洪湖碘泡蟲PCR檢測方法的建立與初步應(yīng)用

李 丹，柳 陽，翟艷花，顧澤茂

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢 430070；2.淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430070；3.農(nóng)業(yè)部淡水生物繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430070)

洪湖碘泡蟲PCR檢測方法的建立與初步應(yīng)用

李 丹1, 2, 3，柳 陽1, 2, 3，翟艷花1, 2, 3，顧澤茂1, 2, 3

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢 430070；2.淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430070；3.農(nóng)業(yè)部淡水生物繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430070)

為建立一種靈敏、特異的快速檢測異育銀鯽寄生洪湖碘泡蟲(Myxobolushonghuensis)的方法，本研究根據(jù)洪湖碘泡蟲ITS-5.8S rDNA基因序列篩選出一對特異性引物MhF/R，建立PCR檢測方法，對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，并通過特異性試驗(yàn)、靈敏性試驗(yàn)與臨床檢測驗(yàn)證其可行性。結(jié)果顯示，建立的PCR檢測方法能特異性擴(kuò)增洪湖碘泡蟲相應(yīng)的基因片段，長度為479 bp，而對試驗(yàn)中其他9種粘孢子蟲的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性；最低能檢測0.1 pg的蟲體基因組DNA。通過臨床樣品檢測，PCR方法比顯微鏡檢測的檢出率提高了19.5%。結(jié)果表明，該P(yáng)CR方法特異、靈敏，適用于洪湖碘泡蟲的快速檢測。

洪湖碘泡蟲(Myxobolushonghuensis)；ITS-5.8S rDNA；PCR檢測；顯微鏡檢測

異育銀鯽(CarassiusauratusgibelioBloch)自上世紀(jì)80年代被成功篩選培育，具有生長快、易飼養(yǎng)、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，是我國重要的鯽魚養(yǎng)殖品種。隨著異育銀鯽養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，病害問題日趨嚴(yán)重，尤其是粘孢子蟲病，嚴(yán)重威脅著異育銀鯽的苗種培育和成魚養(yǎng)殖，已成為制約異育銀鯽產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的瓶頸因素[1-2]。目前，超過50種粘孢子蟲種類寄生于異育銀鯽[3-7]，危害最嚴(yán)重的為異育銀鯽“喉孢子蟲病”的病原體—洪湖碘泡蟲(Myxobolushonghuensis)[5]?；疾◆~體主要表現(xiàn)為喉部紅腫發(fā)炎，不食而消瘦，游動(dòng)遲緩，眼球外凸，鰓絲腫脹，鰓蓋外鼓而無法閉合，易缺氧等。洪湖碘泡蟲病的流行季節(jié)為每年5-10月，5-7月為病害高發(fā)期，主要流行于湖北、江蘇、沈陽等多個(gè)地區(qū)，感染率可達(dá)60%，死亡率最高可達(dá)100%。目前洪湖碘泡蟲的檢測主要以顯微鏡下可見成熟孢子、肉眼可見孢囊為依據(jù)，而一旦粘孢子蟲在魚體內(nèi)形成成熟的孢子或孢囊，藥物很難滲入成熟孢子堅(jiān)硬的幾丁質(zhì)外殼。因此，有必要建立一種簡單快速的早期檢測方法，在其營養(yǎng)體階段進(jìn)行藥物防治，為診斷和預(yù)防洪湖碘泡蟲病提供技術(shù)支持。

