DNA定量分析聯(lián)合液基細(xì)胞學(xué)檢測對(duì)惡性腹腔積液的診斷價(jià)值

黃柳炎劉崇梅毛敏鄒亞陽娟張雪純

·論著·

DNA定量分析聯(lián)合液基細(xì)胞學(xué)檢測對(duì)惡性腹腔積液的診斷價(jià)值

黃柳炎1劉崇梅2★毛敏2鄒亞2陽娟1張雪純1

目的探討DNA定量分析和液基細(xì)胞學(xué)檢測對(duì)惡性腹腔積液診斷的應(yīng)用價(jià)值。方法選取我院2013年8月至2015年8月間145名腹腔積液患者作DNA定量分析檢查（DNA image cytometer，DNA?ICM）和液基細(xì)胞學(xué)檢測（thinprep cytologic test，TCT），比較其二者間診斷的敏感性和特異性。應(yīng)用Logistic回歸模型，繪制ROC曲線并計(jì)算曲線下面積（area under curve，AUC）來評(píng)價(jià)各指標(biāo)的診斷價(jià)值。結(jié)果DNA?ICM檢測的陽性率明顯高于TCT檢測。TCT檢測和DNA?ICM檢測敏感性分別為84.21％（32/38）和94.74％（36/38），特異性分別為65％（13/20）和85％（17/20）。2種方法聯(lián)合診斷惡性腹腔積液的ROC曲線下面積AUC為0.94，高于2種單項(xiàng)檢測的AUC，分別為0.90、0.75。結(jié)論兩者相比較，DNA?ICM的敏感性和特異性明顯高于TCT檢測，而將2種方法相結(jié)合，可以很大地提高對(duì)惡性腹腔積液的診斷準(zhǔn)確性。

DNA定量分析；液基細(xì)胞學(xué)；腹腔積液

腹腔積液是臨床常見癥狀之一，能夠準(zhǔn)確的判斷腹腔積液的良惡性，對(duì)于疾病的診療有著重要的意義。液基細(xì)胞學(xué)檢測（thinprep cytologic test，TCT）是鑒別良惡性腹腔積液的重要方法，但惡性腹腔積液細(xì)胞學(xué)診斷的陽性率僅為40％左右［1］。相關(guān)研究報(bào)道細(xì)胞DNA定量分析（DNA image cytometer，DNA?ICM）檢測腹腔積液中腫瘤細(xì)胞敏感性為88.3％，特異性為100％，TCT檢測對(duì)惡性腹水診斷的敏感度為81.4％，特異性為90.4％［2?3］。本研究將對(duì)145例腹腔積液患者采用TCT檢測和DNA?ICM檢測，對(duì)腹水中的細(xì)胞核進(jìn)行DNA倍體定量分析，并對(duì)比兩者在惡性腹腔積液的診斷價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集岳陽市二人民醫(yī)院2013年8月至2015年8月間腹水樣本145例，其中男性65例，女性80例，年齡22～85歲，平均55歲，常規(guī)采用TCT檢測和DNA?ICM檢測。

1.2 儀器和試劑

LBP液基沉降式染色機(jī)及漿膜腔積液專用耗材（廣州安必平醫(yī)療科技有限公司），全自動(dòng)細(xì)胞DNA圖像定量分析系統(tǒng)、細(xì)胞保存液以及相關(guān)制片試劑（廈門麥克奧迪醫(yī)療診斷有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 TCT檢測方法

將腹腔積液標(biāo)本置于離心管中，加枸櫞酸鈉抗凝，以3 000 rpm/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清液，置混合器上震蕩30 s，往離心管中加入12 mL細(xì)胞保存液，靜置5 min，棄置上清液：用吸管吸取細(xì)胞清洗液至5 mL，將標(biāo)本混勻后，置漩渦混合器上震蕩30 s，涂4張片，95％乙醇固定10 min，2張常規(guī)蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin?eosin staining，HE）染色，封片，行細(xì)胞鏡檢，由我科2位資深病理醫(yī)師閱片，鏡下見炎性細(xì)胞判讀為陰性，鏡下見核異型細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞判讀為陽性。

