白術(shù)醇提物對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠足跖腫脹度和炎性細胞因子的影響

趙桂芝徐攀浦錦寶梁衛(wèi)青胡軼娟魏克民

1.浙江省中醫(yī)藥研究院 杭州 310007 2.浙江省中藥新藥研發(fā)重點實驗室

白術(shù)醇提物對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠足跖腫脹度和炎性細胞因子的影響

趙桂芝1,2徐攀1,2浦錦寶1,2梁衛(wèi)青1,2胡軼娟1,2魏克民1,2

1.浙江省中醫(yī)藥研究院 杭州 310007 2.浙江省中藥新藥研發(fā)重點實驗室

[目的]研究白術(shù)醇提物對佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis,AA)大鼠足跖腫脹度和炎性細胞因子的影響，并探討可能的作用機制。[方法]將60 只SD雌性大鼠隨機分成6組，即空白組、模型組、陽性藥組（阿司匹林）、白術(shù)醇提物低、中、高劑量組(0.25、0.5、1g/(kg·d))。除空白組外，其余各組用弗氏完全佐劑誘導建立大鼠AA模型，測量造模前后不同時間點的足跖腫脹度，ELISA法檢測大鼠血清和炎性組織中的TNF-α、IL-1β和PGE2含量。[結(jié)果]與空白組相比，模型組大鼠的足跖腫脹度、血清和炎性組織中的炎癥因子TNF-α、IL-1β和PGE2含量顯著增加。與模型組相比，白術(shù)醇提物能劑量依賴性抑制AA大鼠的原發(fā)性足跖腫脹度，對繼發(fā)性的足跖腫脹也有一定程度的抑制，能明顯抑制AA大鼠血清和炎性組織中的TNF-α、IL-1β和PGE2的含量。[結(jié)論]白術(shù)醇提物對于佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠具有較好的保護作用，并且隨著劑量的增大，保護作用增強，抑制炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β和PGE2合成和釋放可能是其主要的作用機制之一。

白術(shù)；醇提物；AA大鼠；足跖腫脹度；炎性細胞因子；劑量依賴

白術(shù)為菊科蒼術(shù)屬植物白術(shù)Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根莖，有健脾益氣，燥濕利水，止汗，安胎的功能[1]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，現(xiàn)收載于中國藥典，用于治療脾虛食少，腹脹泄瀉，痰飲眩悸，自汗，胎動不安等，現(xiàn)代臨床多用于治療脾虛證、自汗盜汗、便秘等[2-3]。近年來對白術(shù)的化學成分研究已經(jīng)比較清楚，主要包括揮發(fā)性成分、內(nèi)酯類、苷類、多糖類成分以及氨基酸等[4-5]。白術(shù)的藥理作用頗多，無論是單味藥還是其復方制劑，均發(fā)揮了治療疾病的作用。藥理活性研究表明白術(shù)具有抗氧化衰老、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、利尿、抗菌消炎、降血糖等功效[6-9]，對消化道和子宮平滑肌也有一定作用[10-11]。

筆者前期對白術(shù)醇提物進行了一系列的動物實驗，如熱板法、醋酸扭體法、二甲苯致小鼠耳廓腫脹實驗和角叉菜膠致大鼠足跖腫脹實驗來研究白術(shù)醇提物的抗炎鎮(zhèn)痛活性，結(jié)果表明白術(shù)醇提物具有一定抗炎鎮(zhèn)痛作用。這也與文獻中白術(shù)能用于治療類風濕關(guān)節(jié)炎的記載相一致[12]。而佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis，AA)大鼠模型是現(xiàn)代研究類風濕關(guān)節(jié)炎、篩選抗炎免疫藥物的理想模型[13]，制作方法簡單，特異性高，假陽性率低，成功率高，結(jié)果可靠，而且從放射學角度觀察其動物關(guān)節(jié)炎病變更為明顯。因此，本文通過白術(shù)醇提物對AA大鼠足跖腫脹度和炎性細胞因子的影響，來驗證其抗炎作用，并探討可能的作用機制，從而為其進一步的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雌性SD大鼠，體質(zhì)量180～220g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，使用許可證號：SYZK（浙）2014-0003。

