脂肪營養(yǎng)對(duì)封閉循環(huán)水養(yǎng)殖道氏虹鱒生長(zhǎng)、相關(guān)代謝酶及基因表達(dá)的影響

張 靜, 李 勇, 孫國祥, 趙寧寧, 馬 駿, 王順奎

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脂肪營養(yǎng)對(duì)封閉循環(huán)水養(yǎng)殖道氏虹鱒生長(zhǎng)、相關(guān)代謝酶及基因表達(dá)的影響

張 靜1, 2, 3, 李 勇1, 2, 3, 孫國祥1, 2, 3, 趙寧寧1, 2, 3, 馬 駿1, 2, 3, 王順奎4

(1. 中國科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 3. 中國科學(xué)院實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 4. 山東東方海洋科技股份有限公司, 山東 煙臺(tái) 264003)

為探討飼料脂肪營養(yǎng)對(duì)封閉循環(huán)水養(yǎng)殖道氏虹鱒()生長(zhǎng)、脂肪代謝及相關(guān)酶基因表達(dá)的影響, 作者采用單因素設(shè)計(jì), 即4個(gè)脂肪水平——12%、15%、18%、21%(以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組表示), 共4個(gè)處理組, 每處理3重復(fù), 每重復(fù)25尾魚。試驗(yàn)魚為初始體質(zhì)量(333.25±20.71)g的道氏虹鱒幼魚, 試驗(yàn)期77 d。結(jié)果表明, 與后3組相比, Ⅰ組試驗(yàn)魚增質(zhì)量率顯著提高17.20%~33.17%, Ⅰ和Ⅱ組飼料系數(shù)顯著低于Ⅲ和Ⅳ組6.20%~20.56%(<0.05); 脂肪合成酶類FAS活力隨飼料脂肪水平升高而降低, 脂肪分解酶類LPL、HL及L-CPT Ⅰ活力變化特征與之相反(<0.05)。其中, Ⅰ組FAS活力顯著高于Ⅲ、Ⅳ組7.5%、8.7%; L-CPT Ⅰ活力顯著低于后3組13.08%~16.35%; Ⅳ組LPL活力顯著或極顯著高于前3組18.8%~44.7%(<0.05或<0.01); I組肝臟的mRNA表達(dá)量比后3組顯著高48.29%~55.15%(<0.05);呈相反特征, Ⅳ組顯著高于前3組36.72%~113.59%(<0.05或<0.01); Ⅰ組肌肉mRNA表達(dá)量顯著高于Ⅳ組66.82%(<0.05);表達(dá)豐度隨脂肪水平升高先下降后顯著上升(<0.05)。該結(jié)果特征與肝臟中該兩種酶活力變化具有同步性。研究發(fā)現(xiàn), 隨飼料脂肪水平變化, 肌肉mRNA表達(dá)量變化比肝臟更明顯且規(guī)律性更強(qiáng), 而肝臟mRNA表達(dá)量變化較肌肉更明顯。本試驗(yàn)初步確定, 在封閉循環(huán)水養(yǎng)殖模式下, 330 g左右道氏虹鱒飼料蛋白水平在45%時(shí), 脂肪水平以不超過12%為宜。

脂肪; 道氏虹鱒(); 生長(zhǎng); 脂肪代謝; 基因表達(dá); 封閉循環(huán)水養(yǎng)殖

脂肪是魚類維持生長(zhǎng)、發(fā)育和正常生理機(jī)能所必需的營養(yǎng)物質(zhì)。大量研究證實(shí), 適宜脂肪水平會(huì)提高飼料蛋白利用率, 節(jié)約蛋白質(zhì)。但飼料脂肪含量過高, 會(huì)造成脂肪代謝紊亂, 進(jìn)而導(dǎo)致營養(yǎng)性脂肪肝[1]、內(nèi)臟團(tuán)脂肪過量沉積[2]等, 抑制生長(zhǎng)。因此, 有關(guān)脂肪營養(yǎng)對(duì)魚類生長(zhǎng)、脂肪代謝及相關(guān)基因表達(dá)的效應(yīng), 值得深入研究。

