水稻根際土壤溶磷菌的分離、鑒定及對水稻的促生作用

武志海, 孫合美, 楊美英, 盧冬雪, 岳勝天, 付 麗

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 長春 130118; 2 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130118)

水稻根際土壤溶磷菌的分離、鑒定及對水稻的促生作用

武志海1?, 孫合美2?, 楊美英2, 盧冬雪2, 岳勝天2, 付 麗2

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 長春 130118; 2 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130118)

【目的】為明確水稻根際溶磷菌株溶磷能力及其對水稻植株及根際土壤磷含量的影響?！痉椒ā坷萌芰兹Ψ◤乃靖H土壤中分離獲得具有較強溶解Ca3(PO4)2能力的2株細菌NDW1和NDW3，根據(jù)16S rDNA對菌株進行鑒定。以NBRIP為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過正交試驗對2株菌株利用氮源、碳源及初始pH進行優(yōu)化，鑒定菌株的吲哚乙酸(IAA)分泌量，研究溶磷菌對水稻的促生作用，以及對土壤速效磷和水稻幼苗全磷含量的影響。【結(jié)果】菌株NDW1和菌株NDW3分別被鑒定為Enterobactersp.和Serratiasp.，2株菌株溶磷的最佳條件組合均為葡萄糖、蛋白胨及初始pH 6。2株菌株24 h內(nèi)最高溶磷量分別為294.95和312.93 μg·mL-1，且都可分泌IAA。土培和沙培條件下，溶磷菌NDW3對水稻株高、根長、最大葉長及地上干質(zhì)量都有明顯的促進作用，并且NDW3在2種種植條件下均顯著增加了根際土壤速效磷及水稻植株全磷含量?！窘Y(jié)論】從水稻根際土壤分離獲得2株溶磷能力較好的細菌菌株Enterobactersp. NDW1和Serratiasp. NDW3，菌株NDW3對水稻的促生作用強于菌株NDW1。

土壤溶磷菌； IAA； 促生作用； 磷含量； 水稻； 根際

磷是作物所必需的大量營養(yǎng)元素，在光合作用、能量轉(zhuǎn)移、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及大分子物質(zhì)的生物合成幾大代謝中都起著關(guān)鍵作用[1]。我國有74%的耕地土壤缺磷[2]，可溶性磷肥施入農(nóng)田后，由于土壤的固定等作用，大部分迅速轉(zhuǎn)變?yōu)樽魑镫y以吸收的無效磷，導(dǎo)致作物對施入磷肥的當季利用率不超過30%[3-4]。土壤中溶磷微生物能依靠自身的代謝產(chǎn)物或與其他生物協(xié)同作用[5]，將難溶性磷轉(zhuǎn)變成植物可吸收利用的磷形式，能顯著提高土壤中有效磷的含量，減少土壤對磷酸鹽的吸附固定，被公認為能夠安全、高效地活化土壤難溶磷。Hariprasad等[6]研究發(fā)現(xiàn)，接種溶磷菌劑，可增加作物的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、株高、根長以及吸收磷量和根際土壤有效磷含量。馮瑞章等[7]研究表明，接種溶磷菌能顯著提高燕麥地上部分和地下部分生物量，可促進植株氮、磷的吸收。但研究發(fā)現(xiàn)分離篩選獲得的溶磷微生物在實驗室條件下都具有較好的溶磷效果，但將它們接入土壤后則溶磷作用減弱甚至消失[8]。因此，篩選具有高效、穩(wěn)定溶磷能力的溶磷菌具有重要的意義。

溶磷菌在不同土壤類型、不同作物根際及不同土壤環(huán)境條件下的分布有所不同，其群落結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜[9]。小麥根際溶磷菌主要為洋蔥假單胞菌屬Pseudomonascepacia和埃希氏菌屬Escherichia[10]；玉米根際溶磷微生物主要是歐文氏菌屬Erwinia[11-12]；大豆根際主要為假單胞菌屬Pseudomonas、不動桿菌Acinetobacterpittiistrain和克雷伯氏菌屬Klebsiella[13-14]。水稻由于長期處于水環(huán)境下，其根際溶磷菌與其他作物根際表現(xiàn)不同，有研究表明主要為芽孢桿菌屬Bacillus和土壤單胞菌屬Agromonas[15]。本試驗從吉林省水稻種植區(qū)采樣，分離篩選獲得2株具有明顯溶磷酸鹽能力的菌株，對2株菌株溶磷能力及其對水稻植株和根際土壤磷含量的影響進行了研究，旨在為明確吉林省生態(tài)條件下水稻根際優(yōu)勢溶磷菌的分布提供數(shù)據(jù)支持，為生物菌肥的研制提供優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 供試土壤、培養(yǎng)基及營養(yǎng)液