1.1.2 藥品與試劑 白術(shù)購于浙江省磐安藥材市場，經(jīng)浙江省中醫(yī)藥研究院浦錦寶研究員鑒定為菊科植物白術(shù)Atractylodes macrocephala koidz.的根莖，符合《中國藥典》2015版一部的相關(guān)規(guī)定。無水乙醇（金華市先科化工試劑廠，批號：20110104）；阿司匹林（拜爾藥業(yè)，批號：20140524）；弗氏完全佐劑（法國MP公司，批號：06858）；TNF-α、IL-1β、PGE2試劑盒（上海酶聯(lián)試劑公司，批號：201401128，20141205，20141203）。

1.1.3 儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BUCHI R-210，瑞士）；低溫高速離心機（5810，德國Eppendorf）；AL 104-電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；數(shù)顯測厚規(guī)（上海川陸量具有限公司，精度0.01mm）；其它還有注射器、大鼠灌胃針頭、移液槍、眼科剪、鑷子等。

1.2 方法

1.2.1 白術(shù)醇提物的制備 稱取白術(shù)藥材500g，加入10倍量75%乙醇，100℃水浴回流提取2次，每次3h。合并提取液，減壓濃縮，離心除去不溶物質(zhì)，加至D-101大孔樹脂柱上端，靜置吸附1h。先以6倍柱體積純水洗脫，再以 5倍柱體積70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液，濃縮，真空干燥，得白術(shù)醇提取物樣品23.81g（白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的含量分別是202.14mg·g-1、86.40mg·g-1、312.30mg·g-1），動物實驗時用5‰羥甲基纖維素鈉(carmellose sodium，CMC-Na)混懸均勻，配成實驗所需濃度的溶液。

1.2.2 動物模型的建立、分組及給藥 取180～220g SD大鼠，適應(yīng)性馴養(yǎng)3d后，隨機分為6組，空白組、模型組、陽性藥組、白術(shù)醇提物低劑量組、白術(shù)醇提物中劑量組、白術(shù)醇提物高劑量組，每組10只。除空白組外，其余組大鼠參照文獻方法[13]于左后足常規(guī)消毒后，足跖墊部向踝關(guān)節(jié)方向注入弗氏完全佐劑(complete freund`s adjuvant,CFA)0.02mL制作AA大鼠模型模型。造模第2d起，白術(shù)醇提物低劑量組、白術(shù)醇提物中劑量組、白術(shù)醇提物高劑量組分別給予0.25、0.5、1g/(kg·d)白術(shù)醇提物灌胃（亦即60kg體重成人服10g/d的5倍，10倍、20倍），陽性藥組給予阿司匹林30mg/(kg·d)灌胃，模型組、空白組給予等體積5‰CMC-Na灌胃，各組連續(xù)給藥20d。

1.2.3 足跖腫脹度的測量和炎性細胞因子的檢測

采用厚度計分別于造模當天以及第2、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20d中灌胃給藥后2h測量左后足跖厚度，再于第10、12、14、16、18、20d灌胃給藥后2h測量右后足跖厚度。并于第20d給藥2h后，水合氯醛溶液麻醉大鼠，腹主動脈取血4mL左右，3500r/ min離心10min，取上層血清，儲存于-80℃冰箱中備用。同時取腫脹關(guān)節(jié)部位0.3g左右，分析天平精確稱量后，浸泡于3mL生理鹽水中，4℃冰箱中放置過夜，3500r/min離心10min，取上清組織浸泡液，儲存于-80℃冰箱中備用。用ELISA法測定血清和腫脹關(guān)節(jié)組織液中腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）、白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的含量，具體測定方法均按試劑盒說明書進行。

