鐵皮石斛可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶基因克隆與表達(dá)分析

孟衡玲， 張 薇， 盧丙越， 蘇一蘭， 薛春麗

(云南省高校農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)高效栽培與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/紅河學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 蒙自 661100)

鐵皮石斛可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶基因克隆與表達(dá)分析

孟衡玲， 張 薇， 盧丙越， 蘇一蘭， 薛春麗

(云南省高校農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)高效栽培與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/紅河學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 蒙自 661100)

【目的】克隆鐵皮石斛Dendrobiumofficinale可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶基因SAI，分析該基因生物學(xué)信息及時(shí)空表達(dá)特異性?！痉椒ā炕谕葱蛄锌寺¤F皮石斛SAI基因cDNA全長(zhǎng)，采用生物信息學(xué)方法進(jìn)行序列分析，并采用qRT-PCR進(jìn)行組織特異性表達(dá)分析?！窘Y(jié)果】鐵皮石斛SAI基因全長(zhǎng)為1 595 bp，cDNA編碼區(qū)1 368 bp，Genbank登錄號(hào)為KU598852。該基因編碼455個(gè)氨基酸，蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為50 700。NCBI BLASTx分析表明，該基因氨基酸序列與柑橘Citrusunshiu酸性轉(zhuǎn)化酶基因、甜橙C.sinensis酸性β-呋喃果糖苷酶基因序列相似性最高，達(dá)77%，與其他植物酸性轉(zhuǎn)化酶基因的相似性均高于68%。聚類分析表明，鐵皮石斛SAI基因與玉米Zeamays液泡轉(zhuǎn)化酶基因、甘蔗SaccharumofficinarumSAI基因親緣關(guān)系最近。該基因編碼的蛋白質(zhì)屬于非跨膜結(jié)構(gòu)的親水性熱穩(wěn)定蛋白，定位于液泡中。SAI基因在2年生鐵皮石斛的莖中表達(dá)量最高，3年生的葉中表達(dá)量最低?！窘Y(jié)論】成功克隆鐵皮石斛液泡酸性轉(zhuǎn)化酶基因，該基因在鐵皮石斛不同組織不同生育時(shí)期的表達(dá)量差異較大。

鐵皮石斛； 酸性轉(zhuǎn)化酶； 基因克??； 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

鐵皮石斛Dendrobiumofficinale為中國(guó)九大仙草之一，具有抗腫瘤、抗衰老、增強(qiáng)人體免疫力的作用[1]。其主要活性成分為石斛多糖，其水解為單糖后，葡萄糖所占的比例最高[2]。轉(zhuǎn)化酶(Invertase, IVR, E.C.3.2.1.26)又稱為蔗糖酶或β-D-呋喃果糖苷酶，在植物體中催化蔗糖降解為果糖和葡萄糖，是蔗糖代謝的關(guān)鍵酶之一，包括酸性轉(zhuǎn)化酶(Acid invertase，AI)和中性轉(zhuǎn)化酶(Neutral invertase，NI)，高活性的AI與植物幼嫩組織的快速生長(zhǎng)、貯藏器官的迅速膨大有關(guān)[3-4],且與蔗糖積累呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系[5]。前期研究表明，鐵皮石斛酸性轉(zhuǎn)化酶的活性與蔗糖積累呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，但與還原糖及可溶性多糖呈顯著正相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明酸性轉(zhuǎn)化酶對(duì)多糖的積累有重要的貢獻(xiàn)作用，可能是由于AI催化蔗糖降解形成葡萄糖和果糖，為多糖的合成提供碳源[6]。Wei等[7]也認(rèn)為霍山石斛D.huoshanense多糖含量與細(xì)胞內(nèi)還原糖的濃度有關(guān)；王博[8]認(rèn)為霍山石斛類原球莖中還原糖和可溶性多糖含量與蔗糖轉(zhuǎn)化酶及蔗糖合成酶活性相關(guān)。對(duì)多糖的研究主要集中于含量測(cè)定、化學(xué)成分分析及藥理作用，關(guān)于多糖的代謝途徑尚不清楚，本研究克隆了鐵皮石斛可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶(Soluble acid invertase,SAI)基因SAI，并進(jìn)行實(shí)時(shí)定量表達(dá)分析，為進(jìn)一步研究該基因表達(dá)調(diào)控和功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵皮石斛由云南紅河州巨峰石斛種植有限公司提供，以1年生幼嫩葉片為材料進(jìn)行SAI基因克隆。以1年生、2年生和3年生的根、莖、葉為材料分析鐵皮石斛不同年齡和不同組織中SAI基因的表達(dá)。