1.1.1 供試土壤 從吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻試驗田(43°53′N, 125°10′E)采集水稻根際土壤，用塑料袋裝好密封帶回，放置4 ℃冰箱保存。盆栽試驗供試土壤采自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻試驗田，土壤基本農(nóng)化性質(zhì)為:有機質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為2.21 %，有效氮147 mg·kg-1，速效磷19 mg·kg-1，速效鉀75 mg·kg-1。將細沙過2 mm篩子，用清水將細沙上的土洗凈，之后用質(zhì)量分數(shù)為1 %的鹽酸浸泡24 h，再用清水洗細沙直到呈中性，放在干燥箱中烘干，并在烘箱中160 ℃滅菌4 h備用。

1.1.2 培養(yǎng)基 基礎(chǔ)培養(yǎng)基(LB): 蛋白胨10 g，酵母浸提液5 g，NaCl 10 g，去離子水1 000 mL，pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌20 min。無機磷基礎(chǔ)培養(yǎng)基: 采用國際植物研究所磷酸鹽生長培養(yǎng)基( NBRIP)，其成分為: 葡萄糖10 g，Ca3(PO4)25 g，MgCl25 g，MgSO40.25 g，KCl 0.2 g，(NH4)2SO40.1 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，115 ℃滅菌30 min。

1.1.3 營養(yǎng)液 營養(yǎng)液參照國際水稻研究所(IRRI)水稻營養(yǎng)液配方配制[16]: K2SO4、CaCl2、NaH2PO4·2H2O、NH4NO3、MgSO4·7H2O、Fe-EDTA和NaSiO3分別為0.32、 0.5、 0.16、 0.715、 0.83、 0.036和0.1 mmol·L-1，MnCl2、ZnSO4·7H2O、CuSO4、H3BO3和H2MoO4分別為4.55、 0.077、 0.078、 25和0.263 μmol·L-1。

1.2 溶磷菌菌株的分離和鑒定

1.2.1 溶磷菌的分離純化 用滅菌小刀將附著在水稻根表面的土壤刮下。取1 g土置于裝有50 mL 無菌水的三角瓶中振蕩1 h，之后靜置10 min。然后取1 mL 上清液經(jīng)梯度稀釋后涂布于固體NBRIP培養(yǎng)基上置于30 ℃條件下培養(yǎng)3 d 后計數(shù)，然后挑取不同形態(tài)的、具有溶磷圈的單菌落，于NBRIP培養(yǎng)基上劃線純化；純化3次，直至無雜菌長出。純化后的菌株接入液體NBRIP培養(yǎng)基、于30 ℃下振蕩培養(yǎng)，至對數(shù)期后進行菌種保存及后續(xù)試驗。

1.2.2 溶磷菌的溶磷圈鑒定 對篩選得到的2株細菌分別用接種環(huán)挑取單菌落均勻涂到NBRIP固體培養(yǎng)基平板中間，在30 ℃下培養(yǎng)7 d，觀察每個菌株的溶磷圈的情況，測量并拍照。

1.2.3 溶磷菌總DNA提取及16S rDNA序列分析 利用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌，離心后收集菌體，細菌DNA的提取參照文獻[17]進行。利用16S rDNA 的PCR 反應(yīng)通用引物[18](上游引物為27F: 5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′; 下游引物為1492R: 5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增。PCR擴增反應(yīng)體系(50 μL):EasyTaqbuffer 5 μL, 2.5 mmol·L-1dNTPs 4 μL，20 μmol·L-1引物各2 μL，DNA 模板1μL，EasyTaq酶0.3 μL，用無菌水補足至50 μL 體積。PCR 反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸120 s，進行30個循環(huán); 72 ℃延伸8 min。PCR 產(chǎn)物送至上海生工生物公司測序。利用Blast 軟件在GenBank 中與其他的16S rDNA序列進行同源性比較，選擇相似性較高的序列利用MEGA 5.0 軟件構(gòu)建菌株的16S rDNA系統(tǒng)樹。

