鹽酸氯苯胍在兔體內(nèi)的藥動學(xué)及生物利用度研究

李 強(qiáng)， 謝 順， 曾松情， 李 潔， 徐尤發(fā)， 張 申， 黃顯會

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院/國家殘留基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510642)

鹽酸氯苯胍在兔體內(nèi)的藥動學(xué)及生物利用度研究

李 強(qiáng)， 謝 順， 曾松情， 李 潔， 徐尤發(fā)， 張 申， 黃顯會

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院/國家殘留基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510642)

【目的】研究抗球蟲藥鹽酸氯苯胍在家兔體內(nèi)的藥物代謝動力學(xué)特征及內(nèi)服給藥的生物利用度?！痉椒ā?6只健康新西蘭大白兔，公母各半，分為2組，一組以2.00 mg·kg-1單次靜脈注射給藥，另一組以100.00 mg·kg-1單次內(nèi)服給藥，通過耳部靜脈采血，并用HPLC-UV法檢測血漿中的鹽酸氯苯胍濃度。使用WinnonlinTM藥動學(xué)軟件非房室模型計(jì)算相關(guān)藥動學(xué)參數(shù)，采用SPSS 16.0軟件得到藥時曲線圖?！窘Y(jié)果】兔靜脈注射鹽酸氯苯胍(2.00 mg·kg-1)后，藥-時曲線下面積為1.72 μg·h·mL-1，血漿清除率為1.17 L·h-1·kg-1，表觀分布容積為2.87 L·kg-1，消除半衰期為1.72 h；內(nèi)服鹽酸氯苯胍(100.00 mg·kg-1)后，藥-時曲線下面積為6.33 μg·h·mL-1，消除半衰期為8.94 h。鹽酸氯苯胍2種給藥方式的藥動學(xué)參數(shù)均存在顯著差異(P<0.05)，內(nèi)服給藥的生物利用度較低，僅為7.36%?！窘Y(jié)論】鹽酸氯苯胍靜脈注射給藥的表觀分布容積較大，藥物在兔組織中分布廣泛，并且消除迅速；內(nèi)服鹽酸氯苯胍后，藥物經(jīng)腸道吸收的量較少，體內(nèi)藥物殘留較低。

鹽酸氯苯胍； 藥物代謝動力學(xué)； 生物利用度； 新西蘭大白兔

鹽酸氯苯胍(Robenidine hydrochloride)是一種人工合成抗球蟲藥[1]，分子式為C15H13Cl2N5·HCl，相對分子質(zhì)量為370.66，在結(jié)構(gòu)上屬于胍基衍生物[2]。該藥于20世紀(jì)70年代初在美國上市并作為飼料添加劑被廣泛使用，主要用于預(yù)防和治療雞的急球蟲感染，對柔嫩艾美耳球蟲、毒害艾美耳球蟲、堆型艾美耳球蟲、布氏艾美耳球蟲、變位艾美耳球蟲等均有效果[3]，具有毒性低、療效高[4]、抗蟲譜廣、成本低等優(yōu)點(diǎn)。同時，該藥物被證明具有輕微的促進(jìn)營養(yǎng)吸收作用[5]。我國批準(zhǔn)用于禽、危球蟲病的預(yù)防和治療[1]。目前該藥物的研究集中于藥物殘留檢測方法[6-7]和提取方法[8-9]，靶動物的藥動學(xué)及生物利用度鮮見報(bào)道。本文對健康兔內(nèi)服與靜脈注射鹽酸氯苯胍的藥動學(xué)進(jìn)行研究，以期豐富相關(guān)研究數(shù)據(jù)，并為鹽酸氯苯胍殘留的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動物 16只健康新西蘭大白兔，公母各半，購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，體質(zhì)量為(2.00±0.20) kg。試驗(yàn)前于代謝籠中飼養(yǎng)觀察7 d，自由飲水采食。將16只兔隨機(jī)分為2組，每組8只，第1組于左耳靜脈注射給藥，劑量為 2 mg·kg-1；第2組單次內(nèi)服給藥，劑量為100 mg·kg-1(獸藥使用指南內(nèi)服推薦劑量為10～15 mg·kg-1)。給藥前12 h及給藥后3 h禁食，僅可飲水。