大腸埃希菌DH5α，Marker DL2000 Plus購(gòu)于北京全式金生物公司，pMD19-T (D102A)載體、5′RACE試劑盒(編號(hào)D315)、3′RACE試劑盒(編號(hào)D314)購(gòu)于TaKaRa公司，總RNA提取試劑盒、DNA消化試劑盒、反轉(zhuǎn)錄酶SuperScript? III First-Strand Synthesis SuperMix及qPCR反應(yīng)試劑PowerUp? SYBR? Green Master Mix購(gòu)于美國(guó)Life Technologies公司。PCR反應(yīng)試劑濃度為TaKaRa LATaq? 5 U· μL-1、 4種dNTP各2.5 mmol· L-1、常規(guī)引物10 μmol· L-1、RT-PCR引物20 μmol·L-1。PCR產(chǎn)物用12 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2 鐵皮石斛SAI基因克隆

用RNA提取試劑盒提取鐵皮石斛總RNA，RNA純度采用Merinton SMA4000超微量分光光度計(jì)(北京普萊恒通科技有限公司)測(cè)定。用DNA消化試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行消化及反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)Genbank中SAI基因的保守區(qū)域，設(shè)計(jì)鐵皮石斛SAI基因的特異性擴(kuò)增引物SAIF1(5′-GGCACGGGTATGTGGGAGTG-3′)和SAIR1(5′-GGTCATAAAATGTCTTTGATGC-3′)，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系(50 μL)為：cDNA 2 μL，TaKaRa LATaq? 0.5 μL，10×LA PCR Buffer II(含Mg2+)5 μL，dNTP 8 μL，SAIF1和SAIR1各2 μL，滅菌水：30.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，51℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。將擴(kuò)增獲得片段克隆到pMD19-T載體上，送上海生工測(cè)序。

1.3 鐵皮石斛SAI基因3′端克隆

根據(jù)“1.2”獲得的SAI基因部分序列，設(shè)計(jì)2條上游特異引物SAIF2(5′-AATGAGAACAAGTGGGTG-3′)和SAIF3(5′-GCATCAAAGACATTTTATGACC-3′)。采用3′-RACE試劑盒進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，以引物SAIF2及試劑盒中的Outer Primer進(jìn)行第1輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系(50 μL)為：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液1μL，1×cDNA Dilution Buffer II 8 μL，SAIF2引物1 μL，3′RACE Outer Primer 1 μL，TaKaRa LATaq? 0.25 μL，10×LA PCR Buffer II(含Mg2+) 5 μL，滅菌水 33.75 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，20個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。以第1次PCR產(chǎn)物為模板，以SAIF3及Inner Primer為引物進(jìn)行第2輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系(50 μL)為：Outer PCR產(chǎn)物1 μL，dNTP 8 μL，SAIF3引物1 μL，3′RACE Inner Primer 1 μL，TaKaRa LATaq? 0.25 μL，10×LA PCR Buffer II(含Mg2+)5 μL，滅菌水 33.75 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。將擴(kuò)增獲得片段克隆到pMD19-T載體上，送上海生工測(cè)序。

1.4 鐵皮石斛SAI基因5′端克隆

用5′-RACE試劑盒克隆SAI基因的5′端序列，根據(jù)“1.2”獲得的SAI基因部分序列設(shè)計(jì)2條特異性下游引物SAIR2(5′-ATCAACGCTTACAGGAAA-3′)和SAIR3(5′-CACCCACTTGTTCTCATT-3′)。以引物SAIR2及Outer Primer進(jìn)行第1輪PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系(50 μL)為：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液2 μL，1×cDNA Dilution Buffer II 8 μL，SAIR2引物1 μL，5′RACE Outer Primer 1 μL，TaKaRa LATaq? 0.25 μL，10×LA PCR Buffer II(含Mg2+) 5 μL，滅菌水 32.75 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，52℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。以第1次PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行第2輪PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系同“1.3”中第2輪PCR的反應(yīng)體系(引物替換為SAIR3和5′RACE Inner Primer)。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。將擴(kuò)增獲得片段克隆到pMD19-T載體上，送上海生工測(cè)序。用DNAMAN軟件進(jìn)行序列拼接。