1.3 溶磷菌的溶磷條件優(yōu)化

1.3.1 單因素試驗 以NBRIP培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，對不同碳源(葡萄糖、α-乳糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖)、氮源(硫酸銨、硝酸銨、牛肉膏、蛋白胨、尿素)及初始pH(5、6、7、8、9)進行單因子試驗。液體培養(yǎng)基100 mL 分裝在250 mL 三角瓶中備用。挑取溶磷菌單菌落接種于5 mL LB培養(yǎng)基中，D600 nm=0.5時以φ為0.5%接種至液體培養(yǎng)基中，以接種無菌水的培養(yǎng)基作對照，30 ℃，150 r·min-1搖床培養(yǎng)4 d，每隔12 h取樣1次,測定培養(yǎng)基上清液中可溶性磷含量，3次重復(fù)，確定較優(yōu)的碳源、氮源及初始pH。

1.3.2 正交試驗 選擇菌株生長及溶磷量增加最顯著的時間(24 h)進行碳源、氮源及初始pH的正交試驗，重復(fù)3 次。

1.3.3 溶磷量測定 吸取2 mL菌液，10 000 r·min-1、4 ℃離心10 min，鉬藍比色法測定其含磷量，計算供試菌株的溶磷量。

1.4 菌株產(chǎn)IAA的鑒定及植物促生試驗1.4.1 菌株產(chǎn)IAA的鑒定 參照文獻[19]的方法。

1.4.2 水稻種子處理及溶磷菌菌液的制備 水稻種子吉農(nóng)大809由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所提供，選擇籽粒飽滿均勻的種子浸種2 d，然后用φ為75%的乙醇溶液處理2 min，再用30 g·L-1的次氯酸鈉表面滅菌10 min，用無菌水反復(fù)沖洗后，將種子放于裝有濕潤濾紙的無菌平板上37 ℃倒置催芽12 h，待露白后30 ℃催芽12 h備用。

溶磷菌菌液的制備：挑取溶磷菌單菌落接種于5 mL液體LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，以φ為0.5%接種于100 mL液體LB培養(yǎng)基中，置于搖床，30 ℃, 150 r·min-1條件下進行培養(yǎng)，待菌液D600 nm為0.6～0.8時，將菌液稀釋成108cfu·mL-1菌懸液備用。

1.4.3 盆栽試驗 盆栽試驗分沙培和土培，參照文獻[20]的方法進行。沙培設(shè)置2個對照：CK1[不加Ca3(PO4)2；加全磷營養(yǎng)液]，CK2[加Ca3(PO4)2和無磷營養(yǎng)液]。2個處理：加Ca3(PO4)2和無磷營養(yǎng)液、接種菌株NDW1；加Ca3(PO4)2和無磷營養(yǎng)液、接種菌株NDW3。土培設(shè)置2個對照：CK1[不加Ca3(PO4)2]，CK2[加Ca3(PO4)2]。2個處理：加Ca3(PO4)2、接種菌株NDW1；加Ca3(PO4)2、接種菌株NDW3。Ca3(PO4)2與滅菌河沙(或稻田土壤)以φ為0.12%的比例充分混合后裝盆備用。每個塑料盆缽(12 cm×12 cm)裝滅菌河沙1 000 g、稻田土壤600 g，每盆種植水稻苗10株，每粒發(fā)芽水稻種子下加入108cfu溶磷菌，重復(fù)5次。置培養(yǎng)箱培養(yǎng)，光照16 h, 28 ℃，黑暗8 h, 25 ℃，沙培水稻苗用不含可溶性磷的水稻營養(yǎng)液進行澆灌，土培水稻苗用自來水澆灌。在水稻生長20 d后測定水稻生物量及各指標含量。