1.2.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件，計量數(shù)據(jù)以(±s)表示；單因素設(shè)計，多組間計量資料組間比較采用單因素方差分析，方差齊性用LSD檢驗，方差不齊用Dunnet T3檢驗。其中足跖腫脹實驗采用重復測量設(shè)計，若滿足球形檢驗結(jié)果，采用一元方差分析比較，若不滿足，通過Greenhouse-Geisser矯正，再采用多元方差分析進行比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 對AA大鼠足跖腫脹度的影響 白術(shù)醇提物對完全弗氏佐劑誘導的大鼠足跖腫脹的影響結(jié)果見圖1。空白組大鼠在注射生理鹽水后出現(xiàn)輕度紅腫，至次日就明顯好轉(zhuǎn)。模型組大鼠左后足跖注射CFA后即在注射部位出現(xiàn)早期的炎癥反應(yīng)，與空白組的足跖厚度比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，說明CFA能很好地誘導大鼠足腫脹。致炎后左后足跖明顯紅腫，行走不方便，2d后達到高峰，此后癥狀逐漸減輕；注射后的第10d左右出現(xiàn)右后足跖腫脹等繼發(fā)病變，至12d達到高峰，關(guān)節(jié)活動受限，部分大鼠耳和尾部出現(xiàn)紅斑，此后腫脹逐漸減輕直到觀察結(jié)束。

對AA大鼠左后足的足跖厚度進行統(tǒng)計分析，根據(jù)球形度檢驗結(jié)果顯示P＜0.01，不滿足球形假設(shè)，需要通過Greenhouse-Geisser校正，校正后方差分析結(jié)果表明時間（time）因素有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），說明足跖腫脹度有隨時間變化的趨勢，見圖1；時間因素與分組因素 (time*group)的交互作用有統(tǒng)計學意義 (P＜0.01)，說明時間因素的作用隨著分組的不同而不同，即不同給藥組的足腫脹度隨時間變化的趨勢不同，從各組的不同時間點足腫脹度變化趨勢圖可看出（圖1）；組別因素（group）有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，說明分組因素起了作用，各個不同給藥組的足腫脹度總體而言不同。從球形度檢驗結(jié)果得出各組數(shù)據(jù)間具有高度的相關(guān)性，故用多元方差分析進行兩兩比較，與同一時間點模型組相比，陽性藥組在2d后的各時間點均能顯著抑制大鼠足跖腫脹度，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.01)；白術(shù)醇提物各劑量組在各時間點與同時間點模型組相比均能抑制大鼠足跖腫脹度，差異有統(tǒng)計學意中可以看出，與空白組比較，模型組大鼠血清及其左足足跖組織液中的TNF-α均有顯著性增高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），說明炎性反應(yīng)明顯。與模型組比較，陽性藥組和白術(shù)醇提物各劑量組大鼠血清及足跖組織液中的TNF-α水平均有降低，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。這說明不同劑量白術(shù)醇提取物均能一定程度的降低AA大鼠血清和左足足跖炎性組織中的TNF-α水平，有較好的抗炎作用。

圖1 白術(shù)醇提物對AA大鼠左后足跖腫脹度的影響Fig.1 Effects of EAM on left hind paw edema in AA rats

2.3 對AA大鼠血清和左足足跖組織液中IL-1β的影響 白術(shù)醇提物對于AA大鼠血清及其炎性組織中義(P＜0.05)，并且在第8d后呈現(xiàn)一定的劑量關(guān)系，隨著劑量的增加，其抑制足跖腫脹作用越強。

而對于右后足的繼發(fā)性足跖腫脹則出現(xiàn)在致炎后第10d左右，模型組與空白組比較，在第12d達到了最高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，說明繼發(fā)性腫脹在致炎12d后成功。對右后足進行球形度檢驗，結(jié)果顯示P＜0.01，不滿足球形假設(shè)，需要通過Greenhouse-Geisser校正，校正后方差分析結(jié)果表明時間(time)因素、時間因素與分組因素(time*group)的交互作用、組別因素（group）均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。從球形度檢驗結(jié)果得出各組數(shù)據(jù)間具有高度的相關(guān)性，故用多元方差分析進行兩兩比較。與同一時間點模型組相比，陽性藥組在出現(xiàn)繼發(fā)性腫脹的第10d后的各時間點均能顯著抑制大鼠足跖腫脹度，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；白術(shù)醇提物各劑量組在各時間點與同時間點模型組相比均能抑制大鼠足跖腫脹度，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，并且在第14d后呈現(xiàn)一定量效關(guān)系。