1.5 鐵皮石斛SAI基因的全長(zhǎng)擴(kuò)增

根據(jù)拼接序列設(shè)計(jì)特異引物SAIF4(5′-GCATGCTCTACACCGGTTCCACCAA-3′)和SAIR4(5′-GCTTATGAGAATTGGTATGCGTG-3′)擴(kuò)增鐵皮石斛ORF全長(zhǎng)。反應(yīng)體系參照“1.2”。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。將擴(kuò)增獲得片段克隆到pMD19-T載體上，送上海生工測(cè)序。

1.6 鐵皮石斛SAI基因的生物信息學(xué)分析

采用Computer pI/Mw Tool在線軟件進(jìn)行蛋白分析，使用ExPASyProtParamTool預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，利用TMHMM的Transmembrane Prediction Server預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域，使用Swiss-model進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和結(jié)構(gòu)域分析。

1.7 鐵皮石斛SAI基因的qRT-PCR分析

根據(jù)已經(jīng)獲得的鐵皮石斛SAI基因序列，設(shè)計(jì)RT-PCR擴(kuò)增引物SAIF5(5′-GCTGGGCTTGACACATCGG -3′)和SAIR5(5′-CCACTTGTTCTCATTAGCATCATACC -3′)，目的片段123 bp。根據(jù)金釵石斛D.nobile內(nèi)參基因GAPDH(GQ250049.1)設(shè)計(jì)內(nèi)參引物GAPDHF(5′-GTGCCAAGAAGGTTATCATCT-CTG-3′)和GAPDHR(5′-CTCATGCTCATTAACACCAACAAC-3′)，目的片段74 bp。使用ABI7500熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析，每個(gè)樣本重復(fù)3次，反應(yīng)體系(20 μL)為：cDNA 5 μL，PowerUp? SYBR? Green Master Mix 10 μL，正向引物0.2 μL，反向引物 0.2 μL，50×ROX 0.04 μL，滅菌水 4.56 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，60 ℃34 s，72 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后從60 ℃升高到98 ℃獲取熔解曲線。采用SPSS17.0軟件LSD多重比較進(jìn)行顯著差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛SAI基因全長(zhǎng)擴(kuò)增與同源性分析

經(jīng)SMA4000超微量分光光度計(jì)測(cè)定，各樣本總RNA純度高、完整性好。以鐵皮石斛cDNA為模板，SAIF1及SAIR1為引物，PCR擴(kuò)增獲得1條清晰、特異性好的條帶，將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后連接到pMD19-T載體上，篩選陽(yáng)性質(zhì)粒、測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLASTx比對(duì)，結(jié)果顯示其與柑橘Citrusunshiu酸性轉(zhuǎn)化酶基因序列、甜橙C.sinensis酸性β-呋喃果糖苷酶基因序列相似性最高，達(dá)77%，與其他植物酸性轉(zhuǎn)化酶基因序列相似性均高于68%。

根據(jù)已獲得的片段設(shè)計(jì)特異引物，采用RACE試劑盒進(jìn)行3′端和5′端擴(kuò)增，3′端擴(kuò)增獲得930 bp左右的片段，5′端獲得450 bp左右的片段，測(cè)序后進(jìn)行NCBI BLASTx比對(duì)。DANMAN 軟件拼接后獲得1 595 bp的序列，利用ORF finder查找完整的開放閱讀框，其ORF包含1 368個(gè)堿基，編碼455個(gè)氨基酸，5′端非編碼區(qū)有111 bp，3′端非編碼區(qū)有116 bp。根據(jù)ORF設(shè)計(jì)引物(SAIF4/SAIR4)擴(kuò)增編碼區(qū)，獲得了1條特異性較好的條帶，大小為1 368 bp(圖1)。