1.3.2 DNA?ICM檢測方法

將剩余2張薄層細(xì)胞片進(jìn)行Feulgen染色，然后在全自動(dòng)細(xì)胞DNA圖像定量分析系統(tǒng)，進(jìn)行掃描處理，該系統(tǒng)由MoticBA6.0全自動(dòng)數(shù)碼顯微鏡、DELL370工作站、MoticamPro205C攝像頭及自動(dòng)顯微鏡控制盒等組成，系統(tǒng)對(duì)全片所有細(xì)胞核進(jìn)行掃描測定，標(biāo)本染色質(zhì)量控制采用標(biāo)準(zhǔn)片作對(duì)照。根據(jù)系統(tǒng)診斷軟件所做的細(xì)胞DNA倍體分析，結(jié)果和建議有如下3種情況：正常細(xì)胞的DNA指數(shù)（DNA Index，DI）為1，即為二倍體細(xì)胞（2C），無異倍體細(xì)胞和異常細(xì)胞峰。4C細(xì)胞數(shù)大于被檢測細(xì)胞總數(shù)的5％，但無異倍體細(xì)胞診斷為增生。有3個(gè)以上DI＞2.5的細(xì)胞或有異倍體細(xì)胞峰診斷為陽性［4?5］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以活檢病理組織診斷為標(biāo)準(zhǔn)，分別計(jì)算出TCT檢測和DNA?ICM檢測的敏感性和特異性。然后采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用Logistic回歸分析篩選變量并建立回歸方程，對(duì)新變量及單項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行ROC曲線分析。

2 結(jié)果

2.1 TCT檢測與DNA?ICM檢測對(duì)比

145例腹腔積液標(biāo)本中TCT檢測37例陽性，DNA?ICM檢測48例陽性，其中48例出現(xiàn)3個(gè)或3個(gè)以上DI≥2.5的異倍體細(xì)胞或異倍體細(xì)胞峰，12例出現(xiàn)1～2個(gè)DI≥2.5的異倍體細(xì)胞。TCT檢測查見癌或疑癌細(xì)胞37例患者標(biāo)本中，檢測有37例均出現(xiàn)DI≥2.5的異倍體細(xì)胞。TCT檢查見少數(shù)異型細(xì)胞的10例標(biāo)本中，DNA?ICM檢測有8例出DI≥2.5的異倍體細(xì)胞。2例TCT檢查為陽性而DNA?ICM檢測為陰性。93例良性腹水中，TCT檢測有8例出現(xiàn)假陽性，而DNA?ICM檢測全部陰性。2種檢查方法結(jié)果比較，DNA?ICM檢測的陽性檢出率明顯高于TCT檢測方法，見表1、圖1～3。

表1145 例良惡性腹腔積液DNA?ICM檢測與TCT檢測診斷結(jié)果（n）Table 1145 cases of benign and malignant ascites by DNA?ICM and TCT diagnosis（n）

圖1 惡性腹腔積液患者液基細(xì)胞學(xué)檢測陽性結(jié)果（HE，×200）Figure 1The positive results of TCT in patients with malig?nant peritoneal effusion（HE，×200）

圖2 良性腹腔積液患者細(xì)胞DNA倍體檢查Figure 2Benign peritoneal effusion in patients with cell DNA times physical examination

2.2 TCT和DNA?ICM檢測與組織病理學(xué)比較

58例患者獲得活檢組織病理診斷結(jié)果，其中為惡性腫瘤患者39例，14例為卵巢癌，18例為胃腸道惡性腫瘤，4例為肝癌，3例為其他腫瘤。良性患者為19例，TCT檢測、DNA?ICM檢測與組織病理診斷比較，TCT檢測和DNA?ICM檢測敏感性分別為84.21％（32/38）和94.74％（36/38），特異性分別為65％（13/20）和85％（17/20）結(jié)果見表2。二者兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.01）。與此同時(shí)，對(duì)TCT檢測、DNA?ICM檢測及2種方法聯(lián)合檢測用Logistic回歸生成的新變量（即預(yù)測概率）作ROC曲線分析，2種方法聯(lián)合診斷惡性腹腔積液的ROC曲線并計(jì)算曲線下面積（area under curve，AUC）為0.94，高于2種單項(xiàng)檢測的AUC，分別為0.90、0.75。即對(duì)惡性腹腔積液診斷能力評(píng)價(jià)ROC曲線下面積2種方法聯(lián)合＞DNA?ICM＞TCT，AUC越大，診斷能力則越強(qiáng)，見圖4。