1.1.2 藥品與試劑 鹽酸氯苯胍標(biāo)準(zhǔn)品(w為99.8%，批號H0041110，對照)，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；鹽酸氯苯胍原料藥(經(jīng)測定w為90.30%)，由廣州綠州生物技術(shù)有限公司提供；乙酸、乙酸乙酯、三氯甲烷、三乙胺和磷酸二氫銨，均為分析純(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；甲醇、乙腈和甲酸，均為色譜純(Sigma公司)。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 高效液相色譜儀：含二聯(lián)泵、脫氣泵、色譜工作站、紫外檢測器、自動進(jìn)樣器，LC-20A型，日本島津公司；電子分析天平：島津AUW120D型，精度0.001 mg，日本島津公司，超純水系統(tǒng)：Milli-Q型，美國Millipore公司；高速冷凍離心機(jī)：Avanti? J-26 XP型，美國 Beckman-Coulter公司；臺式冷凍離心機(jī)：LEGEND Mach1.6R型，ThermoFisher德國Sorvall公司；pH計(jì)：pHs-25型，上海精科雷磁儀器廠；旋渦振蕩器：HS250 Basic 型，馬來西亞IKA公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制 1)儲備液：精密稱取11.11 mg的鹽酸氯苯胍標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL棕色容量瓶中，用色譜甲醇溶解，制成含氯苯胍1 000 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。放入4 ℃冰箱保存。2)注射液：定量稱取鹽酸氯苯胍原料藥，用體積分?jǐn)?shù)為40%的N,N-二甲基乙酰胺水溶液稀釋成4 mg·mL-1的注射液，現(xiàn)配現(xiàn)用。3)0.05 mol·L-1的磷酸二氫銨緩沖液：稱取磷酸二氫銨5.75 g，于1 000 mL的容量瓶定容，用三乙胺調(diào)節(jié)pH至6.8。

1.2.2 給藥及采樣 靜脈注射組于左耳耳緣靜脈注射給藥，在給藥前(0 h)采集空白樣品并在給藥后的0.167、0.250、0.5、1.0、1.5、2、3、4、6、8、12、16、24 h分別從右耳采集血液樣品。內(nèi)服組混飼給藥，在給藥前(0 h)采集空白樣品并在給藥后的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、16、24、36、48、72、96 h分別從雙耳采集血液樣品。采集血液置于肝素鈉抗凝管中，混勻，3 000 r·min-1，離心10 min，分離血漿，-20 ℃保存。

1.2.3 血漿樣品前處理 吸取血漿樣品0.5 mL，置于5 mL的離心管中，加入體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸乙酯3 mL，渦旋1 min，10 000 r·min-1離心10 min(4 ℃)。吸取上清液置于15 mL玻璃管中，于40 ℃水浴氮?dú)獯蹈?，后? mL色譜甲醇復(fù)溶，0.22 μm濾膜過濾，裝入進(jìn)樣瓶供HPLC進(jìn)樣分析。

1.2.4 色譜條件 色譜柱為Gemini 5u C18 100A(250 mm×4.0 mm×5 μm)，美國Penomenex公司。紫外檢測波長為312 nm；流動相為磷酸二氫銨溶液-乙腈 (體積比30︰70)溶液； 柱溫30 ℃，流速1 mL·min-1，進(jìn)樣量為20 μL。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 使用IBM公司的SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件計(jì)算血漿中鹽酸氯苯胍濃度的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，同時以血藥濃度平均值和時間作藥-時曲線圖。使用美國Pharsight公司的WinnonlinTM非房室模型計(jì)算試驗(yàn)動物的藥動學(xué)參數(shù)，