M: Marker DL2000 Plus。

Fig.1 Amplification of full length ofSAIgene ofDendrobiumofficinale

2.2 鐵皮石斛SAI基因的生物信息學(xué)分析

采用在線軟件Computer pI/MW Tool對(duì)SAI基因進(jìn)行蛋白分析，該序列相對(duì)分子質(zhì)量為50 7000，理論等電點(diǎn)5.32。使用在線軟件ExPASyProtParamTool分析SAI基因的氨基酸組成，該序列編碼的氨基酸中丙氨酸所占的比例最大，占8.1%。其不穩(wěn)定系數(shù)為37.8，無(wú)信號(hào)肽，基因編碼的蛋白是非跨膜結(jié)構(gòu)的親水性熱穩(wěn)定蛋白，完全在細(xì)胞內(nèi)起作用，定位于液泡中。BLASTx預(yù)測(cè)該蛋白功能結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)該蛋白含有多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域和保守結(jié)構(gòu)，其中包括糖基轉(zhuǎn)化酶家族32的保守結(jié)構(gòu)域(圖2)。

圖2 鐵皮石斛SAI基因保守結(jié)構(gòu)域Fig.2 Conservative structure domains of SAI gene of Dendrobium officinale

采用MEGA5軟件UPGMA法對(duì)Genbank中部分植物的酸性轉(zhuǎn)化酶基因氨基酸序列進(jìn)行聚類分析，從圖3可以看出，鐵皮石斛SAI基因氨基酸序列與玉米Zeamays液泡轉(zhuǎn)化酶基因、甘蔗SaccharumofficinarumSAI基因的親緣關(guān)系最近，三者聚為一類。

圖3 植物酸性轉(zhuǎn)化酶基因氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of amino acid sequences of plant acid invertase genes

2.3 鐵皮石斛SAI基因的表達(dá)分析

使用2-ΔΔCt分析方法[9]，將1年生鐵皮石斛根的SAI基因表達(dá)量設(shè)為對(duì)照，即2-ΔΔCt值定義為1。從圖4可以看出，SAI基因在鐵皮石斛不同發(fā)育階段不同組織的表達(dá)量差異較大。在2年生莖中的表達(dá)量最高，是1年生和3年生莖的表達(dá)量的2.4倍左右，差異顯著(P<0.05)，但在1年生和3年生莖中基因表達(dá)量無(wú)顯著差異。在根中，SAI基因的表達(dá)量隨生育年限的增加呈逐年增加的趨勢(shì)，但變化幅度較小，1年生與3年生間存在顯著差異。在葉中，1年生的表達(dá)量最高，顯著高于2年生和3年生葉的表達(dá)量。

柱子上凡具有一個(gè)相同小寫字母者，表示差異不顯著(P>0.05， LSD法)。

圖4 鐵皮石斛SAI基因表達(dá)的時(shí)空特異性分析

Fig.4 Spatio-temporal expression analysis ofSAIgene inDendrobiumofficinale

3 討論與結(jié)論

酸性轉(zhuǎn)化酶是催化蔗糖不可逆降解的關(guān)鍵酶之一，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和形態(tài)建成過(guò)程中具有重要作用。酸性轉(zhuǎn)化酶是由1個(gè)多基因家族編碼的蛋白質(zhì)[10-11]，分為細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶亞家族和液泡酸性轉(zhuǎn)化酶亞家族，在不同種植物或同一種植物的不同部位的多基因家族的不同成員間的相對(duì)分子質(zhì)量不同，從50 000到80 000不等，為單體或二聚體。液泡酸性轉(zhuǎn)化酶在多數(shù)植物中至少有 2 個(gè)同工酶，以可溶性蛋白積累于液泡的酸性區(qū)域。

本研究克隆了鐵皮石斛SAI基因cDNA全長(zhǎng)為1 595 bp，ORF編碼區(qū)為1 368 bp，共編碼455個(gè)氨基酸，其蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為50 700。與其他植物液泡酸性轉(zhuǎn)化酶基因的氨基酸進(jìn)行同源分析，相似性最高為77%，最低也在68%以上。該基因編碼的蛋白具有糖基轉(zhuǎn)化酶家族32 的保守結(jié)構(gòu)域，靠近N-末端含有1個(gè)β-呋喃果糖苷酶的特征序列，即五肽NDPNG/A保守結(jié)構(gòu)，靠近C-末端還有1個(gè)半胱氨酸(Cys)殘基及其MWECV/P結(jié)構(gòu)域，這些均為酸性轉(zhuǎn)化酶的催化和功能結(jié)構(gòu)域[12]，因此，初步鑒定本研究克隆的基因?yàn)殍F皮石斛液泡酸性轉(zhuǎn)化酶基因。