圖3 惡性腹腔積液患者細(xì)胞DNA倍體檢查Figure 3Malignant peritoneal effusion in patients with DNA times physical examination

表2 TCT檢測、DNA?ICM與組織病理診斷比較Table 2Comparison of TCT，DNA?ICM and histopathology

3 討論

惡性腹腔積液是臨床的常見癥狀，對(duì)于它的診斷也一直是臨床面臨的難題，目前有很多的檢驗(yàn)方法及指標(biāo)判斷其良惡性，但各有利弊，如：脫落細(xì)胞學(xué)、腫瘤標(biāo)志物、微小RNA含量檢測、DNA?ICM檢測、流式細(xì)胞術(shù)等［6?8］。但臨床上我們常以細(xì)胞學(xué)檢測為主。由于受細(xì)胞變異、蛻變以及主觀因素的影響，臨床的診斷率不高。因此提高惡性腹腔積液檢測的敏感性和特異性一直是臨床上迫切解決的問題。惡性腹腔積液主要可分為2類：一類是中央性腹水，系靜脈或淋巴管堵塞所致，常多見于卵巢癌、肝癌等；一類是周圍性腹水，由散布于腹膜表面的腫瘤結(jié)節(jié)分泌某些介素，導(dǎo)致腹膜毛細(xì)血管通透性增加所致，是晚期腫瘤患者產(chǎn)生腹水的主要原因。在臨床上常規(guī)抽取腹水送細(xì)胞學(xué)檢查，往往由于腹水惡性腫瘤細(xì)胞量少等原因檢測陽性率不高，且由于間皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的干擾，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽性。

圖4 TCT檢測、DNA?ICM檢測及2種方法聯(lián)合檢測的ROC曲線分析Figure 4ROC curve analysis TCT，DNA?ICM and two kinds of methods combination for detection

TCT檢測是一項(xiàng)制片技術(shù)，它發(fā)展于20世紀(jì)90年代。最初用于宮頸細(xì)胞學(xué)檢查，隨著病理學(xué)的不斷發(fā)展，其在胸腹腔積液等非婦科領(lǐng)域也得到了運(yùn)用。它具有簡捷方便、快速經(jīng)濟(jì)、特異性高的特點(diǎn)，但是由于技術(shù)操作及涂片受主觀影響較大，使其存在敏感性低、假陰性率高的缺點(diǎn)。與傳統(tǒng)的普通制片方法相比較，TCT檢測改善了樣本的收集方法，除去了紅細(xì)胞、粘液及炎性滲出物，能使細(xì)胞均勻完整地分布在載玻片上，同時(shí)也保全了細(xì)胞的抗原生物特性，有利于腫瘤細(xì)胞的鑒別診斷。細(xì)胞DNA?ICM檢測是我國近幾年迅速發(fā)展起來的一項(xiàng)新型技術(shù)，在診斷細(xì)胞學(xué)良惡性方面它有著不可替代的優(yōu)越性，它是從細(xì)胞DNA的水平方面進(jìn)行分析，并以點(diǎn)陣分布圖和直方圖形式描繪細(xì)胞中非整倍體細(xì)胞的個(gè)數(shù)。