道氏虹鱒()隸屬鮭形目(Salmoniformes)鮭科(Salmonidae)大麻哈魚屬(), 屬降海型虹鱒。目前該魚工業(yè)化養(yǎng)殖中, 存在內(nèi)臟團(tuán)脂肪過量沉積、畸形率高等問題, 嚴(yán)重影響正常生長(zhǎng), 具體原因尚未探明。關(guān)于飼料脂肪水平對(duì)虹鱒生長(zhǎng)、肝臟脂肪代謝影響的研究不全面且結(jié)果存在分歧[3-4, 5-7]。查閱文獻(xiàn)可知, 虹鱒魚脂肪需要量為8%~25%[8-9], 但其封閉循環(huán)水養(yǎng)殖中飼料脂肪需求的變化特點(diǎn)研究未見報(bào)道。

本試驗(yàn)研究在封閉循環(huán)水養(yǎng)殖模式下, 通過設(shè)計(jì)不同飼料脂肪水平, 探尋脂肪營養(yǎng)對(duì)道氏虹鱒生長(zhǎng)、脂肪代謝及相關(guān)基因表達(dá)的效應(yīng), 為初步查明其脂肪代謝機(jī)制和健康養(yǎng)殖的營養(yǎng)調(diào)控提供科學(xué)依據(jù)和應(yīng)用參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)、飼料配制、飼養(yǎng)管理

目前國內(nèi)外研究表明, 虹鱒脂肪需求介于8%~ 25%, 而實(shí)際生產(chǎn)中采食22%脂肪水平飼料的海水虹鱒, 出現(xiàn)了脂肪沉積過量等現(xiàn)象, 本試驗(yàn)結(jié)合前人研究以及生產(chǎn)實(shí)際, 采用單因素設(shè)計(jì), 將優(yōu)質(zhì)魚油作為單一脂肪源變量, 設(shè)置4個(gè)飼料脂肪水平(12%、15%、18%、21%), 分別以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組表示, 每處理組3重復(fù)。試驗(yàn)飼料為直徑5 mm的膨化飼料, 由北京漢業(yè)科技有限公司專門加工, 試驗(yàn)飼料配方見表1。試驗(yàn)魚由山東東方海洋科技股份有限公司提供, 來自同一批次、同一養(yǎng)殖池。

表1 試驗(yàn)飼料原料組成及營養(yǎng)水平(%干物質(zhì))

注: 表中數(shù)值除粗纖維外均為實(shí)測(cè)值; 1). 復(fù)合維生素為每千克飼料提供: VA 7 500 IU, VC 100 mg, VD32 000 IU, VK35 mg, VB17.5 mg, VB215 mg, VB67.5 mg, VB120.02 mg, VE 50 mg, 煙酸 6 mg, 泛酸鈣 20 mg, 葉酸 1 mg, 生物素 0.12 mg, 肌醇 500 mg; 2). 復(fù)合礦物元素 (mg/kg飼料): Cu 3; Zn 72; Mn 13; Fe 50; I 0.15; Co 0.5; Mg 600; Se 0.23; P 6000; 3). 實(shí)測(cè)值

試驗(yàn)開始前禁食24 h, 挑選大小均勻(333.25± 20.71)g、健康、活力好的道氏虹鱒成魚, 隨機(jī)分配于12個(gè)直徑0.95 m、高0.65 m的養(yǎng)殖桶內(nèi), 每桶25尾。試驗(yàn)在室內(nèi)封閉循環(huán)水系統(tǒng)中進(jìn)行, 日換水量約占總水量的10%, 每天36個(gè)循環(huán), 馴養(yǎng)21 d, 正式試驗(yàn)77 d, 試驗(yàn)水溫14℃±0.5℃, 溶氧(10±0.5)mg/L, 鹽度30±0.5, 24 h光照。每天投喂4次(8: 00, 12: 00, 16: 00, 20: 00)至飽食, 每次投喂0.5 h后, 將殘餌排出、收集、計(jì)質(zhì)量, 從投喂量中扣除作為實(shí)際采食量。發(fā)現(xiàn)死魚及時(shí)撈出稱質(zhì)量, 記錄。