在植物生長(zhǎng)發(fā)育的不同階段以及不同的器官組織中，酸性轉(zhuǎn)化酶基因的表達(dá)具有時(shí)間與空間上的差異[13-14]。本研究表明，SAI基因在1年生鐵皮石斛根、莖、葉中的表達(dá)量較高，主要促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和形態(tài)建成[15]。SAI基因在2年生鐵皮石斛莖中的表達(dá)量最高，主要促進(jìn)蔗糖分解成葡萄糖和果糖，為多糖的積累提供基礎(chǔ)，這與諸燕等[16]觀點(diǎn)一致，認(rèn)為2年生鐵皮石斛可溶性多糖的積累最快，進(jìn)一步證實(shí)鐵皮石斛酸性轉(zhuǎn)化酶活性與可溶性多糖的積累有直接關(guān)系，可溶性多糖的合成是以葡萄糖、果糖等單糖為起點(diǎn)的。

在甘蔗、胡蘿卜等植物中均發(fā)現(xiàn)有2個(gè)可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶基因，甘蔗中AI的2個(gè)同工酶相對(duì)分子質(zhì)量為61 100和74 400，在胡蘿卜中的相對(duì)分子質(zhì)量分別為 61 000和49 000[17-18]。酸性轉(zhuǎn)化酶基因反義轉(zhuǎn)入馬鈴薯中，使馬鈴薯中還原糖和淀粉含量降低[19]，轉(zhuǎn)入甜瓜中，使葡萄糖、果糖含量降低，蔗糖含量升高[20]。因此，下一步需進(jìn)行鐵皮石斛SAI基因的遺傳轉(zhuǎn)化研究，為鐵皮石斛SAI基因功能研究以及分子育種和遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

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【責(zé)任編輯 莊 延】

Cloning and expression analysis of soluble acid invertase gene from Dendrobium officinale

MENG Hengling, ZHANG Wei, LU Bingyue, SU Yilan, XUE Chunli

(Key Laboratory of High Quality Crops Cultivation and Safety Control/College of Life
Science and Technology，Honghe University, Mengzi 661100, China)

【Objective】 To clone soluble acid invertase (SAI) gene inDendrobiumofficinale, and perform bioinformatics and spatio-temporal expression analysis.【Method】The full length cDNA ofSAIgene inD.officinalewas cloned based on homologous sequences, the sequences were analyzed using bioinformatics tools, and the tissue-specific expressions were analyzed using qRT-PCR. 【Result】 The full lengthSAIgene inD.officinaleis 1 595 bp, the full length cDNA is 1 368 bp, and the Genbank accession number is KU598852.TheSAIgene encodes 455 amino acids, and the protein molecular mass is 50 700. NCBI BLASTx results show that theD.officinaleacid invertase gene has 77% similarity withCitrusunshiuacid invertase gene andC.sinensisacid beta-fructofuranosidase gene, and has above 68% similarity with acid invertase genes from other plants. Cluster analysis shows thatD.officinaleacid invertase gene has the closest genetic relationship withZeamaysvacuolar invertase gene and sugarcane (Saccharumofficinarum)SAIgene. The encoded protein ofD.officinaleSAIgene is positioned in vacuole, and is a hydrophilic, non-transmembrane and heat-stable protein. RT-PCR results showed that the expression level ofSAIgene was the highest in 2-year-oldD.officinalestems, and the lowest in 3-year-oldD.officinaleleaves.【Conclusion】 The cloned gene is identified as theD.officinalevacuolarSAIgene. Its expression has great differences among different tissues and at different developmental stages.

Dendrobiumofficinale; soluble acid invertase; gene cloning; real-time quantitative PCR

2016- 05- 05優(yōu)先出版時(shí)間：2017-01-10

孟衡玲(1981—)，女，講師，博士，E-mail: menghengl@163.com

云南省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(2012FB174)；紅河學(xué)院博碩項(xiàng)目(14bs09);紅河學(xué)院學(xué)術(shù)帶頭人后備人才項(xiàng)目(2015HB0303)

S828

A

1001- 411X(2017)02- 0081- 05

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170110.1424.044.html

孟衡玲， 張 薇， 盧丙越， 等.鐵皮石斛可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶基因克隆與表達(dá)分析[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017,38(2):81- 85.