作為第二信使通過激活蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)產(chǎn)生生物效應(yīng)[13-14]。腺苷A2A受體對(duì)RRDA的興奮作用可能與通過受體途徑抑制鉀通道、增加鈣內(nèi)流以及增加興奮性氨基酸有關(guān)[15-16]。

腺苷A2A受體在生理?xiàng)l件下緊張性調(diào)節(jié)延髓呼吸中樞功能，這有利于延髓呼吸中樞根據(jù)神經(jīng)元細(xì)胞外液的腺苷濃度調(diào)節(jié)呼吸運(yùn)動(dòng)的強(qiáng)度，以適應(yīng)機(jī)體的需氧量。病理情況下，如新生兒缺氧缺血性腦病[17]，腦組織缺氧使大量腺苷三磷酸水解，致使局部腦組織腺苷濃度明顯升高；一方面腺苷濃度升高會(huì)增加神經(jīng)元興奮性，造成缺氧缺血神經(jīng)元進(jìn)一步損傷；但另一方面缺氧缺血部位的腺苷擴(kuò)散可增加遠(yuǎn)處或其他血供正常部位腦組織的興奮性，代償缺血部位神經(jīng)組織的功能，例如非延髓部位缺血缺氧造成的腺苷升高可間接引起延髓呼吸中樞興奮，增加機(jī)體攝氧量[18-19]。

因此，作者認(rèn)為，mNRF區(qū)吸氣神經(jīng)元和RRDA相關(guān)神經(jīng)元細(xì)胞膜上腺苷A2A受體的異?？梢砸鸹竞粑?jié)律的異常[20]。研究腺苷A2A受體對(duì)延髓呼吸中樞RRDA的作用和藥物對(duì)腺苷A2A受體的作用機(jī)制對(duì)新生兒缺氧缺血性腦病等疾病的診治有重大價(jià)值。

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(2016-05-25收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Effects of adenosine A2A receptor on basic rhythmic respiration discharge activity of medulla oblongata slice from neonatal mice in vitro

YANSihan1,2),LIUYoucai3),QIANZhibin1)

1)DepartmentofFunctionalLaboratory,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang,Henan453003 2)XinxiangTuberculosisPreventionandTreatmentInstitute,Xinxiang,Henan453000 3)SanquanCollege,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang,Henan453003

adenosine A2A receptor;neonatal mouse;medulla oblongata slice;basic rhythmic respiratory discharge activity

Aim: To investigate the effect of adenosine A2A receptor on basic rhythmic respiratory discharge activity(RRDA) of medulla oblongata slice from neonatal mice.Methods: Medulla oblongata slices in vitro from neonatal mice were prepared, and then perfused with artificial cerebrospinal fluid(ACSF) which containing 0.0, 2.5, 5.0, 10.0, 20.0 nmol/L adenosine A2A receptor agonist CGS21680 or antagonist SCH58261 for 10 min. At the 6th min of perfusion, adsorption electrode was used to record the inhale duration(TI), discharge integral amplitude (IA) and respiratory cycle (RC). Results: CGS21680 could shorten RC, increase TI and IA(P<0.001), excite RRDA; SCH58261 could extend RC, reduce TI and IA(P<0.001),and has inhibitory effect on RRDA. Conclusion: The adenosine A2A receptor may play an excitatory role in RRDA of medulla oblongata in neonatal mice.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.01.007

*河南省科技廳重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目 102102310156;新鄉(xiāng)市科技局重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目 ZG14004

R332.3