1.2 樣品采集和指標(biāo)測(cè)定方法

試驗(yàn)結(jié)束時(shí), 禁食24 h, 翌日稱體質(zhì)量。用MS-222快速深度麻醉, 冰盤中解剖剝離肝胰臟和背肌, 取同一部位肝胰臟迅速分裝入封口袋, –20℃保存待測(cè), 另取適量肝胰臟和背肌剪碎放入凍存管, 迅速放入液氮罐, 取樣完畢后保存于–80℃冰箱用于分子指標(biāo)測(cè)定。飼料樣品用四分法縮減至200 g, 分裝入封口袋, 進(jìn)行后續(xù)營養(yǎng)成分分析。

1.2.1 飼料營養(yǎng)成分測(cè)定

干物質(zhì)采用失重法, 即105℃烘箱烘干至恒質(zhì)量; 粗蛋白采用凱氏定氮法; 粗脂肪采用索氏抽提法; 粗灰分采用焚燒法; 鈣采用高錳酸鉀法; 總磷采用鉬黃比色法。

1.2.2 生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)計(jì)

存活率(%)=100×(終末存活魚數(shù)/初始魚數(shù))

增質(zhì)量率(%)=100×[(終末體質(zhì)量–初始體質(zhì)量)/初始體質(zhì)量]

特定生長(zhǎng)率(%/d)=100×[(ln(終末體質(zhì)量)–ln(初始體質(zhì)量))/試驗(yàn)天數(shù)]

攝食量(g/尾)=(總投喂量–總殘餌量)/尾數(shù)

飼料系數(shù)=(總投喂量–總殘餌量)/(終末體質(zhì)量–初始體質(zhì)量)

1.2.3 脂肪代謝指標(biāo)測(cè)定方法

使用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的Elisa試劑盒, 測(cè)定試驗(yàn)魚肝胰臟中脂肪酸合成酶(FAS)、肝型脂肪酸結(jié)合蛋白(L-FABP)、肝型肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶Ⅰ(L-CPTⅠ)、脂蛋白脂酶(LPL)、肝酯酶(HL)和總酯酶(TL)的活力。測(cè)定前進(jìn)行樣品預(yù)處理, 準(zhǔn)確稱取組織質(zhì)量, 按質(zhì)量體積比加入9倍的生理鹽水制成10%的組織勻漿, 2 500 r/min, 離心10 min, 后通過預(yù)試驗(yàn)確定最終稀釋倍數(shù), 進(jìn)行指標(biāo)正式測(cè)定。

1.2.4 脂肪代謝關(guān)鍵酶mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)方法

1.2.4.1 總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄

取0.1 g肝胰臟和肌肉組織樣品, 按照飛捷生物技術(shù)有限公司提供的RNAfast200試劑盒提取總RNA(總體系20 μL), 然后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性(3條帶, 分別是5sRNA、18sRNA、28sRNA), 并分別測(cè)定樣品在260 nm和280 nm波長(zhǎng)的吸光度值, 計(jì)算RNA樣品的濃度和純度。根據(jù)RNA濃度, 取2mg RNA按照PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) (TaKaRa)說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄, –80℃保存。

1.2.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

以道氏虹鱒(NM_001124235.1)作為內(nèi)參基因, 使用ABI 7500 Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀以及7500 software v2.0.1(Applied Biosystems, 美國)測(cè)定肝胰臟和肌肉中、相對(duì)表達(dá)量。特異性引物序列見表2。首先通過溶解曲線和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)引物特異性, 并利用濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線確定合適的模板稀釋倍數(shù)(4×)。然后進(jìn)行樣品測(cè)定, 每試驗(yàn)組9個(gè)樣品(3×3), 每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)量3次, 以不加模板的PCR反應(yīng)樣品作為陰性對(duì)照。反應(yīng)體系為20mL: 2mL模板cDNA、0.4mL特異性引物(上下游引物, 10mmol/L)、0.4mLROX、6.8mL無菌水、10mL SYBR? Premix Ex Taq? II (Tli RNaseH Plus)(TaKaRa)。反應(yīng)條件為:(95℃ 30 s; 95℃10 s, 61℃ 30 s, 40個(gè)循環(huán)),(95℃ 30 s; 95℃ 10 s, 56℃ 30 s, 40個(gè)循環(huán))。最后, 以試驗(yàn)初始樣品為對(duì)照組, 使用2–DDCt方法計(jì)算和的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行生物統(tǒng)計(jì)分析, 采用單因素方差分析和Duncan檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較。結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SE)”表示。