1.4.4 指標測定 株高、葉長、根長采用直接測量法。植株生物量測定方法為: 將鮮樣在105 ℃下殺青30 min，75 ℃烘干至恒質(zhì)量后稱其干質(zhì)量。

1.5 土壤速效磷和植物全磷測定

稱取風(fēng)干后的土樣和沙樣5 g，放入50 mL三角瓶中，用Olsen 法[21]測定土壤速效磷。植株全磷測定方法為H2SO4-H2O2消煮-釩鉬黃比色法[22]。

1.6 數(shù)據(jù)分析與處理

數(shù)據(jù)采用DPS 7.5及Microsoft Office Excel 2003,利用Duncan’s新復(fù)極差法進行多重比較，取數(shù)據(jù)平均值和標準差用于結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶磷菌的分離與鑒定

從水稻根際土壤中,經(jīng)多次分離純化獲得具有較強溶解Ca3(PO4)2能力的2株細菌，命名為NDW1、NDW3。2株溶磷菌在NBRIP培養(yǎng)基上產(chǎn)生明顯的溶磷圈，如圖1所示。為了進一步明確溶磷菌株的特性，分別提取了2株菌株的基因組DNA，進行16S rDNA鑒定。選取Acinetobactersp.、Burkholderiasp.、Enterobactersp.、Klebsiellasp.、Pseudomonassp.和Serratiasp.等菌屬的16S rDNA序列，利用Bioedit軟件進行核酸序列比對，利用MEGA 5.0的Neighbour-joining (NJ)以Maxium Composite Likelihood模型構(gòu)建進化樹，Bootstrap值為1 000，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出菌株NDW1與Enterobactersp.E20(基因登錄號為：CP012999.1)形成一個分支且支持率為96%，初步鑒定菌株NDW1為Enterobactersp.。菌株NDW3與Serratiamarcescensstrain B3R3(基因登錄號為：CP013046.1)聚在一個分支且支持率為77%，初步鑒定菌株NDW3為Serratiasp.。

2.2 溶磷菌的溶磷條件優(yōu)化

2.2.1 菌株溶磷的單因素試驗 為了明確不同的碳源、氮源及初始pH對兩菌株溶磷的影響，每個因素設(shè)置5個水平，測定了96 h內(nèi)不同單因素水平下各菌株的溶磷量。各種碳源條件下，菌株NDW1和NDW3的溶磷特點如圖3A和3B所示，2個菌株在以葡萄糖為碳源時，24 h溶磷量均達到最高，且72 h內(nèi)溶磷效果要明顯優(yōu)于其他4種碳源，2個菌株在24 h后的生長變得緩慢。菌株NDW1和NDW3在以尿素為氮源時溶磷量為0。在以牛肉膏和蛋白胨為氮源時溶磷量明顯高于硫酸銨和硝酸銨，蛋白胨優(yōu)于牛肉膏，且36 h后都能維持較高的溶磷量(圖3C，3D)。氮源對菌株生長量的影響較明顯，尿素和硫酸氨條件下生長都要好于其他氮源。在初始pH 5～9的培養(yǎng)基中，菌株NDW1都具有一定的溶磷量，NDW3在初始pH 9時溶磷量接近0，2株菌株在初始pH 6時溶磷量均較高，且36 h時達到最大值。5個初始pH對2株菌株生長影響不明顯。

圖1 菌株NDW1和NDW3溶磷效果

Fig.1 Phosphate solubilizing effects of bacteria NDW1 and NDW3

圖2 基于菌株NDW1、NDW3和其他溶磷菌16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

Fig.2 Phylogeny tree of 16S rDNA sequences from NDW1，NDW3 and other phosphoate solubilizing strains

柱狀圖為菌株溶磷量，折線圖為菌液光密度。

Fig.3 Effect of different carbon sources and nitrogen sources on phosphorus contents dissolved by bacteria strains and bacterial growth