目前，洪湖碘泡蟲的檢測方法主要有三種：(1)以顯微鏡觀察成熟孢子為基礎(chǔ)的形態(tài)學(xué)檢測方法，雖然操作簡便，但存在檢測滯后、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、效率低、易于漏檢等問題[8]；(2)以抗原與抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的免疫學(xué)檢測方法，雖然具有靈敏性高、能進(jìn)行早期檢測的特點(diǎn)，但由于粘孢子蟲生活史中存在期、屬特異性抗原以及共同抗原，交叉反應(yīng)嚴(yán)重，增加了種特異性檢測的難度[9-12]；(3)以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)檢測方法具有較高的特異性與靈敏性，運(yùn)用最為廣泛[13-16]。賈洛[17]以洪湖碘泡蟲為抗原制備的抗體能與多種粘孢子蟲發(fā)生交叉反應(yīng)；顧偉[18]根據(jù)洪湖碘泡蟲的18S rDNA基因建立了巢式PCR方法，靈敏性較高，然而該方法的特異性還有待檢驗(yàn)。因此，亟需建立一種快速準(zhǔn)確、靈敏性高、特異性強(qiáng)的檢測方法。核糖體DNA(rDNA)中的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS(包括ITS1與ITS2)屬于非編碼序列，所受的選擇壓力較小，進(jìn)化速度快，具有可變性[19]，常與保守度較高的編碼序列5.8S rDNA共同作為靶標(biāo)應(yīng)用于相似物種的區(qū)別與鑒定中。本研究以洪湖碘泡蟲的ITS-5.8S rDNA為靶基因篩選了一對特異性引物，建立了針對洪湖碘泡蟲的特異性檢測方法，并初步應(yīng)用于臨床檢測。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與保存

本試驗(yàn)中使用的洪湖碘泡蟲(M.honghuensis)、吳李碘泡蟲(M.wulii)、丑陋圓形碘泡蟲(M.turpisrotundus)、倪李碘泡蟲(M.nielii)、武漢單極蟲(Thelohanelluswuhanensis)、龜殼單極蟲(T.testudines)、多涅茨尾孢蟲(Henneguyadoneci)、吉陶單極蟲(T.kitauei)、山東碘泡蟲(M.shantungensis)、野鯉碘泡蟲(M.koi)等粘孢子蟲樣本均由本實(shí)驗(yàn)室自行采集與保存。2015年7月從湖北省武漢市東西湖區(qū)養(yǎng)殖池塘隨機(jī)采集36尾異育銀鯽，體長為3.0～12.4 cm，實(shí)驗(yàn)魚用撒網(wǎng)捕撈，將魚體放入充氧袋運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，暫養(yǎng)于水族箱中。

1.2 主要試劑

Marker DL2000、Loading Buffer 與PCR體系試劑(10×PCR Buffer(Mg2+free)、Mg2+、dNTP Mixture、Taq DNA聚合酶)均購于寶生物工程有限公司；動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；DNA回收試劑盒購自O(shè)mega公司；TA克隆試劑盒(載體pMD19-T)購自寶生物工程有限公司。

1.3 基因組DNA的提取

蟲體基因組DNA的提?。簩?shí)驗(yàn)室保存于乙醇中的帶有粘孢子蟲孢囊樣品取出，剪取小塊置于干凈的載玻片中，去除多余的宿主組織，室溫放置15-20 min或放入烘箱3-5 min，使乙醇揮發(fā)。將組織樣品或孢囊剪碎移入EP管中，充分研磨，再用蒸餾水沖洗、離心，反復(fù)幾次得到均勻組織或孢囊溶液備用。將待檢測的樣品移入500 μL細(xì)胞裂解液中(100 mol/L氯化鈉，10 mol/L Tris，10 mol/L EDTA，0.2% SDS，1 mg·mL-1蛋白酶K)，55 ℃水浴過夜，使用通用型動(dòng)物組織DNA提取試劑盒提取蟲體的基因組DNA，具體步驟按照試劑盒的說明書進(jìn)行，提取后的DNA置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

檢測樣品基因組DNA的提?。悍謩e剪取每尾異育銀鯽的皮膚、鰓、咽及肝胰臟的部分組織，共約50 mg，混合在一起，置于研缽中，剪碎并加入液氮充分研磨，然后采用動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒提取樣品的總DNA，提取后的DNA置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物篩選

通過比對與分析各粘孢子蟲的ITS1-5.8S-ITS2基因序列，利用Primer 5.0軟件根據(jù)洪湖碘泡蟲的ITS1與ITS2基因的差異序列分別設(shè)計(jì)上游與下游引物，其中，上游引物MhF：5’-TGATCATTGTGTGTTCATCAAGTC-3’，下游引物MhR：5’-TCGTAAAAATGACCTCTACTTTATAC-3’，擴(kuò)增目的片段長度為479 bp。引物由武漢奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.5 PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

1.5.1 退火溫度的優(yōu)化

以洪湖碘泡蟲蟲體基因組DNA為模板進(jìn)行溫度梯度試驗(yàn)，設(shè)定溫度梯度為：55 ℃、56 ℃、57 ℃、58 ℃、59 ℃、60 ℃，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確定引物的最佳退火溫度。