表2 本試驗(yàn)的引物設(shè)計(jì)

2 結(jié)果

2.1 生長(zhǎng)性能

由表3可見, 終末體質(zhì)量(FBW)、增質(zhì)量率(WGR)和特定生長(zhǎng)率(SGR)均隨脂肪水平升高整體呈下降趨勢(shì)。其中, Ⅰ組FBW、WGR分別顯著高于后3組6.81%~7.83%、17.20%~33.17%(<0.05); SGR顯著高于Ⅲ、Ⅳ組28.91%、29.54%(<0.05), 與Ⅱ組差異不顯著(>0.05)。

攝食量隨脂肪水平升高先下降后上升, Ⅰ組顯著高于Ⅱ、Ⅲ組19.40%、14.62%(<0.05), 與Ⅳ組無顯著差異(>0.05)。飼料系數(shù)隨脂肪水平升高先上升后下降。Ⅰ、Ⅱ組顯著低于Ⅲ、Ⅳ組6.20%~20.56% (<0.05)。

各組存活率無顯著性差異, 均在93%以上(> 0.05)。

表3 飼料不同脂肪水平對(duì)道氏虹鱒生長(zhǎng)性能的影響

注: 表中同一行上標(biāo)無字母、或相同字母表示差異不顯著(>0.05), 相鄰字母表示差異顯著(<0.05), 相隔字母表示差異極顯著(< 0.01), 表3、表4同

2.2 脂肪代謝指標(biāo)

由表4可知, 脂肪酸合成代謝中, FAS活力隨飼料脂肪水平增加而下降, Ⅰ組顯著高于Ⅲ、Ⅳ組7.5%、8.7%(<0.05); Ⅱ組L-FABP活力顯著高于其他3組9.1%~13.1%(<0.05)。

脂肪分解相關(guān)酶中, LPL活力隨脂肪水平升高先下降后上升。Ⅳ組顯著高于Ⅰ、Ⅲ組36.3%、18.8% (<0.05), 極顯著高于Ⅱ組44.7%(<0.01)。HL活力隨脂肪水平升高而升高。Ⅲ、Ⅳ組顯著高于Ⅰ、Ⅱ組(<0.05)。TL與HL有相同變化特征。

表4 飼料脂肪水平對(duì)肝臟脂肪代謝指標(biāo)的影響

β-氧化相關(guān)代謝酶L-CPTⅠ活力隨脂肪水平升高先上升后趨穩(wěn), 后3組顯著高于Ⅰ組15.1%~19.5% (<0.05)。

2.3 脂肪代謝基因mRNA水平

由表5和圖1可知, 在肝臟中,表達(dá)量隨脂肪水平升高先下降后趨穩(wěn),表達(dá)量逐漸上升。其中, Ⅰ組顯著高于其他3組48.29%~55.15% (< 0.05); Ⅳ組顯著或極顯著高于前3組36.72%~ 113.59%(<0.05或<0.01)。

在肌肉中,表達(dá)量變化較為緩慢, Ⅰ組顯著高于Ⅳ組66.82%(<0.05)。表達(dá)量先下降后上升, Ⅱ組最低, Ⅲ、Ⅳ組顯著高于Ⅱ組86.03%、72.66%(<0.05)。

表5 脂肪營養(yǎng)對(duì)道氏虹鱒脂肪代謝基因mRNA表達(dá)量的影響

圖1 脂肪營養(yǎng)對(duì)肝臟和肌肉脂肪代謝基因表達(dá)的影響

數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(<0.05)

Column values with different small letters indicate significant difference (< 0.05)