對(duì)于惡性腹腔積液的診斷率，國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道顯示，TCT檢查對(duì)惡性腹水診斷的敏感度為81.4％，特異性為90.4％，DNA?ICM檢測惡性腹腔積液敏感性為88.3％，特異性為100％［2?3］。本文也對(duì)此2種方法進(jìn)行比較分析，并加以單項(xiàng)檢測與聯(lián)合檢測作ROC曲線作對(duì)比分析。145例腹腔積液標(biāo)本中TCT檢測和DNA?ICM檢測敏感性分別為84.21％（32/38）和94.74％（36/38），特異性分別為65％（13/20）和85％（17/20）。對(duì)TCT檢測、DNA?ICM檢測及2種方法聯(lián)合檢測用Logistic回歸生成的新變量（即預(yù)測概率）作ROC曲線分析，對(duì)惡性腹腔積液診斷能力評(píng)價(jià)ROC曲線下面積2種方法聯(lián)合＞DNA?ICM＞TCT，ROC曲線下面積越大，診斷能力則越強(qiáng)。與相關(guān)研究對(duì)比，本文2種方法對(duì)惡性腹腔積液診斷的敏感性與特異性稍有降低，其一可能受病理醫(yī)師閱片主觀所影響，其二與制片的操作技術(shù)有關(guān)，其三對(duì)是否為惡性腹腔積液的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)。因此，由以上可得出DNA?ICM檢測的敏感性和特異性明顯高于TCT檢測。而將2種方法相結(jié)合，可以很大程度地降低惡性腹腔積液的誤診率和漏診率，即可很大地提高對(duì)惡性腹腔積液的診斷準(zhǔn)確性。同時(shí)研究顯示惡性腹腔積液中，TCT檢測陽性的37例標(biāo)本中，DNA?ICM檢測2例為陰性，可能因?yàn)镈NA?ICM只能對(duì)DNA倍體已經(jīng)發(fā)生改變的腫瘤細(xì)胞做出診斷，對(duì)DNA倍體未發(fā)生改變的二倍體腫瘤細(xì)胞檢測呈假陰性。這可能是由于細(xì)胞在發(fā)生癌變的過程中，細(xì)胞核DNA的含量和結(jié)構(gòu)的變化先于細(xì)胞形態(tài)的改變。本研究發(fā)現(xiàn)DNA?ICM檢測的敏感度、特異度高于TCT的敏感度、特異度，檢測效果優(yōu)于TCT檢測。DNA?ICM通過全自動(dòng)數(shù)碼顯微鏡進(jìn)行閱片，仔細(xì)掃描每一個(gè)視野，降低了漏檢的可能，提高了檢測的敏感度。通過圖像分析系統(tǒng)自主分析，測出每一個(gè)細(xì)胞DNA含量的具體數(shù)值，客觀準(zhǔn)確，提高了檢測的特異度和準(zhǔn)確度［6?7］。

由此可見，單純的依靠DNA?ICM檢測或TCT檢測的測定，很難對(duì)腹腔積液進(jìn)行精確診斷。將二者聯(lián)合起來檢測，能最大程度上提高惡性腹腔積液診斷的靈敏性及特異性，是目前值得推廣的診斷腹腔積液的方法。

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The diagnostic value of DNA image cytometer and thinprep cytologic test for malignant peritoneal effusion

HUANG Liuyan1，LIU Chongmei2★，MAO Min2，ZOU Ya2，YANG Juan1，ZHANG Xuechun1
（1.Graduate School of University of South China，Hengyang，Hunan，China，421001；2.Department of Pa?thology，Yueyang Second People’s Hospital，Yueyang，Hunan，China，414000）

ObjectiveTo study the application of DNA image cytometer(DNA?ICM)and thinprep cytologic test(TCT)for the diagnosis of malignant peritoneal effusion.MethodsWe collected the ascites of 145 patients in the second people's hospital of Yueyang from August 2013 to August 2015.All ascites sample were detected by DNA?ICM and TCT,their sensitivity and specificity were then compared.Utilizing applied logistic regression,receiver operating characteristic(ROC)curve was plotted and the area under ROC curve(AUC)was calculated to assess the diagnostic value of each index.ResultsThe positive detection rate of malignant cells in ascites by DNA?ICM was higher than by TCT,the difference between the two methods was significant(P＜0.05).The sensitivity of TCT diagnosis of malignant ascites was 84.21％, specificity was 65％(P＜0.05).The sensitivity of DNA?ICM diagnosis of malignant ascites was 94.74％, specificity was 85％(P＜0.05).The AUC of the combined examination of DNA?ICM and TCT for malignant peritoneal effusion was 0.94,higher than the AUC of DNA?ICM and TCT single index examinations,which was 0.90 and 0.75 respectively.ConclusionsCompared with thinprep cytologic test,DNA quantitative analysis has a higher sensitivity and specificity.We can greatly improve the accuracy of diagnosis of malignant ascites with a combination of the two methods.

DNA image cytometer；Thinprep cytologic test；Peritoneal effusion

湖南省科技廳科技資助項(xiàng)目（2014SK3144）；南華大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項(xiàng)目（2014×C×35）

1.南華大學(xué)研究生院，湖南，衡陽421001 2.岳陽市二人民醫(yī)院病理科,湖南，岳陽414000

★通訊作者：劉崇梅，E?mail：2279700843@qq.com