圖2 白術(shù)醇提物對AA大鼠右后足跖腫脹度的影響Fig.2 Effects of EAM on right hind paw edema in AA rats

2.2 對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清和左足足跖組織液中TNF-α的影響 白術(shù)醇提物對于佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清及其炎性組織中的TNF-α的影響可見圖3。從圖的IL-1β的影響（圖4）。從圖中可以看出，與空白組比較，模型組大鼠血清和組織液中IL-1β明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），說明模型組大鼠炎性反應(yīng)明顯。與模型組比較，除白術(shù)醇提物低劑量組外，陽性藥組、白術(shù)醇提物高、中劑量組大鼠血清的IL-1β均有降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；而在足跖組織液中，陽性藥組和白術(shù)醇提物各劑量組均有降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。這說明不同劑量的白術(shù)醇提物均能顯著的抑制AA大鼠血清和炎性組織組織液中的IL-1β的升高，具有較好的抗炎作用。

圖3 白術(shù)醇提物對AA大鼠血清和左足足跖組織液TNF-α的影響Fig3.Effects of EAM on TNF-α of serum and left plantar tissue fluid in AA rats

圖4 白術(shù)醇提物對AA大鼠血清和左足足跖組織液IL-1β的影響Fig4.Effects of EAM on IL-1β of serum and left plantar tissue fluid in AA rats

2.4 對AA大鼠血清和左足足跖組織液中PGE2的影響 白術(shù)醇提物對于AA大鼠血清及其左足足跖組織液中的PGE2的影響（圖5）。從圖5中可以看出，與空白組比較，模型組大鼠血清和組織液中PGE2明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），說明模型組大鼠炎癥反應(yīng)明顯。與模型組比較，陽性藥組、白術(shù)醇提物高劑量組和中劑量組大鼠血清中的PGE2均有降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），白術(shù)醇提物低劑量組大鼠有所降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。對于大鼠炎性組織左足足跖組織液中的PGE2，陽性藥組與模型組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），白術(shù)各劑量組與模型組相比差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。這說明白術(shù)各劑量組均能降低AA大鼠血清和左足足跖組織液中的PGE2水平，作用效果呈現(xiàn)一定量效關(guān)系。

3 討論

類風濕關(guān)節(jié)炎是一種病因尚未明確的以滑膜慢性炎癥為主的自身免疫性疾病，以往的研究認為類風濕關(guān)節(jié)炎是以Ⅲ型超敏反應(yīng)為主，通過血清中的自身抗體即類風濕因子（rheumatoid factor，RF）與自身抗原結(jié)合形成的免疫復合物（immune complex，IC）在關(guān)節(jié)囊滑膜上沉積，從而引起滑膜增厚、充血、水腫、淋巴細胞和巨噬細胞浸潤[14]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，滑膜細胞、單核/巨噬細胞和淋巴細胞產(chǎn)生的大量細胞因子形成的網(wǎng)絡(luò)失衡在RA的發(fā)病和進展中發(fā)揮著重要的作用[15-16]，其中TNF-α、IL-1β、PGE2等在RA滑膜病變中起到重要的作用[17]，因此本文選擇TNF-α、IL-1β和PGE2作為炎性因子考察白術(shù)醇提物的抗炎作用。

圖5 白術(shù)醇提物對AA大鼠血清和左足足跖組織液PGE2的影響Fig5.Effects of EAM on of serum and plantar tissue fluid of left paw in AA rats

本研究結(jié)果顯示，不同劑量白術(shù)醇提物能抑制完全弗氏佐劑誘導的慢性足跖腫脹，并且隨著劑量的增加，其抑制作用隨之增加。此外，還能降低大鼠血清及足跖腫脹組織中TNF-α、IL-1β、PGE2的水平，從而顯示出良好的抗炎作用，揭示白術(shù)醇提物可能通過抑制TNF-α、IL-1β、PGE2的合成和釋放來發(fā)揮抗炎作用。雖然已有相關(guān)研究表明白術(shù)內(nèi)酯、多糖可能是其抗炎活性的物質(zhì)基礎(chǔ)[18]，還有研究發(fā)現(xiàn)白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對脂多糖誘導的TNF-α、NO產(chǎn)生的巨噬細胞具有抑制作用，能減少腫瘤細胞的壞死[19]，并且其抗炎作用可能是通過抑制MAPK和NF-κB的活化，從而抑制炎性因子和炎性介質(zhì)釋放，這也可能是白術(shù)具有抗炎的作用機制之一。但是由于白術(shù)所含的化學成分復雜，隨之也具有不同的藥理作用，本研究雖然已經(jīng)對初步通過AA大鼠模型中的細胞炎癥因子進行了檢測，但對于白術(shù)醇提物抗炎的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制有待進一步的研究和確證，如在RNA水平檢測炎癥因子以及從組織病理學水平觀察分析AA大鼠關(guān)節(jié)組織的炎癥相關(guān)蛋白表達等均是下步的研究內(nèi)容。