3 討論

3.1 脂肪營養(yǎng)對(duì)生長(zhǎng)性能的影響

在本試驗(yàn)條件下, 飼料12%脂肪水平組的增質(zhì)量率顯著高于其他3組, 飼料系數(shù)對(duì)應(yīng)顯著最低, 說明該脂肪水平組飼料適合工業(yè)化養(yǎng)殖條件下試驗(yàn)魚的生長(zhǎng)和飼料利用, 即虹鱒成魚無需過高脂肪水平即可滿足其生長(zhǎng)需求。分析原因, 一方面從能量利用角度看, 本試驗(yàn)中、高脂肪水平飼料所提供的有效能, 可能超過了試驗(yàn)魚的生長(zhǎng)需求, 并不能為生長(zhǎng)增益, 反而會(huì)增加代謝負(fù)擔(dān)、阻滯生長(zhǎng)和飼料利用; 另一方面, 與流水和網(wǎng)箱養(yǎng)殖相比, 工業(yè)化循環(huán)水養(yǎng)殖流速、水溫穩(wěn)定, 活動(dòng)范圍和游泳阻力較小, 從而減少了維持所需能量, 較低脂肪水平即可滿足試驗(yàn)魚生長(zhǎng)需求。楊清華等[8]曾報(bào)道, 淡水養(yǎng)殖虹鱒成魚脂肪需要量為8.0%~10.6%; Bureau等[3]的試驗(yàn)表明, 在蛋白水平為47%時(shí), 10%、16%、18%脂肪水平組虹鱒魚的生長(zhǎng)無顯著差異, 且10%水平組飼料利用率顯著高于其他兩組; 飼料脂肪水平超過魚類需求會(huì)顯著降低飼料利用率[11-12]。上述研究與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致。但也有學(xué)者發(fā)現(xiàn), 流水養(yǎng)殖虹鱒脂肪需求量約為15%~25%[13-15], 這可能是由養(yǎng)殖模式不同造成的。本試驗(yàn)結(jié)果與前人研究中較低脂肪水平結(jié)果相一致, 說明在工業(yè)化循環(huán)水養(yǎng)殖模式和飼料蛋白質(zhì)含量45%的前提下, 道氏虹鱒并不需要過高脂肪營養(yǎng)即可滿足生長(zhǎng)需求, 其飼料脂肪水平以不超過12%為宜。

同時(shí), 合適蛋脂比既能為魚類提供適宜能量, 又能最大程度地利用蛋白質(zhì)。蛋脂比過低, 蛋白質(zhì)不能滿足魚類的生長(zhǎng)需求或脂肪過量導(dǎo)致脂肪代謝異常, 生長(zhǎng)受抑制[16]。本試驗(yàn)中, 12%脂肪水平組蛋脂比為3.76, 試驗(yàn)魚生長(zhǎng)性能最佳, 說明該蛋脂比適宜, 這與前人得出的虹鱒魚適宜蛋脂比3.8相近[17]。

3.2 脂肪營養(yǎng)對(duì)肝臟脂肪代謝的影響

本試驗(yàn)中, 試驗(yàn)魚肝臟FAS活力隨脂肪水平升高而降低, 12%脂肪水平組顯著高于18%和21%組。說明飼料脂肪營養(yǎng)增加對(duì)道氏虹鱒FAS活力有抑制作用, 這與前人在虹鱒、吉富羅非魚()以及白甲魚()上的研究結(jié)果[2, 18-19]相一致。剖析原因, FAS是內(nèi)源性脂肪酸合成的關(guān)鍵酶, 能夠催化丙二酰輔酶A、乙酰輔酶A和還原型輔酶Ⅱ體內(nèi)合成長(zhǎng)鏈飽和軟脂酸鹽[18], 促進(jìn)脂肪生成。低脂肪組試驗(yàn)魚FAS活力最高, 有利于增加脂肪及脂肪酸合成滿足機(jī)體需要, 使飼料脂肪營養(yǎng)充分利用, 超過中、高脂肪組的利用效率; 而中、高脂肪組外源性脂肪的供給充足或過量, 因而通過降低試驗(yàn)魚FAS活力來減少內(nèi)源性脂肪的合成, 以維持機(jī)體脂肪代謝的平衡。