柱狀圖為菌株溶磷量，折線圖為菌液光密度。

2.2.2 菌株溶磷的正交試驗 根據(jù)單因素水平試驗結(jié)果，分別選擇3個碳源(葡萄糖、麥芽糖、蔗糖)、氮源(牛肉膏、蛋白胨、硝酸銨)及初始pH(5、6、7)進行正交試驗。結(jié)果(表1)表明，在各因素之間，按照對溶磷水平的影響表現(xiàn)為碳源 > 初始pH > 氮源。正交試驗方差分析結(jié)果表明，碳源對NDW1菌株溶磷的影響達到顯著水平(F=39.56，P=0.025)，碳源對NDW3菌株溶磷的影響達到極顯著水平(F=105.88，P=0.01)，氮源和初始pH影響不顯著。菌株NDW1和NDW3溶磷的最佳組合均為葡萄糖、蛋白胨及初始pH 6，兩菌株24 h內(nèi)最高溶磷量分別為294.95和312.93 μg·mL-1。

表1 菌株溶磷的正交試驗結(jié)果1)
Tab.1 Results of the orthogonal test of phosphate solubilizing by bacteria strains

序號 NDW1序號NDW3碳源氮源pH溶磷量/(μg·mL-1)碳源氮源pH溶磷量/(μg·mL-1)1111281．601111278．122122294．952122312．933133207．353133245．0242122．0742125．4052234．5552234．55623139．34623137．6073137．7673136．9483215．34832119．05933232．50933230．50k1261．3097．14108．76k1278．6996．82111．59k215．32101．61109．84k215．85112．18116．28k315．2093．0673．22k318．83104．3785．50R246．108．5536．62R262．8415．3630．77最優(yōu)組合122最優(yōu)組合122主次順序碳源>pH>氮源主次順序碳源>pH>氮源

1)碳源1、2、3分別表示葡萄糖、麥芽糖、蔗糖；氮源1、2、3分別表示牛肉膏、蛋白胨、硝酸銨；pH 1、2、3分別表示pH為5、6、7。

2.3 溶磷菌產(chǎn)IAA的鑒定及對水稻的促生作用

2.3.1 溶磷菌產(chǎn)IAA能力 菌株NDW1和NDW3產(chǎn) IAA能力測定結(jié)果如表2所示：菌株NDW1和NDW3都有顯色反應(yīng)，不含色氨酸King培養(yǎng)液與加入100 mg·L-1色氨酸的King培養(yǎng)液相比較，后者比色液較前者顏色明顯，說明含有色氨酸的King培養(yǎng)液能明顯增加2株溶磷菌IAA的合成量；在培養(yǎng)10天后，NDW1和NDW3在不含有色氨酸 的King培養(yǎng)液中的IAA濃度分別為不含有色氨酸King培養(yǎng)液中IAA濃度的2.21和2.80倍。菌株NDW3的 IAA分泌量較高于菌株NDW1。

2.3.2 溶磷菌對苗期水稻的促生作用 為了進一步確定溶磷菌NDW1和NDW3在土壤中的溶磷能力及其對水稻的促生作用，利用沙培和土培的方法研究了菌株對苗期水稻的促生作用。從表3可以看出，添加溶磷菌NDW3后，2種種植條件下對水稻株高和最大葉長有顯著的促進作用，土培條件下根長、地上干質(zhì)量差異顯著，沙培條件無明顯的促進作用，地下干質(zhì)量及葉綠素含量與CK1表現(xiàn)出顯著差異。菌株NDW1在沙培與土培條件下盡管對水稻具有一定的促生能力，但與CK間差異不顯著，其促生作用弱于NDW3。

表2 溶磷菌產(chǎn)IAA的測定

Tab.2 Measurements of IAA production of two phosphorus solubilizing strains

King培養(yǎng)液菌株ρ定量(IAA)/(μg·mL-1)定性加色氨酸NDW111．37±0．36粉色NDW315．62±0．83粉色不加色氨酸NDW15．41±0．71淺粉色NDW35．60±0．24淺粉色

2.4 溶磷菌對根際土壤速效磷含量及水稻植株全磷含量的影響

添加2種溶磷菌后對水稻根際土壤速效磷含量及苗期植株全磷含量的測定結(jié)果如圖5所示。沙培和土培條件下，添加溶磷菌可明顯促進根際土壤速效磷含量的增加，處理與CK間差異顯著。沙培條件下，添加溶磷菌可顯著促進水稻植株全磷含量的增加。土培條件下，添加溶磷菌NDW3，可顯著促進水稻植株全磷含量的增加；添加NDW1植株全磷含量增加效果不明顯。