此外，在實驗過程中，發(fā)現(xiàn)白術(shù)醇提物即便是高濃度組都無法跟陽性藥阿司匹林相比，這可能是因為阿司匹林是高純度的單一化合物，而本研究的白術(shù)醇提物當中包含了許多的化學成分，只是一個經(jīng)過富集的中藥提取物。并且據(jù)文獻報道，阿司匹林具有一定的不良反應(yīng)如胃腸道反應(yīng)、過敏反應(yīng)、大劑量時容易引起肝腎損傷和心臟毒性[20-21]，本實驗中的白術(shù)醇提物據(jù)文獻報道并無上述不良反應(yīng)，副作用小，具有健脾益氣、調(diào)節(jié)腸胃功能的作用[2]，其中白術(shù)內(nèi)酯類物質(zhì)有抑制大鼠胃腸運動的作用，對Ach引起的回腸痙攣、子宮收縮及心臟抑制有顯著的拮抗作用，非競爭性的拮抗His的致大鼠回腸痙攣[2]。另外，白術(shù)還可以通過影響胃腸道AchE、SP陽性神經(jīng)的分布促進胃腸道運動[7]。因此，對需要長期服藥的類風濕關(guān)節(jié)炎病人，本研究具有一定意義。

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The Effect of Ethanol Extract of Atractylodes Macrocephala Koidz.on Paw Edoma and Iinflammaroty Cytokines in Rats with Adjuvant Arthritis

ZHAO Guizhi1,2,XU Pan1,2,PU Jinbao1,2,et al 1.Zhejiang Academy of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou(310007);2.Key Laboratory of Research and Development of Chinese Medicine of Zhejiang Province

[Objective]To investigate the impact on paw edema and inflammaroty cytokines of the adjuvant arthritis rats by ethanol extract of Atractylodes macrocephala Koidz.(EAM),and explore the possible mechanism.[Methods]SD rats induced by Freund`s complete adjuvant were randomly divided into 6 groups:normal group,model group,positive drug group and three EAM treated groups(respectively with high-,mid-and low-dosages).Paw edema was measured by thickness gauge,and TNF-α,IL-1β and PGE2of serum and swelling paw were detected by ELISA methods.[Result]Compared with normal group,the primary and secondary paw edema of adjuvant arthritis rats showed extremely significant differences,and the level of TNF-α,IL-1β and PGE2in the serum and swelling paw increased obviously.Compared with model group,EAM with different dosages could respectively decrease the primary and secondary paw edema degree and the level of inflammatory cytokines.[Conclusion]EAM had certain protection effects on adjuvant arthritis,which became stronger with the dosage of ethanol extracts going up.The inhibition of TNF-α,IL-1β and PGE2may be an important mechanism for these effects.

Atractylodes macrocephala Koidz;ethanol extract;adjuvant arthritis;paw edema;inflammatory cytokines;dosage dependant

R331

A文章編號：1005-5509（2017）01-0034-06

10.16466/j.issn1005-5509.2017.01.005

2016-07-29）

浙江省中藥新藥研發(fā)重點實驗室（2008F3036）；浙江省中醫(yī)藥科技計劃（2013ZA006）

Fund projects:Key Laboratory of Research and Development of Chinese Medicine of Zhejiang Province(2008F3036)；Projects of Zhejiang Provincial TCM Sci-tech Plan(2013ZA006)

魏克民，Email：wkmcyzy@163.com