肝臟LPL、HL和TL的活力測(cè)析表明, 三者活力隨飼料脂肪水平升高而增加, 18%和21%脂肪水平組顯著或極顯著高于12%和15%組。這與前人研究所得高脂飼料能提高魚類肝臟中兩種酶活力[20-22]的結(jié)果基本一致。這可能是由于飼料脂肪水平升高, 肝臟中需代謝的甘油三酯(TG)和游離脂肪酸(FFA)增加, 肝臟一方面通過提高LPL和HL活力, 降解乳糜微粒與極低密度脂蛋白中的TG為FFA, 通過血液轉(zhuǎn)運(yùn)至其他組織, 促進(jìn)脂質(zhì)合成或氧化供能; 另一方面利用HL加速攝取高密度脂蛋白中的CHO, 促進(jìn)肝臟對(duì)TG、FFA以及CHO的代謝[23-25]。

本試驗(yàn)L-CPT Ⅰ活力隨脂肪水平升高先顯著上升后趨于平穩(wěn), 拐點(diǎn)出現(xiàn)在15%脂肪組。這說明飼料脂肪水平在一定范圍內(nèi)升高可提高該酶活力, 脂肪水平過高無益于其活力增加。這一變化特征與Li等[26]所發(fā)現(xiàn)的飼料脂肪水平對(duì)草魚()L-CPT Ⅰ基因表達(dá)影響的特征相似, 即脂肪營養(yǎng)對(duì)該酶基因表達(dá)和活力的調(diào)控可能具有同步性。分析原因, 飼料低脂肪水平時(shí), 細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)鏈酯酰輔酶A(LCACoAs)含量較低, 此時(shí)丙二酰輔酶A(MCoA)抑制L-CPT1活力[27]; 隨脂肪水平增加, LCACoAs含量增加, 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合L-CPT Ⅰ, 減弱了MCoA的抑制作用, 故L-CPT Ⅰ活力升高, 促進(jìn)脂肪酸β氧化; 脂肪水平繼續(xù)增加, 細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)效率下降(由下文L-FABP活力測(cè)析結(jié)果可知), 降低LCACoAs對(duì)MCoA的競(jìng)爭(zhēng)性相互作用, 故L-CPT Ⅰ活力不再升高。

除脂肪及脂肪酸的合成、分解代謝外, 脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)在脂肪代謝中發(fā)揮重要作用。本試驗(yàn)結(jié)果顯示, 15%脂肪水平組L-FABP活力顯著最高, 其余3組無顯著差異。說明飼料脂肪水平為15%時(shí), 肝臟脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)效率最高, 高于或低于此脂肪水平轉(zhuǎn)運(yùn)效率下降。這可能是由于L-FABP參與細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)鏈脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)及TG合成[28], 故在中低脂肪時(shí), 與FAS協(xié)同促進(jìn)脂質(zhì)形成, 提高飼料脂肪利用率。

可見, 飼料脂肪水平顯著影響肝臟脂肪合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解酶活力。試驗(yàn)魚通過脂肪對(duì)五種酶活力的調(diào)控, 促進(jìn)脂肪代謝, 滿足機(jī)體需要。本試驗(yàn)12%脂肪組試驗(yàn)魚通過增加肝臟脂肪合成(提高FAS活力)和減少分解(降低LPL、HL、L-CPT Ⅰ活力)的自我調(diào)控方式, 提高了飼料脂肪利用率, 從而不僅保證魚體脂肪正常需要, 而且促進(jìn)生長(zhǎng), 從脂肪代謝層面解釋了低脂肪組試驗(yàn)魚生長(zhǎng)性能顯著優(yōu)于其他3組的機(jī)制所在。