2 結(jié)果與分析

2.1 靜脈注射鹽酸氯苯胍的藥動學(xué)特征

兔耳緣靜脈注射鹽酸氯苯胍(2.00 mg·kg-1)后，不同時間的血藥濃度見表1，繪制的藥-時曲線見圖1。采用非房室模型對血藥濃度進(jìn)行分析，得到的藥動學(xué)參數(shù)見表2。結(jié)果表明，靜注給藥后的藥時曲線下面積AUC0-t為1.72 μg·h·mL-1，血漿清除率為1.17 L·h-1·kg-1，表觀分布容積(Vd)為2.87 L·kg-1，t1/2為1.72 h。該藥靜脈注射后表觀分布容積較大，表示藥物大部分分布于組織，且消除迅速，在給藥劑量為2.00 mg·kg-1的情況下，血漿內(nèi)的藥物6 h即可基本消除。

2.2 內(nèi)服鹽酸氯苯胍的藥動學(xué)特征

兔內(nèi)服鹽酸氯苯胍(100.00 mg·kg-1)后，不同時間的血藥濃度見表1，繪制的藥-時曲線見圖1。采用非房室模型對血藥濃度進(jìn)行分析，得到的藥動學(xué)參數(shù)見表2。結(jié)果表明，鹽酸氯苯胍內(nèi)服給藥吸收非常緩慢，達(dá)到高峰時間(tmax)為20 h，并且吸收較差，表現(xiàn)為Cmax較低，僅為0.32 μg·mL-1, AUC0-t為6.33 μg·h·mL-1，表明藥物進(jìn)入體內(nèi)的總量很低；t1/2為8.94 h，說明藥物排泄緩慢，在體內(nèi)保留時間較長；經(jīng)計(jì)算，該藥物的絕對生物利用度僅為7.36%，說明內(nèi)服鹽酸氯苯胍后，藥物基本不吸收，而是主要以原型排出體外，這與田苗苗等[10]的試驗(yàn)結(jié)果相符。此外，鹽酸氯苯胍2種給藥方式的各藥動學(xué)參數(shù)均存在極顯著的差異(P<0.01)。

表1 兔靜脈注射鹽酸氯苯胍(2.00 mg·kg-1)與內(nèi)服鹽酸氯苯胍(100.00 mg·kg-1)的血藥濃度1)

Tab.1 The plasma drug concentrations in rabbits treated by intravenous and oral administration of robenidine hydrochloride at 2.00 and 100.00 mg·kg-1respectively

靜脈注射內(nèi)服t采血/hρ(鹽酸氯苯胍)/(μg·mL-1)t采血/hρ(鹽酸氯苯胍)/(μg·mL-1)0．1671．57±0．121ND0．250．99±0．112

1)“

圖1 兔內(nèi)服(100.00 mg·kg-1)與靜脈注射(2.00 mg·kg-1)鹽酸氯苯胍的藥-時曲線圖

Fig.1 Concentration-time curve of robenidine hydrochloride in rabbits treated by oral administration and intravenous administration at 100.00 and 2.00 mg·kg-1respectively

表2 兔靜脈注射和內(nèi)服鹽酸氯苯胍的藥動學(xué)參數(shù)1)

Tab.2 The plasma pharmacokinetic parameters in rabbits treated by intravenous and oral administration of robenidine hydrochloride

藥動學(xué)參數(shù)靜脈注射組內(nèi)服給藥組Kel/h-10．42±0．100．09±0．03?t1/2/h1．72±0．398．94±3．45?tmax/h20．00±8．81Cmax/(μg·mL-1)0．32±0．09AUC0-t/(μg·h·mL-1)1．72±0．446．33±2．38?Vd/(L·kg-1)2．87±0．67CL/(L·h-1·kg-1)1．17±0．25MRT/h1．08±0．4823．28±6．07?F/%7．36