表3 不同處理對水稻幼苗性狀的影響1)
Tab.3 Effects of different treatments on traits of rice seedlings

種植條件處理株高/cm根長/cm最大葉長/cm地上干質(zhì)量/mg地下干質(zhì)量/mgw(葉綠素)/(μg·g-1)沙培CK131．67±4．58b9．50±0．10b21．57±0．72b29．00±7．21ab8．33±0．58b81．64±7．43bCK232．03±0．80b9．46±0．23ab19．27±0．83c27．67±4．04b8．67±1．53ab79．27±0．17abNDW134．20±1．91ab9．73±0．11ab20．93±1．00b30．67±3．79ab9．67±1．15ab88．90±9．53abNDW337．53±1．00a9．83±0．25a23．47±0．58a39．00±5．57a11．00±2．00a103．57±9．37a土培CK131．20±1．11b9．73±0．31b19．73±0．23c44．67±4．04b17．67±5．86b37．82±2．36bCK231．80±0．87b9．83±0．25b21．40±1．60bc47．67±2．08b18．33±3．51ab54．82±0．39aNDW132．93±0．42ab10．03±0．21ab22．47±0．31ab49．33±2．08b26．67±5．50ab56．67±0．18aNDW334．87±1．70a10．37±0．20a23．93±1．92a58．00±5．29a18．00±3．00a59．72±2．81a

1) 沙培條件下，CK1：加全磷營養(yǎng)液，CK2：加Ca3(PO4)2和無磷營養(yǎng)液；土培條件下，CK1:不加Ca3(PO4)2，CK2：加Ca3(PO4)2; 2種種植條件下，NDW1和NDW3處理分別在CK2處理的基礎(chǔ)上接種相應(yīng)菌株。相同種植條件同列數(shù)據(jù)后相同小寫字母表示不同處理間差異不顯著(P>0.05, Duncan’s法)。

沙培條件下，CK1：加全磷營養(yǎng)液，CK2：加Ca3(PO4)2和無磷營養(yǎng)液；土培條件下，CK1:不加Ca3(PO4)2，CK2：加Ca3(PO4)2; 2種種植條件下，NDW1和NDW3處理分別在CK2處理的基礎(chǔ)上接種相應(yīng)菌株。相同種植條件不同柱子上相同小寫字母表示不同處理間差異不顯著(P>0.05,Duncan’s法)。

圖5 不同處理對水稻根際土壤速效磷含量及幼苗全磷含量的影響
Fig.5 Effects of different treatments on soil available phosphorus contents and total phosphorus contents of rice seedlings

3 討論與結(jié)論

溶磷微生物自1903年被發(fā)現(xiàn)和報道以來，這類微生物的研究及其在農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用越來越廣泛。碳源對溶磷細菌的生存能力以及溶磷能力有不同的影響[23]，而土地利用方式可顯著影響土壤有機碳與無機碳儲量[24]。本研究從吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻試驗田采集的水稻根際土壤中分離到2株溶磷能力較好的細菌菌株NDW1和 NDW3，經(jīng)16S rDNA鑒定，分別為腸桿菌Enterobactersp.和沙雷氏菌Serratiasp.。正交試驗表明：菌株NDW1和NDW3在葡萄糖、蛋白胨及初始pH 6的NBRIP培養(yǎng)基中溶磷量能力最佳，24 h內(nèi)溶磷量可分別達到294.95和312.93 μg·mL-1，明顯高于戴沈艷等[25]報道的溶磷菌的溶磷量,略低于菌株 C5-A對磷礦粉的溶磷量[26]。