3.3 脂肪營養(yǎng)對(duì)肝臟和肌肉相關(guān)代謝酶基因表達(dá)的影響

作為脂肪代謝的兩個(gè)關(guān)鍵酶,和mRNA在魚類表達(dá)量方面的研究, 目前主要集中于對(duì)其表達(dá)影響因素(生理階段、激素、營養(yǎng)、環(huán)境條件等)的探尋上[5, 29]。其中, 飼料脂肪水平作為一種營養(yǎng)調(diào)控因子, 對(duì)兩種酶基因表達(dá)有一定影響[20, 30-31], 目前尚未見有關(guān)于脂肪水平對(duì)道氏虹鱒肝臟和肌肉兩種酶mRNA表達(dá)量影響的研究。

本試驗(yàn)肝臟mRNA表達(dá)量在低脂肪組最高, 顯著高于其他3組, 而高脂肪組表達(dá)量顯著或極顯著高于前3組。該結(jié)果特征與其代謝酶活力變化具有同步性。與飼料脂肪水平對(duì)吉富羅非魚[18]肝臟、團(tuán)頭魴()[32]和瓦氏黃顙魚()[23]基因表達(dá)的研究結(jié)果基本一致。究其原因, 一方面, 飼料脂肪水平升高導(dǎo)致的不飽和脂肪酸含量增加會(huì)抑制的表達(dá); 另一方面在肝臟中存在營養(yǎng)誘導(dǎo)性表達(dá), 高脂是其表達(dá)的誘導(dǎo)因子之一[33]。通過對(duì)兩種酶基因表達(dá)豐度的調(diào)控, 協(xié)調(diào)脂肪的分解與合成, 充分利用飼料脂肪營養(yǎng)。在低脂肪組, 試驗(yàn)魚通過促進(jìn)轉(zhuǎn)錄、降低表達(dá)水平協(xié)調(diào)脂肪代謝, 滿足機(jī)體的脂肪酸需求, 從轉(zhuǎn)錄水平上解釋了低脂肪組活力顯著最高、活力顯著最低, 從而導(dǎo)致該組增質(zhì)量率和飼料系數(shù)最優(yōu)的試驗(yàn)結(jié)果。由于高脂肪飼料提供了足夠脂肪, 故試驗(yàn)魚維持低表達(dá)即可滿足需求; 而表達(dá)豐度提高有助于清除多余的TG, 避免脂肪肝。

肌肉是脂肪沉積的主要部位之一, 脂肪沉積多寡對(duì)肉質(zhì)品質(zhì)影響顯著。本試驗(yàn)中, 12%脂肪組肌肉mRNA表達(dá)量顯著高于21%組, 后兩組顯著高于15%脂肪組。這一結(jié)果說明飼料低脂肪水平時(shí), 魚體主要通過提高表達(dá)水平合成較多脂肪酸, 儲(chǔ)存于肌肉, 可能有利于試驗(yàn)魚的肉質(zhì)改善; 而表達(dá)豐度的提高有利于為肌肉組織供能。本試驗(yàn)低脂肪組主要通過表達(dá)量的增加促進(jìn)肌肉脂肪沉積, 可能有利于改善肉質(zhì)品質(zhì)。

由圖1可知, 肝臟和肌肉中兩種酶基因mRNA表達(dá)量隨飼料脂肪水平變化的特征不同。具體表現(xiàn)為, 肌肉mRNA表達(dá)量隨脂肪水平變化比肝臟更明顯且規(guī)律性更強(qiáng), 而肝臟mRNA表達(dá)量變化較肌肉顯著。從根本上來說, 是肝臟與肌肉兩組織對(duì)飼料脂肪營養(yǎng)干預(yù)的分子生物學(xué)應(yīng)答程度不同。分析原因在于虹鱒作為主要三文魚之一, 其肌肉脂肪沉積至關(guān)重要, 故基因表達(dá)對(duì)飼料脂肪水平變化反應(yīng)較肝臟更為敏感而強(qiáng)勁,基因表達(dá)相對(duì)弱化; 而肝臟仍處于正常表達(dá)狀態(tài)。此可謂三文魚肌肉脂肪分子營養(yǎng)調(diào)控的特征或機(jī)理顯現(xiàn)。

4 小結(jié)