1)* 表示內(nèi)服給藥組與靜脈注射組比較差異極顯著(P<0.01，n=8，t檢驗(yàn))。

3 討論與結(jié)論

對于具有肝腸循環(huán)的藥物來說，其靜脈注射的藥-時曲線往往具有再吸收的特點(diǎn)[11-12]。從靜脈注射鹽酸氯苯胍的藥動學(xué)參數(shù)可以看出，靜脈注射給藥時表觀分布容積大，藥物分布廣泛，消除速度較快，血藥中的藥物濃度在6 h后便低于定量限，且在0～24 h的藥-時曲線沒有顯示該藥物具有再吸收的特點(diǎn)。一方面是由于藥物的表觀分布容積大，且在血漿中消除速度較快；另一方面可能與鹽酸氯苯胍的在兔體內(nèi)主要由腎臟代謝有關(guān)。該藥物是否具有肝腸循環(huán)，還需進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

觀察內(nèi)服鹽酸氯苯胍的藥-時曲線可知，該藥物內(nèi)服給藥的藥時曲線明顯具有2個吸收過程，第1個吸收時段為0～8 h，為內(nèi)服給藥的常規(guī)吸收過程；第2個吸收時段為給藥后12～24 h，且在此過程中到達(dá)最高濃度。本試驗(yàn)中，大白兔使用代謝籠進(jìn)行飼喂，尿液與糞便及時分離回收，排除了動物因食糞造成藥物再吸收的可能。藥物在腸道內(nèi)環(huán)境以及腸道微生物的作用下，代謝成水溶性強(qiáng)更易被腸道吸收的化合物。

在生產(chǎn)實(shí)踐中，鹽酸氯苯胍主要用于防治雞、兔的球蟲感染，作用部位在腸道，不需要吸收后發(fā)揮全身治療作用，造成動物性食品中的藥物殘留。本研究中，內(nèi)服給藥的末端消除半衰期較長，生物利用度低表明內(nèi)服給藥消除緩慢，體內(nèi)存留時間較長，進(jìn)入動物體內(nèi)的氯苯胍量較低。Zulalian等[13]采用14C標(biāo)記法對氯苯胍在雞體內(nèi)的代謝和殘留規(guī)律研究發(fā)現(xiàn)，單劑量內(nèi)服用14C標(biāo)記的鹽酸氯苯胍，雞在24 h內(nèi)排出標(biāo)記放射性化合物為82%, 144 h后鹽酸氯苯胍排出量達(dá)99%。田苗苗等[10]的研究表明，兔內(nèi)服氯苯胍后主要以原藥的形式排出體外，隨糞便排出的氯苯胍占內(nèi)服總量的87.17%，尿液中氯苯胍占內(nèi)服總量的0.56%。這與本試驗(yàn)的結(jié)果相符，也符合鹽酸氯苯胍的臨床用藥目的。

[1] 陳杖榴. 獸醫(yī)藥理學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2010: 373.

[2] 范本倫. 氯苯胍:一種新的高效球蟲藥[J]. 國外畜牧科技，1979(3): 43-48.

[3] SORRIBAS V, ARRUEBO M P, ALVARADO F, et al. Action of robenidine on the intestinal transport and digestion of nutrients in rabbit[J]. Eur J Pharmacol，1993, 248(2): 137-144.

[4] KENNETT R L, KANTOR S, GALLO A. Efficacy studies with robenidine, a new type of anticoccidial, in the diet[J]. Poult Sci，1974, 53(3): 978-986.

[5] European Food Safety Authority (EFSA). Scientific opinion on safety and efficacy of cycostat 66G (robenidine hydrochloride) for rabbits for breeding and fattening: Panel on additives and products or substances used in animal feed [J]. EFSA J，2011，9(3):1-32.

[6] YEOM H, YANG D H, SUH J H, et al. Determination of robenidine residues in chicken muscle by high performance liquid chromatography with ultraviolet detection[J]. Arch Pharm Res，2013, 36(3): 359-365.

[7] 劉勇軍，吳銀良，姜艷彬. 高效液相色譜法測定雞組織與雞蛋中氯苯胍的殘留量][J]. 色譜， 2010, 28(9): 905-907.