1.5.2 Mg2+濃度的優(yōu)化

以洪湖碘泡蟲蟲體基因組DNA為模板進(jìn)行Mg2+濃度梯度試驗(yàn)，設(shè)定Mg2+終濃度為：0.5 mol/L、1.0 mol/L、1.5 mol/L、2.0 mol/L、2.5 mol/L、3.0 mol/L、3.5 mol/L、4.0 mol/L，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確定Mg2+的最佳濃度。

1.5.3 循環(huán)數(shù)的優(yōu)化

以洪湖碘泡蟲蟲體基因組DNA為模板進(jìn)行PCR循環(huán)數(shù)梯度試驗(yàn)，設(shè)定PCR循環(huán)數(shù)為：25循環(huán)、30循環(huán)、35循環(huán)、40循環(huán)，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確定反應(yīng)最佳循環(huán)數(shù)。

1.6 特異性試驗(yàn)

根據(jù)優(yōu)化后的反應(yīng)體系與條件，以洪湖碘泡蟲、吳李碘泡蟲、丑陋圓形碘泡蟲、倪李碘泡蟲、武漢單極蟲、龜殼單極蟲、多涅茨尾孢蟲、吉陶單極蟲、山東碘泡蟲、野鯉碘泡蟲及健康異育銀鯽的DNA作為模板，同時(shí)以滅菌ddH2O為模板作為空白對照進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測該方法的特異性。

1.7 靈敏性試驗(yàn)

將洪湖碘泡蟲的蟲體DNA經(jīng)10倍倍比稀釋，分別得到8個(gè)不同濃度的DNA(10、1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6ng/μL)，每個(gè)反應(yīng)同時(shí)加入100 ng宿主DNA，以稀釋后的不同濃度的粘孢子蟲DNA與宿主DNA的混合物作為模板，以滅菌ddH2O為模板作為空白對照，用篩選的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測該方法的靈敏性。

1.8 臨床樣品檢測

利用顯微鏡鏡檢法與PCR方法同時(shí)對36份樣品進(jìn)行洪湖碘泡蟲的檢測。顯微鏡檢測：刮取魚體皮膚粘液，提取魚體鰓、咽、肝臟部分組織進(jìn)行壓片觀察，計(jì)算洪湖碘泡蟲成熟孢子的檢出率。PCR檢測：按照優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系與條件對樣品進(jìn)行PCR檢測，根據(jù)目的條帶大小判定結(jié)果；擴(kuò)增之后，隨機(jī)抽取三個(gè)陽性樣品，切膠回收，純化PCR產(chǎn)物，參照pMD19-T克隆試劑盒的操作步驟對目的DNA片段進(jìn)行連接與轉(zhuǎn)化。經(jīng)過PCR篩選得到陽性克隆，將陽性克隆菌液送往武漢奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行測序。測定的序列經(jīng)人工校對、拼接并確認(rèn)無誤之后，在NCBI網(wǎng)站中進(jìn)行序列比對，進(jìn)一步驗(yàn)證檢測結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR反應(yīng)優(yōu)化結(jié)果

PCR反應(yīng)的優(yōu)化結(jié)果見圖1。退火溫度在55～60 ℃范圍內(nèi)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶都比較亮，無明顯差異，而引物的退火溫度為57 ℃，因此選擇57 ℃為最佳退火溫度(圖1)。Mg2+濃度在1.0～2.5 mol/L范圍內(nèi)，擴(kuò)增條帶較亮，綜合考慮擴(kuò)增效果與試劑成本，最終選擇1.5 mol/L為最佳Mg2+濃度(圖2)。循環(huán)數(shù)為30、35、40時(shí)，擴(kuò)增條帶清晰明亮，綜合考慮擴(kuò)增效果與試驗(yàn)時(shí)間，最終選擇35次作為最佳循環(huán)數(shù)(圖3)。綜上，優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系為：DNA擴(kuò)增模板50 ng，10×PCR Buffer 2.5 μL，Mg2+1.5 mol/L，dNTPs 1.0 mol/L，TaqDNA聚合酶1 U，Mh F/R各200 nM，滅菌ddH2O補(bǔ)足至25 μL；反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

圖1 退火溫度優(yōu)化Fig.1 Optimization of annealing temperatureM: DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1～6: 退火溫度依次為55 ℃, 56 ℃, 57 ℃, 58 ℃, 59 ℃, 60 ℃; 7: 空白對照.