本研究從脂肪生理代謝及其分子營養(yǎng)層面初步揭示了12%脂肪組生長(zhǎng)性能顯著高的可能機(jī)制所在, 即飼料脂肪水平實(shí)則作用于機(jī)體脂肪代謝酶基因的表達(dá), 然后調(diào)控其代謝酶活力變化, 進(jìn)而影響脂肪生理代謝效應(yīng), 最終表現(xiàn)為生長(zhǎng)性能的優(yōu)劣。本研究初步確定, 在封閉循環(huán)水養(yǎng)殖模式下, 330 g左右道氏虹鱒無需過高脂肪供給即可實(shí)現(xiàn)健康生長(zhǎng), 在飼料蛋白質(zhì)水平為45%時(shí), 其飼料脂肪水平以不超過12%為宜。

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(本文編輯: 譚雪靜)

Effects of lipid levels on growth, fatty acid enzymatic activity, and gene expression of rainbow trout () in a recirculating aquaculture system

ZHANG Jing1, 2, 3, LI Yong1, 2, 3, SUN Guo-xiang1, 2, 3, ZHAO Ning-ning1, 2, 3, MA Jun1, 2, 3, WANG Shun-kui4

(1. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 4. Shandong Oriental Ocean Sci-Tech Co., Ltd, Yantai 264003, China)

The aim of this trial was to evaluate the effects of dietary lipid levels on growth performance, fat metabolism, and gene mRNA expression of rainbow trout () in a recirculating aquaculture system (RAS). Four isonitrogenous diets containing 45% crude protein with increasing dietary lipid levels of 12%, 15%, 18%, and 21% (denoted as groups Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, and Ⅳ) were fed to satiety to triplicate groups of 25 fishes (weighing 333.25 ± 20.71 g) for 77 days. Results are described as follows: First, the growth performance of fish fed group Ⅰ diet was optimal due to the highest weight gain (77.41%) and the lowest feed conversion rate (1.16) (< 0.05 or< 0.01); Second, fatty acid synthetase (FAS) activity was decreased with increasing dietary fat content, whereas the activities of lipolytic enzymes were increased. The FAS activity of fish fed group Ⅰ diet was significantly higher than those fed groups Ⅲ and Ⅳ diets by 7.5% and 8.7%, respectively. The L-CPT I activity of fish fed group Ⅰ diet was lower than that of fish fed other diet groups by 13.08%–16.35% (< 0.05). Meanwhile, the LPL activity of fish fed group Ⅳ diet was significantly highest (< 0.05). This result implies that fishes fed group Ⅰ diet improved their fat utilization rate by increasing fat synthesis and decreasing lipolysis to ensure the body’s normal requirement for lipids and promote growth; Third, FAS mRNA expression in fish fed group Ⅰ diet was higher than that of fish fed other diet groups by 48.29%–55.15% (< 0.05), whereas the changes in LPL showed an opposite pattern (< 0.05 or< 0.01). In the muscle, the FAS mRNA expression in fish fed group Ⅰ diet was higher than that of fish fed group Ⅳ diet by 66.82% (< 0.05), and the expression of LPL was initially decreased and then increased with increasing dietary lipid levels. The preliminary finding was that FAS and LPL gene expression in the liver changed faster than that in the muscle with the increase in fat levels. Determined primarily, the Donaldsons rainbow trout (weighing about 330 g) could achieve healthy growth without excessive fat supply, and its fat nutrition requirement is no more than 12% in RAS when the dietary protein level is 45%.

lipid;; growth; fat metabolism; gene expression; recirculating aquaculture system

Mar. 3, 2017

S963.7

A

1000-3096(2017)10-0024-09

10.11759//hykx20170303003

2017-03-03;

2017-03-22

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAD13B07); 中國科學(xué)院院地合作項(xiàng)目(Y12530101L)

[National “Twelfth Five-Year” Plan for Science & Technology Support, No.2011BAD13B07; Cooperation Projects of Chinese Academy of Sciences and Local Government, No.Y12530101L]

張靜(1990-), 女, 山東泰安人, 碩士研究生, 主要從事水產(chǎn)動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)研究, 電話: 15550283365, E-mail: 15550283365@ 163.com; 李勇, 通信作者, 研究員, E-mail: liyong@qdio.ac.cn