溶磷菌大多具有促進作物生長、提高作物產(chǎn)量、抗病的能力[27]。將2株溶磷微生物施入冬小麥土壤中，植物磷含量、光合速率、穗粒數(shù)及產(chǎn)量增加，增產(chǎn)幅度分別為14.2%和8.7%[28]。胡曉峰等[29]報道菌株 P1 不僅對 Ca3(PO4)2、磷礦粉和卵磷脂有較好的溶解效果，對一些土傳病害病原菌也有抑制作用。多數(shù)研究者認為溶磷菌對植物的促生作用是由于其釋放土壤中難溶性或不溶性磷，有效提高土壤供磷水平及磷肥利用率的原因，也有人認為有的溶磷微生物可分泌生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，促進根系生長[30]。本研究發(fā)現(xiàn)溶磷菌NDW1和 NDW3不僅具有分泌IAA的能力，在沙培和土培條件下對水稻都有一定的促生作用，尤其NDW3對水稻株高、根長、最大葉長及地上干質(zhì)量的增加有相對明顯的促進作用，且添加至土壤中有利于土壤速效磷含量及苗期水稻全磷含量的增加。鄭文波等[31]和譙天敏等[32]的研究均表明同時接種不同的溶磷菌菌株均可促進植株生長，與對照相比植株株高、干質(zhì)量和干鮮比均有較大幅度增加，葉綠素和植株全磷也有顯著增加，這與本文的研究結(jié)果大體一致。沙培條件下，添加溶磷菌NDW1和 NDW3均可明顯促進水稻植株全磷含量的增加；而土培條件下只有溶磷菌NDW3對水稻植株全磷含量具有增加效應(yīng)。這可能是因為沙培條件下只有溶磷菌NDW1或 NDW3一種菌落，環(huán)境條件對它們的溶磷能力影響較小。而土培時，土壤的理化性質(zhì)及微生物群落對兩菌株的影響不同，菌株NDW3受影響較小，溶磷能力仍表現(xiàn)出一定優(yōu)勢。

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【責(zé)任編輯 莊 延】

Isolation and identification of phosphate solubilizing bacteria from rice rhizosphere soil, and promoting effect on rice plant growth

WU Zhihai1?, SUN Hemei2?, YANG Meiying2, LU Dongxue2, YUE Shengtian2, FU Li2

(1 Faculty of Agronomy, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2 College of Life Science, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

【Objective】 To determine the ability of phosphate dissolving of phosphate solubilizing bacteria(PSB)in rice rhizosphere, and study the effect of PSB on soluble phosphorus contents in rice plants and rhizosphere soil. 【Method】 Two bacteria strains NDW1 and NDW3 with strong ability of dissolving Ca3(PO4)2were isolated from rice rhizosphere soil based on the halo zone formation on media due to phosphate solubilization, and identified by 16S rDNA method. Phosphorus dissolving conditions of two strains were optimized by orthogonal test with NBRIP as the basic medium. The production of indole-3-acetic acid(IAA) were determined. The effects of NDW1 and NDW3 on promotion of rice growth, the soil available phosphorus contents and plant total phosphorus contents were studied. 【Result】NDW1 and NDW3 were identified asEnterobactersp. andSerratiasp.. The best combination of carbon, nitrogen source and pH for phosphate solubilition by NDW1 and NDW3 were both the combination of glucose, peptone and pH 6. The highest phosphorus contents dissolved by NDW1 and NDW3 were 294.95 and 312.93 μg·mL-1after 24 h incubation, respectively. Both PSB could produce IAA. NDW3 significantly increased the shoot height, root length, maximum leaf length and above-ground dry mass of rice plant in both soil culture and sand culture. NDW3 also significantly increased the contents of soil available phosphorus and rice total phosphorus under both culture conditions.【Conclusion】Enterobactersp. NDW1 andSerratiasp. NDW3 isolated from rice rhizosphere soil have strong ability of phosphate dissolving. The growth promoting effect of NDW3 for rice plant is better than that of NDW1.

soil phosphate solubilizing bacteria; IAA; growth promoting effect; phosphorus content; rice; rhizosphere

2016- 03- 14優(yōu)先出版時間：2016-12-28

武志海(1975—),男，副教授，博士，E-mail: wuzhihai1116@163.com；孫合美(1988—),女，碩士，E-mail: 602132215@qq.com, ?表示對本文貢獻相同; 通信作者：楊美英(1974—)，女，副教授，博士，E-mail: jlaumeiying@163.com

國家自然科學(xué)基金(31201687)

S565.101

A

1001- 411X(2017)01- 0050- 08

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武志海, 孫合美, 楊美英，等.水稻根際土壤溶磷菌的分離、鑒定及對水稻的促生作用[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2017,38(1):50- 57.