圖2 鎂離子濃度優(yōu)化Fig.2 Optimization of MgCl2 concentrationM: DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1～8: 鎂離子濃度依次為0.5 mol/L,1.0 mol/L, 1.5 mol/L, 2.0 mol/L, 2.5 mol/L, 3.0 mol/L, 3.5 mol/L, 4.0 mol/L; 9: 空白對照.

圖3 循環(huán)數(shù)優(yōu)化Fig.3 Optimization of cycle numberM:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1～5:循環(huán)數(shù)依次為20, 25, 30, 35, 40次;6:空白對照.

2.2 特異性試驗(yàn)

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，只有以洪湖碘泡蟲DNA為模板才能擴(kuò)增出單一的目的條帶，而其他的粘孢子蟲均無條帶擴(kuò)增(圖4)，說明建立的洪湖碘泡蟲PCR檢測方法特異性良好。

圖4 PCR特異性試驗(yàn)Fig.4 The specificity test of PCRM: DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1: 洪湖碘泡蟲;2: 吳李碘泡蟲;3: 丑陋圓形碘泡蟲;4: 倪李碘泡蟲;5: 武漢單極蟲;6: 龜殼單極蟲;7: 多涅茨尾孢蟲;8: 吉陶單極蟲;9: 山東碘泡蟲;10: 野李碘泡蟲;11: 健康鯽魚;12: 空白對照.

2.3 試驗(yàn)的靈敏性

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在宿主DNA干擾的情況下，洪湖碘泡蟲模板濃度為10-4ng(0.1 pg)時(shí)仍能擴(kuò)增出條帶，因此，確定建立的PCR方法對洪湖碘泡蟲最低檢測限為0.1 pg，靈敏性試驗(yàn)結(jié)果見圖5。

圖5 PCR靈敏性試驗(yàn)Fig.5 The sensitivity test of PCRM: DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1～8分別為10, 1, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 ng洪湖碘泡蟲DNA + 100 ng宿主DNA; 9: 空白對照.

2.4 臨床初步應(yīng)用

利用顯微鏡鏡檢法與PCR方法同時(shí)對采集的36份樣品進(jìn)行洪湖碘泡蟲的臨床檢測，結(jié)果顯示顯微鏡鏡檢法檢測洪湖碘泡蟲成熟孢子(圖6)的陽性檢出率為22.2 %(8/36)，PCR方法檢測洪湖碘泡蟲的陽性檢出率為41.7%(15/36)，比鏡檢法的高19.5個(gè)百分點(diǎn)。隨機(jī)抽取的三個(gè)陽性擴(kuò)增產(chǎn)物與洪湖碘泡蟲的ITS-5.8S rDNA基因序列的相似度為99.6%～99.9%，表明建立的PCR檢測方法實(shí)用性強(qiáng)，可用于異育銀鯽寄生洪湖碘泡蟲的臨床檢測。

圖6 洪湖碘泡蟲成熟孢子, 標(biāo)尺=10 μm.Fig.6 Photomicrograph of mature spores of M. honghuensis, scale bar =10 μm.

3 討論

在粘孢子蟲的早期分子檢測中，18S rDNA是運(yùn)用最為廣泛的分子標(biāo)記[20-23]，然而，18S rDNA序列比較保守，在同屬近緣種類間相似度較高，難以區(qū)分。其中，洪湖碘泡蟲與吳李碘泡蟲的18S rDNA相似度就高達(dá)93%，差異堿基分布分散，難以根據(jù)其18S rDNA基因進(jìn)行區(qū)別鑒定，因此迫切需要尋找其他合適的分子靶標(biāo)。ITS是介于核糖體DNA上18S、5.8S、28S 基因之間的一段高度可變區(qū)域，具有種間變異與種內(nèi)穩(wěn)定的特點(diǎn)[24]，已作為一種有效的分子標(biāo)記被廣泛運(yùn)用于寄生蟲近緣物種的分子檢測中，但在粘孢子蟲檢測方面運(yùn)用較少，目前只有Woo 等[25]利用ITS基因?qū)Ω腥觉幠c道的單極蟲T.kitauei與T.hovorkai進(jìn)行了有效的區(qū)別與鑒定。通過序列比對與分析，發(fā)現(xiàn)洪湖碘泡蟲的ITS包含較多的差異序列，因此，本研究選擇洪湖碘泡蟲的ITS為靶基因建立了PCR檢測方法。