[8] WILGA J, WASIK A K, NAMIESNIK J. Comparison of extraction techniques of robenidine from poultry feed samples[J]. Talanta，2007, 73(5): 812-819.

[9] 湯菊芬，蔡佳，廖建萌，等.HPLC-MS/MS法同時測定水產(chǎn)品中的諾氟沙星、鹽酸小檗堿、鹽酸氯苯胍殘留[J]. 中國獸藥雜志，2014(8): 55-60.

[10]田苗苗，郭春娜，懷彬彬，等.鹽酸氯苯胍灌服后在兔尿液和糞便中的排泄規(guī)律[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015, 36(3): 8-12.

[11]程娟. A771726在大鼠體內(nèi)肝腸循環(huán)的研究[D]. 合肥：安徽醫(yī)科大學(xué)，2010.

[12]鄭培良. 藥物肝腸循環(huán)對其藥理作用的影響[J]. 中級醫(yī)刊，1987(7): 43-44.

[13]ZULALIAN J, CHAMPAGNE D A, WAYNE R S, et al. Absorption, excretion, and metabolism of 1,3-bis(p-chlorobenzylideneamino)guanidine hydrochloride (robenz robenidine hydrochloride) in the chicken[J]. J Agric Food Chem，1975, 23(4): 724-730.

【責(zé)任編輯 周志紅】

Studies on pharmacokinetic and bioavailability of robenidine hydrochloride in rabbits

LI Qiang, XIE Shun, ZENG Songqing, LI Jie, XU Youfa, ZHANG Shen, HUANG Xianhui

(College of Veterinary Medicine/National Reference Laboratory of Veterinary Drug Residues,
South China Agricultural University, Guangzhou 510642， China)

【Objective】 To investigate the pharmacokinetics and bioavailability after oral administration of the coccidiostat, robenidine hydrochloride in rabbits. 【Method】 A total of 16 healthy New Zealand white rabbits were allotted to two groups and received single intravenous administration of robenidine hydrochloride at the dose of 2.00 mg·kg-1and single oral administration at the dose of 100.00 mg·kg-1respectively. Blood samples were collected and analyzed by high-performance liquid chromatography (HPLC) using UV. Pharmacokinetic parameters were estimated using the WinnonlinTMsoftware package and the curve of time and concentration was obtained using SPSS 16.0. 【Result】After i.v. injection, area under the concentration-time curve (AUC) was 1.72 μg·h·mL-1, plasma clearance (CI) was 1.17 L·h-1·kg-1, the volume of distribution was 2.87 L·kg-1and the half-life of elimination (t1/2) was 1.72 h. After oral administration,t1/2was 8.94 h and AUC was 6.33 μg·h·mL-1. Statistical analysis showed that there were significant differences between pharmacokinetic parameters of intravenous and oral administration (P<0.05), and the bioavailability following oral administration was low (7.36%). 【Conclusion】The volume of distribution following robenidine hydrochloride was high, suggesting that the drug was widely distributed in rabbits and eliminated rapidly; Robenidine hydrochloride for oral administration was rarely absorbed into the blood or blood circulation, and the residuesinvivowas low.

robenidine hydrochloride; pharmacokinetic; bioavailability; rabbit

2016- 04- 29優(yōu)先出版時間：2017-01-10

李 強(qiáng)(1989—)，男，碩士研究生，E-mail: 382971516@qq.com; 通信作者：黃顯會(1969—)，男，高級獸醫(yī)師，博士，E-mail: xhhuang@scau.edu.cn

農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制定與修訂項(xiàng)目(2013091194)

S859.7

A

1001- 411X(2017)02- 0018- 04

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170110.1423.004.html

李 強(qiáng)， 謝 順， 曾松情， 等.鹽酸氯苯胍在兔體內(nèi)的藥動學(xué)及生物利用度研究[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017,38(2):18- 21.