在建立PCR檢測方法的過程中，引物的篩選至關(guān)重要。特異性試驗(yàn)中只有洪湖碘泡蟲擴(kuò)增出單一目的條帶，而其他粘孢子蟲種類的擴(kuò)增結(jié)果呈陰性，證明篩選的引物特異性良好。靈敏性試驗(yàn)中，在宿主DNA的干擾下，檢測靈敏度仍達(dá)到了pg級(jí)檢測水平，說明該方法的靈敏性較高。一般PCR方法的靈敏性試驗(yàn)僅僅用寄生蟲的蟲體基因組DNA為模板檢測，而忽略了宿主DNA的干擾，是一種分析靈敏性試驗(yàn)，而本研究在每個(gè)反應(yīng)中加入一定量的宿主DNA，結(jié)果更接近實(shí)際的診斷靈敏性。許多研究表明，PCR檢測方法比傳統(tǒng)顯微鏡鏡檢方法的靈敏性更高[13, 14]，本研究以這兩種方法對實(shí)際樣品進(jìn)行檢測與比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCR方法的陽性檢出率比鏡檢高19.5百分點(diǎn)，表明PCR的靈敏性更高。由于粘孢子蟲的營養(yǎng)體形態(tài)多種多樣，且易與魚體組織結(jié)構(gòu)相混淆[11]，因此本研究以觀察到成熟孢子為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算檢出率，但檢測結(jié)果會(huì)低于實(shí)際的感染率。在顯微鏡檢測中，有1個(gè)樣品的檢測結(jié)果為陽性，能觀察到成熟的孢子，但數(shù)量較少，而對應(yīng)的PCR檢測呈陰性，類似的現(xiàn)象在國外粘孢子蟲的檢測中也有過相關(guān)的報(bào)道[22]。另外，三個(gè)隨機(jī)樣品的測序結(jié)果表明該方法的準(zhǔn)確性高，適用于洪湖碘泡蟲的臨床診斷。

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(責(zé)任編輯：張瀟峮)

Development and preliminary application of PCR method for the detection of Myxobolus honghuensis (Myxosporea: Bivalvulida)

LI Dan1,2,3, LIU Yang1,2,3, ZHAI Yan-hua1,2,3, GU Ze-mao1,2,3

( 1.DepartmentofAquaticAnimalMedicine,CollegeofFisheries,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China;2.FreshwaterAquacultureCollaborativeInnovationCenterofHubeiProvince,Wuhan430070,China; 3.KeyLabofFreshwaterAnimalBreeding,MinistryofAgriculture,Wuhan430070,China)

To establish a sensitive, specific and rapid method for detection ofMyxobolushonghuensisinfecting allogynogenetic gibel carpCarassiusauratusgibelio(Bloch), a single PCR method was developed with primers MhF/R targeting on its ITS-5.8S rDNA gene. After optimizating the reaction condition and system, a series of experiments on specificity and sensitivity were conducted. Additionally, 36 field samples were tested by the established PCR and microscopic examination. The results showed that the developed PCR method was specific to amplify a 479 bp fragment using genomic DNA fromM.honghuensiswith a detection limit of 0.1 pg, and no cross-reactions with other 9 myxosporean species tested. The clinical detection rate was 19.5% higher than that of microscopic examination. The results suggest that the present PCR method is an efficient approach for molecular detection ofM.honghuensisbecause of its specificity and sensitivity.

Myxobolushonghuensis; ITS-5.8S rDNA; PCR detection; microscopic examination

2016-05-22；

2016-09-21

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31572233)

李 丹(1991- )，女，碩士，專業(yè)方向?yàn)樗鷦?dòng)物醫(yī)學(xué)。E-mail: liyidan1991@163.com

顧澤茂。E-mail: guzemao@mail.hzau.edu.cn

S917

A

1000-6907-(2017)01-0012-05